CN102227507A - 用于检测hiv整合酶变体的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于检测与整合酶相关的一种或多种HIV序列变体的低频率出现的方法的一个实施方案，其包括步骤：（a）生成来自HIV样品群体中的多个RNA分子的cDNA种类；（b）由cDNA种类扩增多个第一扩增子，其中每个第一扩增子用一对核酸引物进行扩增；（c）克隆扩增第一扩增子的扩增拷贝，以产生多个第二扩增子；（d）测定第二扩增子的核酸序列组成；（e）检测在第二扩增子的核酸序列组成中以5％或更少的频率出现的一种或多种序列变体；和（f）使检测出的序列变体与和HIV整合酶相关的变异关联。

Description

用于检测HIV整合酶变体的系统和方法
发明领域
本发明提供了用于检测和分析与HIV-1相关的序列变体的方法、试剂和系统，所述序列变体特别是在HIV进化枝B和进化枝C亚型中的那些。变体可以包括在平行的靶多核苷酸群体中的单核苷酸多态性（SNPs）、插入/缺失变体（被称为“indels”）和等位基因频率。本发明还涉及通过平行焦磷酸盐测序研究通过聚合酶链反应（PCR）复制的核酸的方法，用于鉴定已知和未知序列的突变和多态性。本发明涉及使用特异性设计为扩增HIV RNA或其互补DNA与特定HIV特征或功能相关的特定区域和/或一系列重叠区的核酸引物，所述区域例如与HIV将病毒DNA整合到细胞DNA内的能力相关的整合酶区域。此外，关于引物的靶位点具有低突变率，使得核酸能够在靶HIV核酸群体中一致扩增，所述靶HIV核酸群体被怀疑包含变体（也被称为准种），以生成个别扩增子。数千个个别HIV扩增子以大量平行、有效和节省成本的方式进行测序，以生成在扩增子群体中发现的序列变体分布，这使得能够进行超过先前采用方法的更大检测灵敏度。
背景技术
人免疫缺陷病毒（一般被称为HIV）依然是全世界的主要问题，尽管许多化合物已得到批准用于治疗。由于病毒逆转录酶的易错性质和高病毒周转（t½ = 1-3天），HIV基因组非常快速地突变。例如，逆转录酶估计平均生成一个突变/9.7 Kb基因组复制，这不显著影响病毒繁殖的能力。这导致其中许多不同突变体以动态关系存在的“准种”形成。
HIV病毒颗粒经由CD4受体和共受体分子进入细胞，其中在进入后，HIV整合酶执行将HIV原病毒整合到细胞机构内的功能，如由Lataillade和Kozal描述的（Lataillade，M.和Kozal，M.J.，The hunt for HIV-1 integrase inhibitors，AIDS Patient Care and STDs（2006）20:489，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。整合包括步骤（1）装配在整合酶蛋白质和在病毒基因组末端上的特异性DNA序列之间的稳定复合物；（2）病毒基因组的3'加工；（3）链转移；和（4）DNA缺口修复和连接。
HIV整合酶基因编码序列定位于Pol区的3'末端附近，在基因组中侧面为逆转录酶RNA酶和Vif －后者具有在整合酶的3'末端上开始的部分重叠读码框。整合酶蛋白质由288个氨基酸（32 kDa）编码，并且通过病毒蛋白酶从Pol多聚蛋白质中释放。它由3个结构域组成：包含锌指基序的N末端结构域、C末端结构域和两者之间的催化核心结构域。核心包含酶促功能必需的DDE基序（Freed，E.O.，HIV-1 replication，Somat. Cell and Mol. Genet.（2001）26:13，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。
在临床试验中显示功效后，FDA已批准了可从Merck & Co.获得的在商业上被称为Isentress（雷特格韦（Raltegravir））的整合酶抑制剂的使用（Grinsztejn等人，Protocol 005 Team. Safety and efficacy of the HIV-1 integrase inhibitor raltegravir（MK-0518）in treatment-experienced patients with multidrug-resistant virus：a phase II randomised controlled trial. Lancet（2007）369:1261；和Steigbigel等人，Raltegravir with optimized background therapy for resistant HIV-1 infection. N. Engl. J. Med.（2008）. 359:339，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。雷特格韦靶向病毒基因组整合中的第三个步骤――链转移，并且减少对这种药物的敏感性的几个突变已得到描述（Lataillade和Kozal，上文引入作为参考；Van Laethem等人， A genotypic assay for the amplification and sequencing of integrase from diverse HIV-1 group M subtypes. J. Virol. Methods（2008）153:176 ；和Paar等人，Genotypic antiretroviral resistance testing for human immunodeficiency virus type 1 integrase inhibitors on the TruGeneTM sequencing system，J. Clin. Microbiol. 2008 Dec；46（12）:4087-90. Epub 2008年10月22日，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。除雷特格韦外，众多整合酶抑制剂也在大型制药公司的流水线上（Lataillade和Kozal，上文引入作为参考）。以类似于用于蛋白酶和逆转录酶基因中的抗性连锁突变基因分型的方式，能够检测抗性连锁突变以便预测对HIV整合酶抑制剂的应答具有极大利益（Kuritzkes，D.R.等人，Performance characteristics of the TRUGENE HIV-1 genotyping kit and the Opengene DNA sequencing system，J. Clin. Microbiol.（2003）41:1594，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。
目前的HIV药物抗性测定一般作为群体测定执行（Kuritzkes，D.R.等人，Van Laethem等人，Paar等人，各自在上文引入作为参考），其就其性质而言，比基于每种病毒株的克隆分离的测定更不灵敏。然而，先前采用的克隆分析测定是极端劳动密集的，并且需要分开测试来自每个受试者的数千种细胞克隆，以便达到高灵敏度。
长读取长度454测序理想地适合于在单次测序运行中生成来自多个受试者的数千个克隆读数。因此，这些突变通过基于序列的HIV整合酶抑制剂抗性决定测定的有效检测——其中克隆序列直接得自病毒RNA准种而无需劳动密集的克隆步骤——是高度希望的并且使得来自早期检测的疾病了解和治疗可能性中的重要进展成为可能。进一步地，高流通量测序技术的实施方案使得可以被称为“大量平行（Massively Parallel）”处理的技术具有比先前测序技术实质上更有力的分析、灵敏度和流通量特征成为可能。例如，采用目前描述的本发明HIV特异性引物的高流通量测序技术能够达到检测低丰度等位基因的灵敏度，这包括在群体中1％或更少的等位基因变体频率。如上所述，这在检测HIV变体的背景中是重要的，特别是对于其中高灵敏度提供重要早期检测机制的整合酶变体，这导致重要治疗利益。
发明概述
本发明的实施方案涉及核酸序列的测定。更具体而言，本发明的实施方案涉及使用高流通量测序技术用于检测序列变体的方法和系统。
描述了用于检测与整合酶相关的一种或多种HIV序列变体的低频率出现的方法的一个实施方案，其包括步骤：（a）生成来自HIV样品群体中的多个RNA分子的cDNA种类；（b）由cDNA种类扩增多个第一扩增子，其中每个第一扩增子用一对核酸引物进行扩增；（c）克隆扩增第一扩增子的扩增拷贝，以产生多个第二扩增子；（d）测定第二扩增子的核酸序列组成；（e）检测在第二扩增子的核酸序列组成中以5％或更少的频率出现的一种或多种序列变体；和（f）使检测出的序列变体与和HIV整合酶相关的变异关联。
此外，描述了试剂盒的一个实施方案，所述试剂盒包括选自IN12F（SEQ ID No：1）和IN2R（SEQ ID No：3）；IN1F（SEQ ID No：2）和IN2R（SEQ ID No：3）；IN3F（SEQ ID No：4）和IN3R（SEQ ID No：5）；IN4F（SEQ ID No：6）和IN4R（SEQ ID No：7）；IN5F（SEQ ID No：8）和IN5R（SEQ ID No：9）；和IN6F（SEQ ID No：10）和IN6R（SEQ ID No：11）的一个或多个引物对。
上述实施方案和实现不一定彼此包括或排除，并且可以以不冲突和在其它方面可能的任何方式组合，无论它们是与相同还是不同实施方案或实现结合呈现。一个实施方案或实现的描述不意图就其它实施方案和/或实现而言是限制性的。此外，本说明书中其它地方描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术，在可替代实现中可以与概述中描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术组合。因此，上述实施方案和实现是举例说明性而不是限制性的。
附图说明
当与附图结合考虑时，上述和进一步特征根据下述详述将是更明确理解的。在附图中，相似参考数字指示相似结构、元件或方法步骤，并且参考数字最左边的阿拉伯数字指示参考元件首次出现于其中的图编号（例如，元件160首次出现于图1中）。然而，所有这些惯例意图是一般的或举例说明性的而不是限制性的。
图1是在计算机控制下的测序仪器和反应基底的一个实施方案的功能方框图；
图2是扩增子相对于HIV整合酶区域的位置关系的一个实施方案的简化图示例子；
图3是得自多种HIV RNA的序列数据针对关于HIV整合酶区域的节段的共有序列比较的一个实施方案的简化图示例子。图3中提供的序列从上到下如下：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15；和
图4是用于鉴定与HIV整合酶相关的变异的方法的一个实施方案的功能方框图。
发明详述
如下文将更详细地描述的，目前描述的本发明的实施方案包括用于设计靶特异性序列或对HIV变体特异的引物种类，并且使用这些引物用于序列变体的高灵敏度检测的系统和方法。
a. 一般概括
术语“流动图（flowgram）”一般指通过SBS法特别是基于焦磷酸盐的测序方法（也被称为“焦磷酸测序”）生成的序列数据的图解表示，并且可以更特别地被称为“程序”。
如本文使用的，术语“读数”或“序列读数”一般指得自单核酸模板分子或多个基本上等同的模板核酸分子拷贝群体的完整序列数据。
如本文使用的，术语“运行”或“测序运行”一般指在一种或多种模板核酸分子的测序操作中执行的一系列测序反应。
如本文使用的，术语“流动”一般指溶液对包括模板核酸分子的环境的系列或迭代添加循环，其中溶液可以包括用于加入新生分子中的核苷酸种类或其它试剂，例如可以在测序反应中采用的，或用于减少来自核苷酸种类的先前流动循环的滞后（carryover）或噪声效应的缓冲液或酶。
如本文使用的，术语“流动循环”一般指其中核苷酸种类在循环过程中流动一次的顺次系列流动（即，流动循环可以包括以T、A、C、G核苷酸种类次序的顺次添加，尽管其它序列组合也视为该定义的部分）。一般地，流动循环是在循环之间具有相同流动顺序的重复循环。
如本文使用的，术语“读取长度”一般指可以可靠测序的模板分子长度的上限。存在促成系统和/或过程的读取长度的众多因素，包括但不限于模板核酸分子中的GC含量程度。
如本文使用的，术语“测试片段”或“TF”一般指已知序列组成的核酸元件，其可以用于质量控制、校正或其它相关目的。
“新生分子”一般指通过掺入核苷酸种类通过模板依赖性DNA聚合酶延伸的DNA链，所述核苷酸种类与模板分子中的相应核苷酸种类互补。
术语“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”或“靶分子”一般指作为由其生成序列数据或信息的测序反应的对象的核酸分子。
如本文使用的，术语“核苷酸种类”一般指一般掺入新生核酸分子内的核酸单体的特性，所述核酸单体包括嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）和嘧啶（胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶）。
如本文使用的，术语“单体重复”或“同聚物”一般指包括相同核苷酸种类（即重复核苷酸种类）的2个或更多个序列位置。
如本文使用的，术语“同质延伸”一般指其中基本上等同的模板分子群体的每个成员在反应中同质地执行相同延伸步骤的延伸反应关系或时期。
如本文使用的，术语“完成效率”一般指在给定流动过程中适当延伸的新生分子百分比。
如本文使用的，术语“不完全延伸率”一般指未能适当延伸超过所有新生分子数目的新生分子数目比值。
如本文使用的，术语“基因组文库”或“鸟枪（shotgun）文库”一般指衍生自和/或代表生物或个体的整个基因组（即基因组的所有区域）的分子集合。
如本文使用的，术语“扩增子”一般指选择的扩增产物，例如由聚合酶链反应或连接酶链反应技术产生的那些。
如本文使用的，术语“变体”或“等位基因”一般指各自编码相似序列组成的多个种类之一，但彼此具有区别度。区别可以包括相关领域普通技术人员已知的任何类型的遗传变异，这包括但不限于单核苷酸多态性（SNPs）、插入或缺失（插入/缺失事件的组合也被称为“indels”）、重复序列（也被称为串联重复）数目中的差异和结构变异。
如本文使用的，术语“等位基因的频率”或“等位基因频率”一般指由特定变体组成的群体中所有变体的比例。
如本文使用的，术语“关键序列”或“关键元件”一般指包括已知序列组成的在已知定位（即，一般包括在连接的衔接头元件中）中与模板核酸分子相关的核酸序列元件（一般约4个序列位置即TGAC或核苷酸种类的其它组合），其采用作为用于由模板分子生成的序列数据的质量控制参考。如果序列数据在正确定位中包括与关键元件相关的已知序列组成，则序列数据通过质量控制。
如本文使用的，术语“关键通过（keypass）”或“关键通过孔”一般指在反应孔中具有已知序列组成的全长核酸测试序列（即，如上文提及的“测试片段”或“TF”）的测序，其中衍生自关键通过测试序列的序列准确度与已知序列组成比较，并且用于测量测序的准确度和用于质量控制。在一般实施方案中，测序运行中的总孔数的一部分将是关键通过孔，这在某些实施方案中可以是按区域分布的。
如本文使用的，术语“平头末端”与相关领域普通技术人员理解一致地解释，并且一般指具有以一对互补核苷酸碱基种类终止的末端的线性双链核酸分子，其中一对平头末端对于彼此连接总是相容的。
如本文使用的，术语“粘性末端”或“突出端”与相关领域普通技术人员理解一致地解释，并且一般指在分子的一条链的末端上具有一个或多个不成对核苷酸种类的线性双链核酸分子，其中不成对核苷酸种类可以存在于任一链上，并且包括单个碱基位置或多个碱基位置（有时也被称为“粘着末端”）。
如本文使用的，术语“珠”或“珠基底”一般指具有任何方便大小且由任何数目的已知材料制造的任何类型的珠，所述已知材料例如纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯等（如例如在Merrifield，Biochemistry 1964，3，1385-1390中描述的）、聚丙烯酰胺、乳胶凝胶、聚苯乙烯、右旋糖酐、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、硅胶、控制孔玻璃、金属、交联右旋糖酐（例如Sephadex™）琼脂糖凝胶（Sepharose™）、和本领域技术人员已知的其它固相珠载体。
下文一般描述了与样品制备和处理、序列数据生成、和序列数据分析相关的系统和方法的某些示例性实施方案，其中一些或所有顺应用于与目前描述的本发明的实施方案一起使用。特别地，描述了用于制备模板核酸分子、扩增模板分子、生成靶特异性扩增子和/或基因组文库的系统和方法，测序方法和实现，和计算机系统的示例性实施方案。
在一般实施方案中，衍生自实验或诊断样品的核酸分子必须由其原始形式制备且处理成顺应高流通量测序的模板分子。处理方法可以在应用之间不同，导致包括各种特征的模板分子。例如，在高流通量测序的某些实施方案中，优选生成具有下列序列或读取长度的模板分子，所述序列或读取长度是至少具体测序方法可以准确地产生关于其的序列数据的长度。在呈现的例子中，长度可以包括约25-30个碱基对、约50-100个碱基对、约200-300个碱基对、约350-500个碱基对、超过500个碱基对、或顺应具体测序应用的其它长度。在某些实施方案中，来自样品例如基因组样品的核酸使用本领域普通技术人员已知的许多方法进行断裂。在优选实施方案中，方法随机断裂（即不选择特定序列或区域）核酸，且可以包括被称为雾化或超声处理方法的方法。然而，应当理解可以采用其它断裂方法例如使用限制性核酸内切酶的消化，用于断裂目的。同样在呈现的例子中，某些处理方法可以采用本领域已知的大小选择方法，以选择性分离所需长度的核酸片段。
此外，在某些实施方案中优选使另外的功能元件与每个模板核酸分子结合。可以采用用于各种功能的元件，包括但不限于用于扩增和/或测序方法的引物序列，质量控制元件，编码例如与起源或患者样品的各种关系的独特标识符（也被称为多路标识符或“MID”），或其它功能元件。所述功能元件中的一些或所有可以组合到衔接头元件内，所述衔接头元件在特定处理步骤中与核苷酸序列偶联。例如，某些实施方案可以使引发序列元件或包括互补序列组成的区域与用于扩增和/或测序的引物序列结合。进一步地，相同元件可以用于可以被称为“链选择”和使核酸分子与固相基底固定的那种元件。在某些实施方案中，2组引发序列区域（下文被称为引发序列A和引发序列B）可以用于链选择，其中仅选择具有引发序列A的一个拷贝和引发序列B的一个拷贝的单链且包括所述单链作为制备样品。在可替代实施方案中，衔接头元件的设计特征消除了对链选择的需要。相同引发序列区域可以用于扩增和固定方法中，其中例如引发序列B可以固定在固体基底上，并且扩增产物由其延伸。
用于断裂、链选择以及功能元件和衔接头添加的样品处理的另外例子在下述中描述：于2004年1月28日提交，名称为“Method for preparing single-stranded DNA libraries”的美国专利申请序列号10/767,894；于2008年5月29日提交，名称为“System and Method for Identification of Individual Samples from a Multiplex Mixture”的美国专利申请序列号12/156,242；和于2009年2月23日提交，名称为“System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids for Production of Sequencable Libraries”的美国专利申请序列号12/380,139，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
描述了用于执行模板核酸分子扩增以生成基本上等同拷贝群体的系统和方法的各种例子。对于普通技术人员显而易见的是，当一个或多个核苷酸种类掺入与模板分子拷贝结合的每个新生分子内时，在SBS的某些实施方案中希望生成每个核酸元件的许多拷贝，以生成更强的信号。存在用于生成核酸分子拷贝的本领域已知的许多技术，例如使用被称为细菌载体、“滚环”扩增（在上文引入作为参考的美国专利号6,274,320和7,211,390中描述）和聚合酶链反应（PCR）法的方法的扩增，所述技术各自可应用于与目前描述的本发明一起使用。特别顺应高流通量应用的一种PCR技术包括被称为乳状液PCR法（也被称为emPCRTM法）的技术。
乳状液PCR法的一般实施方案包括制备2种不能混合物质的稳定乳状液，所述2种不能混合物质产生可以在其内发生反应的水滴。特别地，顺应在PCR法中使用的乳状液的水滴可以包括作为小滴悬浮或分散于另一种流体、例如疏水流体（也被称为连续相）内的第一种流体，例如基于水的流体（也被称为间断相），所述疏水流体一般包括一些类型的油。可以采用的油的例子包括但不限于，矿物油、基于硅酮的油或氟化油。
进一步地，某些乳状液实施方案可以采用作用于稳定乳状液的表面活性剂，其对于特异性处理方法例如PCR可以特别有用。表面活性剂的某些实施方案可以包括一种或多种硅酮或氟化表面活性剂。例如，可以采用一种或多种非离子型表面活性剂，其包括但不限于，失水山梨醇单油酸酯（也被称为SpanTM 80）、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯（也被称为TweenTM 80），或在某些优选实施方案中，聚二甲基硅氧烷共聚醇（也被称为Abil® EM90）、聚硅氧烷、多烷基聚醚共聚物、聚甘油酯、泊洛沙姆和PVP/十六烷共聚物（也被称为Unimer U-151），或在更优选的实施方案中，在环戊硅氧烷中的高分子量硅酮聚醚（可从Dow Corning获得的也被称为DC 5225C）。
乳状液的小滴也可以被称为区室、微胶囊、微型反应器、微环境或相关领域中通常使用的其它名称。依赖于乳状液组分或组合物的组成、其中包含的内容物、和采用的形成技术，水滴在大小方面可以变动。所述乳状液产生可以在其内执行化学反应例如PCR的微环境。例如，可以将模板核酸和执行所需PCR反应所需的所有试剂封装和化学隔离在乳状液的小滴中。另外的表面活性剂或其它稳定剂可以在某些实施方案中采用，以如上所述促进小滴的另外稳定性。PCR法一般的热循环操作可以使用小滴执行，以扩增封装的核酸模板，导致生成包括模板核酸的许多基本上等同拷贝的群体。在某些实施方案中，小滴内的群体可以被称为“克隆分离的”、“区室化的”、“隔离的”、“封装的”、或“局限的”群体。同样在呈现的例子中，所述小滴中的一些或所有可以进一步封装固体基底，例如用于附着模板和模板的扩增拷贝、与模板互补的扩增拷贝、或其组合的珠。进一步地，固体基底可以使得能够附着其它类型的核酸、试剂、标记或其它目的分子。
对于目前描述的本发明有用的乳状液的实施方案可以包括使得所述化学反应能够以大量平行方式执行的极高密度小滴或微胶囊。用于扩增的乳状液的另外例子及其用于测序应用的用途在美国专利申请序列号10/861,930；10/866,392（现在的美国专利号7,622,280）；10/767,899；11/045,678中描述，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
此外，对于目前描述的本发明可以采用生成用于测序的靶特异性扩增子的实施方案，其包括使用特异性核酸引物组以扩增来自包括靶核酸的样品的一个或多个选择靶区域。进一步地，样品可以包括已知或怀疑包含序列变体的核酸分子群体，并且引物可以用于扩增且提供样品中的序列变体分布的了解。例如，可以执行通过特异性扩增和测序核酸样品中的多重等位基因而鉴定序列变体的方法。首先对核酸实施通过一对PCR引物的扩增，所述PCR引物设计为扩增目的区域周围的区域或核酸群体共同的节段。PCR反应产物（第一扩增子）各自随后在分开的反应容器例如上文描述的基于乳状液的容器中进一步个别扩增。测序所得到的扩增子（在本文中被称为第二扩增子），其各自衍生自第一个扩增子群体的一个成员，并且来自不同乳状液PCR扩增子（即第二扩增子）的序列集合用于测定等位基因频率。
所述靶特异性扩增和测序方法的一些优点包括比先前达到的更高水平的灵敏度。进一步地，采用高流通量测序使用仪器的实施方案，如例如采用由454 Life Sciences Corporation提供的被称为PicoTiterPlate®阵列（有时也被称为PTPTM板或阵列）孔的仪器的实施方案，所述方法可以用于生成关于超过100,000、超过300,000、超过500,000、或超过1,000,000个核酸区域/运行或实验的序列组成，并且可以至少部分依赖于用户优先选择，例如通过使用垫圈等成为可能的泳道配置。此外，所述方法提供了低丰度等位基因的检测灵敏性，这可以代表1％或更少的等位基因变体。该方法的另一个优点包括生成包括分析区域序列的数据。重要的是，无需具有待分析基因座的序列的先前了解。
用于测序的靶特异性扩增子的另外例子在下述中描述：于2005年4月12日提交、名称为“Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing”的美国专利申请序列号11/104,781；于2008年3月14日提交、名称为“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”的PCT专利申请序列号US 2008/003424；和于2009年6月17日提交、名称为“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”的美国专利申请序列号12/456,528，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
进一步地，测序实施方案可以包括Sanger型技术、一般被称为杂交测序（SBH）的技术、连接测序（SBL）、或掺入测序（SBI）的技术。进一步地，测序技术可以包括被称为polony测序技术；纳米孔、波导管和其它单分子检测技术；或可逆终止子技术的技术。如上所述，优选技术可以包括合成法测序。例如，某些SBS实施方案对基本上等同的核酸模板拷贝的群体测序且一般采用一种或多种寡核苷酸引物，其设计为对样品模板分子或与模板分子附着的一个或多个衔接头的预定、互补位置退火。在核酸聚合酶的存在下，引物/模板复合物与核苷酸种类一起存在。如果核苷酸种类与对应于样品模板分子上的序列位置的核酸种类互补，所述序列位置与寡核苷酸引物的3'末端直接相邻，那么聚合酶将用核苷酸种类延伸引物。可替代地，在某些实施方案中，引物/模板复合物与多个目的核苷酸种类（一般为A、G、C和T）同时存在，并且掺入在样品模板分子上的相应序列位置互补的核苷酸种类，所述相应序列位置与寡核苷酸引物的3'末端直接相邻。在所述实施方案的任一中，核苷酸种类可以在化学上封闭（例如在3’-O位置上），以阻止进一步延伸，并且需要在下一轮合成前解封闭。还应当理解给新生分子末端添加核苷酸种类的过程与上文描述的用于给引物末端添加的过程基本上相同。
如上所述，核苷酸种类的掺入可以通过本领域已知的各种方法进行检测，例如通过检测焦磷酸盐（PPi）的释放（例子在美国专利号6,210,891；6,258,568；和6,828,100中描述，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考），或经由与核苷酸结合的可检测标记。可检测标记的某些例子包括但不限于质量标记和荧光或化学发光标记。在一般实施方案中，例如通过洗涤去除未掺入的核苷酸。进一步地，在某些实施方案中，可以对未掺入的核苷酸实施酶促降解，如例如使用腺苷三磷酸双磷酸酶或焦磷酸酶的降解，如于2008年6月27日提交、名称为“System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing”的美国专利申请序列号12/215,455；和于2009年1月29日提交、名称为“System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing”的12/322,284中所述；其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
在其中使用可检测标记的实施方案中，它们在随后合成循环前一般必须被灭活（例如通过化学切割或光漂白）。如上所述，随后可以用另一个核苷酸种类或多个目的核苷酸种类查询模板/聚合酶复合物中的下一个序列位置。核苷酸添加、延伸、信号采集和洗涤的重复循环导致模板链的核苷酸序列的测定。作为本实例的继续，大量基本上等同的模板分子或基本上等同的模板分子群体（例如103、104、105、106或107个分子）一般在任何一个测序反应中同时进行分析，以便达到对于可靠检测足够强的信号。
此外，在某些实施方案中，通过采用可以被称为“配对末端”测序策略的策略来改善测序过程的读取长度容量和数量，可以是有利的。例如，测序方法的某些实施方案对可以由其生成高质量和可靠读数的分子总长度具有限制。换言之，可靠读取长度的序列位置总数目可以不超过25、50、100或500个碱基，这依赖于所采用的测序实施方案。通过分开测序分子的每个末端（有时被称为“标记”末端），所述分子包括通过接头序列在中心连接的每个末端上的原始模板核酸分子的片段，配对末端测序策略延长可靠读取长度。模板片段的原始位置关系是已知的，并且因此来自序列读数的数据可以重组为具有更长的高质量读取长度的单个读数。配对末端测序实施方案的进一步例子在名称为“Paired end sequencing”的美国专利号7,601,499；和于2009年1月28日提交、名称为“Paired end sequencing”的美国专利申请序列号12/322,119中描述，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
SBS器械的某些例子可以实现上文描述的一些或所有方法，并且可以包括一种或多种检测装置，例如电荷耦合装置（即CCD照相机）或共焦型构造、微流体室或流动池、反应基底和/或泵和流动阀。考虑基于焦磷酸盐测序的例子，器械的实施方案可以采用化学发光检测策略，其产生固有低水平的本底噪声。
在某些实施方案中，用于测序的反应基底可以包括由纤维光学面板形成的、如上所述可从454 Life Sciences Corporation获得的被称为PTPTM阵列的基底，所述纤维光学面板进行酸蚀刻，以获得成百上千或更多个极小的孔，各自使得能够容纳基本上等同的模板分子群体（即某些优选实施方案包括在70 x 75mm PTPTM阵列上以35 μm孔与孔间距的约3.3百万个孔）。在某些实施方案中，基本上等同的模板分子的每个群体可以排列在固体基底例如珠上，其各自可以排列在所述孔之一中。例如，器械可以包括试剂递送元件用于给PTP板夹提供流动试剂，以及使得能够收集由PTP板上的每个孔发出的光的光子的CCD型检测装置。包括用于改善的信号识别特征的反应基底的例子在于2005年8月30日提交、名称为“THIN-FILM COATED MICROWELL ARRAYS AND METHODS OF MAKING SAME”的美国专利申请序列号11/215,458中描述，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考。用于执行SBS型测序和焦磷酸盐测序的器械和方法的进一步例子在美国专利号7,323,305和美国专利申请序列号11/195,254中描述，其均在上文引入作为参考。
此外，可以采用使一个或多个样品制备过程自动化的系统和方法，例如上文描述的emPCRTM过程。例如，自动化系统可以用于提供有效溶液用于生成乳状液用于emPCR处理，执行PCR热循环操作，且富集成功制备的核酸分子群体用于测序。自动化样品制备系统的例子在于2005年1月28日提交、名称为“Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion”的美国专利申请序列号11/045,678中描述，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
此外，目前描述的本发明实施方案的系统和方法可以包括某些设计、分析或其它操作的实现，其使用贮存用于在计算机系统上执行的计算机可读介质。例如，下文详细描述了几个实施方案，以处理检测到的信号和/或分析使用SBS系统和方法生成的数据，其中处理和分析实施方案可在计算机系统上实现。
用于与目前描述的本发明一起使用的计算机系统的示例性实施方案可以包括任何类型的计算机平台，例如工作站、个人计算机、服务器或任何其它目前或未来的计算机。然而，本领域普通技术人员应当理解，如本文描述的前述计算机平台特别配置为执行本发明的专门操作，并且不考虑一般目的计算机。计算机一般包括已知组件，例如处理器、操作系统、系统存储器、记忆储存装置、输入-输出控制器、输入-输出装置和显示装置。相关领域普通技术人员还应当理解，存在许多可能的计算机配置和组件，并且还可以包括高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其它装置。
显示装置可以包括提供视觉信息的显示装置，这种信息一般可以在逻辑和/或物理上组构为像素阵列。还可以包括界面控制器，其可以包括用于提供输入和输出界面的各种已知或未来软件程序中的任一种。例如，界面可以包括一般被称为“图形用户界面”（通常被称为GUI’s）的界面，其给用户提供一种或多种图解表示。界面一般使得能够使用相关领域普通技术人员已知的选择或输入方式来接受用户输入。
在相同或可替代实施方案中，在计算机上的应用程序可以采用包括被称为“命令行接口”（通常被称为CLI’s）的那种界面。CLI’s一般在应用程序和用户之间提供基于文本的界面。一般地，命令行接口通过显示装置呈现作为文本行的输出且接受输入。例如，某些实现可以包括被称为“外壳程序”的那种，例如相关领域普通技术人员已知的Unix Shells、或采用面向对象型程序体系结构例如Microsoft .NET框架的Microsoft Windows Powershell。
相关领域普通技术人员应当理解，界面可以包括一种或多种GUI’s、CLI’s或其组合。
处理器可以包括商购可得的处理器，例如由Intel Corporation制造的Centrino®、CoreTM 2、Itanium®或Pentium®处理器，由Sun Microsystems制造的SPARC®处理器，由AMD公司制造的AthalonTM或OpteronTM处理器，或它可以是可获得或将变得可获得的其它处理器之一。处理器的某些实施方案可以包括被称为多核处理器和/或使得能够在单或多核配置中采用平行处理技术的那种。例如，多核体系结构一般包括2个或更多个处理器“执行核”。在呈现的例子中，每个执行核可以作为独立处理器执行，这使得多线程平行执行成为可能。此外，相关普通技术人员应当理解，处理器可以配置为一般被称为32或64位体系结构的那种，或目前已知的其它体系结构配置或可以在未来开发的那种。
处理器一般执行操作系统，这可以是例如来自Microsoft Corporation的Windows®型操作系统（例如Windows® XP或Windows Vista®）；来自Apple Computer Corp.的Mac OS X操作系统（例如Mac OS X v10.5 “Leopard”或“Snow Leopard”操作系统）；可从许多厂商获得的Unix®或Linux型操作系统或被称为开放源的那种；另一种或未来的操作系统；或其某些组合。操作系统以众所周知的方式与固件和硬件对接，并且促进处理器协调和执行各种计算机程序的功能，所述计算机程序可以以各种编程语言书写。一般与处理器协作的操作系统协调且执行计算机的其它组件的功能。操作系统还提供调度、输入-输出控制、归档和数据管理、存储管理、以及通信控制和相关服务，全部依照已知技术。
系统存储器可以包括各种已知或未来记忆储存装置中的任一种。例子包括任何通常可获得的随机存取存储器（RAM）、磁性介质例如驻留硬盘或磁带、光学介质例如读写光盘、或其它记忆储存装置。记忆储存装置可以包括各种已知或未来装置中的任一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器、USB或闪存驱动器、或软盘驱动器。此种类型的记忆储存装置一般从程序储存介质（未显示）中读取和/或向程序储存介质写入，所述程序储存介质例如分别地光盘、磁带、可移动硬盘、USB或闪存驱动器或软盘。这些程序储存介质中的任一种或目前在使用中的其它介质或可能以后开发的介质，可以视为计算机程序产物。如应当理解的，这些程序储存介质一般储存计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序也称为计算机控制逻辑，一般储存于与记忆储存装置结合使用的系统存储器和/或程序储存装置中。
在某些实施方案中，描述了计算机程序产物，其包括具有储存于其中的控制逻辑（计算机软件程序，包括程序编码）的计算机可用介质。控制逻辑当由处理器执行时，促使处理器执行本文描述的功能。在其它实施方案中，某些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实现。为了执行本文描述的功能的硬件状态机实现对于相关领域技术人员将是显而易见的。
输入-输出控制器可以包括用于接受且处理来自用户的信息的各种已知装置中的任一种，所述用户无论是人还是机器，无论是本地还是远程的。此类装置包括例如调制解调卡、无线卡、网络接口卡、声卡或用于各种已知输入装置中的任一种的其它类型控制器。输出控制器可以包括用于各种已知显示装置中的任一种的控制器，用于给用户呈递信息，所述用户无论是人还是机器，无论是本地还是远程的。在目前描述的实施方案中。计算机的功能元件经由系统总线彼此通信。计算机的某些实施方案可以使用网络或其它类型的远程通信与某些功能元件通信。
如对于相关领域技术人员将是显而易见的，如果在软件中实现，那么仪器控制和/或数据处理应用程序可以装载到系统存储器和/或记忆储存装置内且由其执行。所有或部分仪器控制和/或数据处理应用程序还可以位于只读存储器或记忆储存装置的相似装置中，此类装置不需要仪器控制和/或数据处理应用程序首先通过输入-输出控制器装载。相关领域技术人员应当理解，仪器控制和/或数据处理应用程序或其部分可以通过处理器以已知方式装载到系统存储器、或高速缓冲存储器或两者中，如对于执行有利的。
此外，计算机可以包括一个或多个库文件、实验数据文件、和储存于系统存储器中的互联网客户程序。例如，实验数据可以包括与一个或多个实验或测定相关的数据，例如检测到的信号值、或与一个或多个SBS实验或过程相关的其它值。另外，因特网客户程序可以包括使得能够使用网络访问在另一个计算机上的远程服务的应用程序，并且可以例如包括一般被称为“网络浏览器”的那种。在呈现的例子中，某些通常采用的网络浏览器包括可从Microsoft Corporation获得的Microsoft® Internet Explorer 7、可从Mozilla Corporation获得的Mozilla Firefox® 2、可从Apple Computer Corp.获得的Safari 1.2、可从GoogleTM Corporation获得的Google Chrome、和本领域目前已知或未来待开发的其它类型网络浏览器。此外，在相同或其它实施方案中，因特网客户程序可以包括或可以是使得能够经由网络访问远程信息的专门软件应用程序的元件，例如用于生物学应用的数据处理应用程序。
网络可以包括本领域普通技术人员众所周知的许多各种类型网络中的一种或多种。例如，网络可以包括采用通常被称为TCP/IP协议套以通信的局域网或广域网。网络可以包括包含互联计算机网络的全世界系统的网络，其通常被称为因特网，或还可以包括各种内联网体系结构。相关领域普通技术人员还应当理解，网络环境中的一些用户可以优先采用一般被称为“防火墙”（有时也被称为数据包过滤（Packet Filters）或边界保护装置（Border Protection Devices））的那种，以控制去往和来自硬件和/或软件系统的信息流量。例如，防火墙可以包括硬件或软件元件或其某些组合，并且一般设计为实施由用户例如网络管理员等放置在合适位置的安全策略。
b. 目前描述的本发明的实施方案
如上所述，本发明的实施方案涉及检测来自样品的HIV整合酶序列变体的方法，和通过使变体序列组成与整合酶药物抗性和/或敏感性类型相关，检测抗性和/或敏感性与目前的靶向HIV整合酶功能的药物关联的方法。普通技术人员应当理解，关联可以包括检测到的变体与已知和药物抗性和/或敏感性相关的变异的诊断关联，以及检测到的变体与样品的药物抗性和/或敏感性表型的发现关联。靶向可替代HIV区域例如逆转录酶区域和用于决定向性类型的区域的其它发明，在于2008年3月14日提交、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR DETECTION OF HIV DRUG RESISTANT VARIANTS”的PCT专利申请序列号US 2008/003424中；和于2009年6月17日提交、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR DETECTION OF HIV TROPISM VARIANTS”的美国专利申请序列号12/456,528中描述，其各自在上文引入作为参考。
本发明的实施方案包括靶向已知与药物抗性和/或敏感性类型相关的HIV整合酶区域的两阶段PCR技术（即，如上所述产生第一和第二扩增子），加上平行产生来自数千个病毒颗粒的序列信息的测序技术，这使得能够鉴定HIV整合酶类型的出现（基于整合酶类型与样品中检测到的变体序列组成的相关），甚至在样品中以低频率出现的那些类型。事实上，本发明的实施方案可以检测到包含以非计量等位基因量的HIV病毒颗粒的样品中存在的整合酶序列变体，如例如以大于50％、小于50％、小于25％、小于10％、小于5％或小于1％存在的HIV整合酶变体。所述实施方案使得以快速、可靠和节省成本方式的此类鉴定成为可能。
一般地，可以采用使一个或多个过程步骤自动化的一种或多种仪器元件。例如，测序方法的实施方案可以使用使一些或所有过程步骤自动化且执行的仪器执行。图1提供了测序仪器100的举例说明性例子，其包括光学子系统和流体子系统，用于测序反应的执行和在反应基底105上发生的数据截获。用于执行测序过程的测序仪器100的实施方案可以包括流体子系统中的各种流体组分、光学系统中的各种光学组件、以及在图1中未举例说明的另外组件，其可以包括微处理器和/或用于某些功能的局部控制的微控制器组件。在某些实施方案中，可以任选制备样品用于以自动化或部分自动化的形式测序，其使用配置为执行关于使用仪器100测序的一些或所有必需准备的样品制备仪器180。进一步地，如图1中举例说明的，测序仪器100可以与一种或多种外部计算机组件可操作地连接，所述外部计算机组件例如可以例如执行系统软件或固件例如应用程序135的计算机130，所述应用程序135可以提供一种或多种仪器例如测序仪器100或样品制备仪器180的指导控制，和/或某些数据分析功能。计算机130可以另外经由网络150与其它计算机或服务器可操作地连接，所述网络150可以使得能够远程操作仪器系统和将大量数据输出至能够储存和处理的系统。在呈现的例子中，测序仪器100和/或计算机130可以包括上文一般描述的实施方案的一些或所有组件和特征。
在本发明的一个方面，根据超过1,300种已知HIV-1 pol序列的比对设计靶特异性引物，其设计为以极端低偏差方式生成扩增子用于直接在所述测序应用中使用。已知HIV序列的比对可以使用相关领域普通技术人员已知的方法执行。例如，众多序列比对方法、算法和应用程序是本领域可获得的，包括但不限于Smith-Waterman算法（Smith，T.F.，Waterman，M.S.（1981）. Identification of Common Molecular Subsequences，J. Mol. Biol. 147：195-197，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）、BLAST算法（Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W. & Lipman，D.J.（1990）Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）、和Clustal（Thompson，J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F.，Jeanmougin，F.，Higgins，D.G.（1997）. The ClustalX windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876-4882，其为了所有目的在此整体引入本文作为参考）。序列成为单个序列的比对提供了HIV序列群体的最频繁序列组成的共有区。此外在呈现的例子中，软件应用程序可以划分用于整合酶分型的目的区域，以及用于针对比对的共有序列的引物序列的靶区域。目的区域包括已知对突变敏感的区域，并且可以促成整合酶抑制剂的病毒抗性。随后可以设计针对共有序列区域的引物组，所述共有序列区域比已知突变易感性的区域更保守（即更不可能突变）。此外，引物设计包括另外的考虑，例如就用于测定扩增产物序列组成的测序技术的读取长度容量而言，所得到的扩增产物的长度。本文公开的引物组针对共有序列区域进行设计，所述共有序列区域比已知突变易感性的区域更保守（即更不可能突变）。具有低突变率的靶序列区域用于引物设计的优点包括可靠地使用设计引物而没有会使得引物无法结合的靶区域上的变异所引起的失败的实质危险的能力，以及使用相同引物组用于多个进化枝的可能性。此外，本领域普通技术人员理解，在可以被视为共有序列的“保守”区内的特定位置在其组成方面仍可以是可变的且被视为“简并”位置。在某些优选实施方案中，用于引物设计的参数包括在引物组成中的位置上插入简并碱基——在其中在用于测定共有序列的多重序列比对中在那个位置上存在小于98％频率的核苷酸种类的情况下。此外，影响结合靶区域的选择和引物组成的其它参数包括使简并位置限制于仅具有2个可替代核苷酸种类的那些，以及使引物组成限制于不超过2个简并位置，以减少在扩增反应中形成引物二聚体的危险。在某些实施方案中，还希望使简并位置限制于引物组成的最后5个序列位置（即，在正向引物的3'末端和反向引物的5'末端上），因为具有最后5个位置高度保守对于结合效率是有利的。例如，简并序列位置一般具有多个可能不同的核苷酸种类，其作为在那个位置上的可替代序列组成出现。简并碱基是本领域众所周知的，并且各自类型的简并性由IUPAC符号表示，其表明与类型相关的可替代核苷酸组成。例如，IUPAC符号R表示嘌呤碱基（即A和G）是可替代的可能物。
所述本发明的实施方案包括设计为产生顺应高流通量测序的扩增子的下述引物种类：
IN12F 5’ CTATTTTTAGATGGAATAGANAARGC 3’ （SEQ ID NO：1）
IN1F 5’ GTACCAGCACACAAAGGRATTGG 3’ （SEQ ID NO：2）
IN2R 5’ TTGATCCCTGCCCACCARCA 3’ （SEQ ID NO：3）
IN3F 5’ GGAAAAATTATCCTRGTAGCAGT 3’ （SEQ ID NO：4）
IN3R 5’ CCTGCACTGTAYCCCCCAAT 3’ （SEQ ID NO：5）
IN4F 5’ GTAAAAACAATACATACAGAYAATGG 3’ （SEQ ID NO：6）
IN4R 5’ CTGTCCCTGTAATAAACCCGAA 3’ （SEQ ID NO：7）
IN5F 5’ GACAGCAGTACAAATGGCAGT 3’ （SEQ ID NO：8）
IN5R 5’ GTGTTTTACTAAACTDTTCCATG 3’ （SEQ ID NO：9）
IN6F 5’ GAATAATAGACATAATAGCAWCAGA 3’ （SEQ ID NO：10）
IN6R 5’ TGTTCTAATCCTCATCCTGTC 3’ （SEQ ID NO：11）。
本领域普通技术人员应当理解，存在对于引物组的序列组成的某些变异性，并且与所公开的引物序列90％或更大的同源性视为在目前描述的本发明的范围内。例如，关于引物组的靶区域可以轻微转移，并且因此预期在引物序列组成中的某些差异。此外，可以进行对共有序列的改进，或可以开发在特定位置上的新序列简并性，导致在靶区域中序列组成的轻微差异，并且类似地预期在引物序列组成中的某些变异。
图2提供了由上文举例说明的引物生成的扩增子205和扩增子215的举例说明性例子。在图2中，扩增子210、220、230、240、250和260以跨越整合酶区域205的交错关系排列，然而，应当理解图2中举例说明的扩增子的确切关系提供用于示例性目的不应视为限制性的。还应当理解不同扩增子产物可以使用本文公开的引物序列的不同组合产生，导致具有与图2中举例说明的那些不同的长度和覆盖的扩增子。
在本发明的某些实施方案中，产生具有整合酶区域的重叠覆盖的扩增子产物是有利的，这提供可以赋予质量控制中的实质利益的“双重覆盖”，以及扩增子产物之一未能适当扩增或遭受某些其它类型的实验假象的事件中的冗余。在一般实施方案中，每个扩增子在分开反应中生成，其使用用于所需扩增子的相关引物组合。进一步地，在某些实施方案中，扩增子长于可以通过扩增技术例如PCR可靠地产生（即具有低扩增误差率等）的长度，并且因此每个扩增子可以是使用相同引物组合的2个扩增产物的结果。例如，如图2中举例说明的，扩增子210可以是产物205和207的组合；220可以是产物215和217的组合；230可以是产物225和227的组合；240可以是产物235和237的组合；250可以是产物245和247的组合；并且260可以是产物255和257的组合。在呈现的例子中，产物一般将具有重叠的测量，这再次提供扩增子产物的装配和质量控制。下表1提供了扩增子、扩增子长度和用于其生成的引物的关系的例子。
表 1
扩增子 引物组
扩增子250（448bp） IN12F + IN2R
扩增子230（520bp） IN1F + IN2R
扩增子210（421bp） IN3F + IN3R
扩增子240（400bp） IN4F + IN4R
扩增子220（412bp） IN5F + IN5R
扩增子260（314bp） IN6F + IN6R
在某些实施方案中，衔接头元件在处理过程中与扩增子的末端连接，所述处理包括用于来自个别扩增子的第二轮扩增的另一种共用引物，产生克隆拷贝群体（即生成第二扩增子）。应当理解衔接头还可以包括如本说明书中其它地方描述的其它元件，例如质量控制元件、其它引物例如测序引物和/或扩增引物（或使得能够充当扩增和测序引物的单个引物）、独特标识符元件（即如上所述的MID元件）等等。此外，在某些实施方案中，上文描述的靶特异性引物可以与后续过程步骤中可使用的一种或多种其它元件组合。例如，单链核酸分子可以包括在一个末端上具有相邻的另外序列元件的靶特异性引物序列。与靶区域杂交的靶特异性引物可以具有退缩的其它元件，这是由于其序列组成与紧靠靶区域的侧翼序列的非互补性质，其中扩增产物包括目的区域的拷贝、以及另外的序列元件。
在本发明的实施方案中，使用靶特异性引物由HIV RNA生成第一链cDNA。在一个实施方案中，使用缺乏上文描述的测序衔接头（也被称为“SAD”）的单个引物例如IN5R引物，可以生成第一链cDNA。随后，使用靶特异性引物/处理元件策略产生6个“第一”扩增子。所得到的扩增子因此包括必需处理元件，这是由于其与引物的结合。
此外在优选实施方案中，使用上文描述的基于乳状液的PCR扩增策略发生第二轮扩增，这一般导致在珠基底上的“第二”扩增子的固定克隆群体，所述珠基底有效隔离第二扩增子，阻止当乳状液被破坏时的扩散。一般地，随后如本说明书中其它地方所述的平行测序数千个第二扩增子。例如，具有第二扩增子的固定群体的珠可以装载到反应基底105上，且使用测序仪器100进行处理，这生成来自每种样品的>1000个克隆读数，并且将序列数据输出到计算机130用于处理。计算机130执行专门软件（例如应用程序135），以鉴定来自样品的1％丰度或更低的变体。
图3提供了应用程序135的输出的举例说明性例子，所述应用程序135包括界面300且包括多个面板，以给用户101提供与多个序列305比对的共有序列303的视觉表示，所述多个序列305各自代表来自个别HIV RNA分子的单个读数。界面300还鉴定基础调用（base call）310，其在序列组成中不同于共有序列303，其中此类鉴定可以包括不同颜色、粗体、斜体或相关领域已知的其它视觉表示方式的突出显示基础调用310。界面300还给用户101提供样品中检测到的变异320水平的视觉表示——通过参考序列303中的碱基位置，以及在那些碱基位置上序列读数数目330的表示。在图3的例子中，通过检查克隆读数容易地确定在样品中以1％或更少的频率出现的变体。在所示例子中，由临床样品生成具有全部或部分整合酶覆盖的3-15,000个读数（正向或反向测序方向）。
序列数据还可以通过软件应用程序的相同或不同实施方案进一步分析，以使来自每个读数的序列信息与和整合酶类型相关的已知单元型相关，其中来自个别读数的序列数据可以包括或不包括来自共有序列的变异。如本文使用的，术语“单元型”一般指与核酸序列相关的等位基因的组合，这在HIV的情况下包括HIV RNA序列。本领域普通技术人员应当理解，联系可以包括一种或多种专门数据结构的使用，如例如一个或多个数据库，其储存单元型和/或整合酶相关信息。软件应用程序可以包括数据结构或以已知方式与数据结构通信，以从数据结构中提取信息和/或将新信息提供到数据结构内。
如上所述，平行测序许多核酸模板提供了目前描述的本发明所需的灵敏度。例如，基于二项式统计学，对于完全装载的60 mm x 60 mm PicoTiterPlate（2 X 106高质量碱基，由200,000 x 100个碱基读数组成）的检测下限（即一个事件）是对于具有至少0.002％的等位基因频率的群体具有95％置信度，并且对于具有至少0.003％的等位基因频率的群体9具有99％置信度（还应当理解如上所述可以采用70 x 75 mm PicoTiterPlate，这允许甚至更大数目的读数且因此增加的灵敏度）。对于比较，经由基于焦磷酸盐的测序的SNP检测已报道了在四倍体基因组上分开等位基因状态的检测，只要最不频繁的等位基因在10％或更多的群体中存在（Rickert等人，2002 BioTechniques. 32:592-603）。常规荧光DNA测序甚至更不灵敏，经历故障分辨50/50（即50 ％）杂合子等位基因（Ahmadian等人，2000 Anal. BioChem. 280:103-110）。
表2显示了基于总群体中SNP的发生率，对于给定数目N（=100）的测序扩增子，检测到零、或一个或多个事件的概率。“*”指示当发生率是5.0％时，未能检测到至少一个事件的概率3.7％；类似地，“**”揭示当发生率是7％时，未能检测到一个或多个事件的概率0.6％。
该表因此指出检测以5％水平存在的SNP的置信水平是95％或更佳，并且类似地检测以7％水平存在的SNP的置信水平是99％或更佳。
表 2
Figure 748181DEST_PATH_IMAGE001
。
天然地，多路分析具有比检测深度更大的可应用性，并且表3展示了可以在单个PicoTiterPlate阵列上同时筛选的SNPs数目，伴随在95％和99％置信度下可检测的最低限度等位基因频率。
表 3
SNP 类别 读数数目 以95％置信度可检测的群体中的SNP最低限度频率 以99％置信度可检测的群体中的SNP最低限度频率
1 200000 0.002％ 0.003％
2 100000 0.005％ 0.007％
5 40000 0.014％ 0.018％
10 20000 0.028％ 0.037％
50 4000 0.14％ 0.18％
100 2000 0.28％ 0.37％
200 1000 0.55％ 0.74％
500 400 1.39％ 1.85％
1000 200 2.76％ 3.64％
图4提供了用于鉴定HIV整合酶区域中的低频率变异的方法的一个实施方案的举例说明性例子，其包括步骤403用于起始样品输入。为了一致地检测下至3％频率的较少变体，在该方法中使用的HIV-1 RNA样品需要160 IU/μl的最低限度病毒含量，如用Artus HIV实时定量PCR测定（可从Artus Biotech GmbH获得）测定的。对于下至1％频率的检测，最低限度病毒含量应是至少500 IU/μl。本领域普通技术人员应当理解可以引入另外的系统误差来源，如例如由PCR过程引入的低量误差，并且1％是指变异频率而不是系统误差。
如果定量RNA样品是不实际的，那么可以对进入最大限度60 μl的总洗脱物内的至少140 μl血浆执行RNA提取，如果在血浆中的原始病毒载量是100,000拷贝/ml。对于较低的病毒载量，血浆量可以相应按比例决定，并且病毒在20,600 rpm 4℃下1小时30分钟形成团块。应去除足够上清液，以留下140 μl浓缩物用于提取操作。设置用于数个样品的PCR和测序两份重复反应，以验证低频率变体的一致检测。
接下来，如步骤405中举例说明的处理RNA样品，以由HIV样品群体生成cDNA模板。由样品生成cDNA可以使用下述操作执行：
1. 将96孔板置于冷却器中
2. 加入11.5 μl RNA/孔
3. 加入0.5 μl引物IN5R
cDNA-IN5R：
5’ GTGTTTTACTAAACTDTTCCATG 3’（SEQ ID NO：9）
在65℃下孵育10分钟，随后立即将管置于冰上。
制备对于管数目按比例增加的逆转录酶（RT）混合物：
1. Transcriptor RT反应缓冲液（可从Roche获得）4 μl
2. Protector RNA酶抑制剂（可从Roche获得）0.5 μl
3. dNTPs 2 μl
4. DTT（可从Roche获得）1 μl
5. Transcriptor逆转录酶（可从Roche获得）0.5 μl
通过涡旋短暂混合，并且保持在冰上直至加入RNA样品
6. 加入8 μl RT混合物/孔
7. 使板密封且短暂离心
8. 置于热循环仪中且运行下述cDNA程序
60分钟，50℃
5分钟，85℃
4℃一直
9. 加入1 μl RNA酶H（可从New England Biolabs获得）/孔
10. 在37℃下置于热循环仪块中（具有设为50℃或超过50℃的加热盖）20分钟
11. 立即进行至扩增子生成或将cDNA贮存于-80℃。
随后，如步骤410中举例说明的，使用下述操作，采用区域特异性引物对，以扩增来自步骤405中生成的cDNA模板的靶区域：
1. 下文描述的13x混合物对于一个96孔板（6个扩增子，47个样品 + 1个对照）是足够的。该方法可以根据需要按比例增加或缩小。
2. 将6个1.5 ml离心管标记为“IN1A”、“IN1B”、“IN3”、“IN4”、“IN5”和“IN6”。这些标记指下述扩增子/引物组。
IN1A IN12F + IN2R
IN1B IN1F + IN2R
IN3 IN3F + IN3R
IN4 IN4F + IN4R
IN5 IN5F + IN5R
IN6 IN6F + IN6R
（注：除上文描述的靶特异性引物外，下述引物包括下述元件：对于正向和反向引物特异的SAD序列；和关键元件=TCAG）
IN12F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGCTATTTTTAGATGGAATAGANAARGC
（SEQ ID NO：*1）
IN1F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTACCAGCACACAAAGGRATTGG
（SEQ ID NO：2）
IN2R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTGATCCCTGCCCACCARCA
（SEQ ID NO：3）
IN3F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGGAAAAATTATCCTRGTAGCAGT
（SEQ ID NO：4）
IN3R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCCTGCACTGTAYCCCCCAAT
（SEQ ID NO：5）
IN4F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGTAAAAACAATACATACAGAYAATGG
（SEQ ID NO：6）
IN4R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGCTGTCCCTGTAATAAACCCGAA
（SEQ ID NO：7）
IN5F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGACAGCAGTACAAATGGCAGT
（SEQ ID NO：8）
IN5R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGTGTTTTACTAAACTDTTCCATG
（SEQ ID NO：9）
IN6F
GCCTCCCTCGCGCCATCAGGAATAATAGACATAATAGCAWCAGA
（SEQ ID NO：10）
IN6R
GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTGTTCTAATCCTCATCCTGTC
（SEQ ID NO：11）。
3. 如果需要多路标识符（MIDs）用于实验，那么对于每个扩增子组加入相应MID引物。例如，如果使用MID1，那么引物组A的所有引物应具有对于正向和反向方向加入引物内的MID1。MID序列是10个碱基对长，并且应在序列衔接头序列后且紧接在靶引物序列前插入引物内。
4. 在每个管中，用由标记指出的引物组制备PCR主要混合物：
1x混合物 13x混合物
正向引物 1 μl 13 μl
反向引物 1 μl 13 μl
dNTP混合物 0.5 μl 6.5 μl
FastStart 10x缓冲液#2 2.5 μl 32.5 μl
FastStart Hifi聚合酶 0.25 μl 3.25 μl
分子级别水 16.75 μl 217.75 μl
总体积 22 μl 286 μl
5. 将22 μl “IN1A” PCR主要混合物吸取到第一行的每个孔内。
6. 将22 μl “IN1B” PCR主要混合物吸取到第二行的每个孔内。
7. 将22 μl “IN3” PCR主要混合物吸取到第三行的每个孔内。
8. 将22 μl “IN4” PCR主要混合物吸取到第四行的每个孔内。
9. 将22 μl “IN5” PCR主要混合物吸取到第五行的每个孔内。
10. 将22 μl “IN6” PCR主要混合物吸取到第六行的每个孔内。
11. 根据下述方案加入3 μl cDNA/孔（一个样品/列）
12. 列11中的阳性对照是已知样品cDNA，并且列12中的阴性对照是来自cDNA合成板的水对照。
13. 用板封条包被板。
14. 使板在900xg下离心30秒。
15. 将板置于热循环仪块中，并且运行程序“HIV_INT”
94℃3分钟
40个循环：
94℃15秒
55℃20秒
72℃45秒
72℃8分钟
4℃一直。
16. 如果不立即进行至下一个步骤，那么将板贮存于冰上（用于同一天处理）或-20℃。
随后在某些实施方案中，在步骤410中生成的扩增子可以如步骤413中举例说明的进行净化或纯化，其中使用相关领域已知的用于大小选择的固相可逆固定（也被称为SPRI）或凝胶切割法。例如，扩增子纯化可以使用下述过程执行：
1. 使板在900 x g下离心30秒。
2. 使用8通道多道移液器（multipipettor），将22.5 μl分子级别水吸取到96孔、圆底、PP板（可从Fisher Scientific获得）的列1-11中的每个孔内。
3. 将22.5 μl PCR产物从PCR板转移到圆底PP板的每个孔内；对于2块板保持布局相同。
4. 将72 μl SPRI珠加入每个孔中，并且通过上下吸取至少12次充分混合，直至SPRI珠/PCR混合物是均质的。
5. 使板在室温下孵育10分钟，直至上清液是澄清的。
6. 将板置于96孔磁环支架（可从Ambion，Inc.获得）上，并且在室温下孵育5分钟。
7. 在板在磁环支架上静止时，小心地取出且弃去上清液而不扰乱珠。
8. 从磁环支架中取出PP板，并且加入200 μl新鲜制备的70％乙醇。
9. 将PP板放回磁环支架上。在磁环支架上以前后/环状运动轻敲或移动PP板~10次，以搅动溶液且帮助团块分散（团块可以是不完全分散的；这是可接受的）。
10. 将PP板置于磁环支架上，并且孵育1分钟。
11. 在板在磁环支架上静止时，小心地取出且弃去上清液而不扰乱珠。
12. 重复步骤8-11。去除尽可能多的上清液。
13. 将PP板/磁环支架一起置于设为40℃的加热块上，直至所有团块完全干燥（10-20分钟）。
14. 将10 μl 1X TE（pH 7.6 ± 0.1）加入每个孔中。在磁环支架上以相同的前后/环状运动轻敲/或移动PP板，直至所有团块都分散。
15. 将PP板置于磁环支架上，并且孵育2分钟。
16. 将上清液从每个孔吸取到新96孔（黄色）板内。难以避免在一些孔中团块的任何转移；这是可接受的。
17. 用板封条包被板，且贮存于-20℃。
在一个或多个实施方案中，定量扩增子也可以是有利的。在呈现的例子中，扩增子定量可以使用下述过程执行：
1. 使用本领域已知的方法用PicoGreen®试剂定量1 μl这些扩增子。
2. 定量在5 ng/μl或低于5 ng/μl的任何扩增子应在2100 Bioanalyzer（可从Agilent Technologies获得）上进一步评估：将1 μl每种纯化的扩增子装载到Bioanalyzer DNA芯片上，并且运行DNA-1000系列II测定。
a. 如果存在预期大小的条带，并且引物二聚体以3:1或更少的摩尔比显而易见，那么使用PicoGreen定量且进行至扩增子合并。
b. 如果存在预期大小的条带，并且引物二聚体以超过3:1的摩尔比显而易见，那么重复SPRI和PicoGreen定量，随后为Bioanalyzer分析，以证实引物二聚体的去除。
3. 在Bioanalyzer上分析1μl阴性PCR对照反应。不应看见除引物二聚体外的条带。
接下来，如步骤415中举例说明的，选择来自扩增子的核酸链且引入乳状液滴内，并且如本说明书中其它地方描述的进行扩增。在某些实施方案中，可以设置2个乳状液/样品，一个使用Amplicon A试剂盒，并且一个使用Amplicon B试剂盒，2种试剂盒可从454 Life Sciences Corporation获得。应当理解在不同实施方案中，可以采用不同数目的乳状液和/或不同试剂盒。使用下述过程可以选择扩增子用于最终混合物：
1. 生成用于每种样品的6个扩增子，其各自理想地应以等摩尔量混合用于emPCR反应。因为并非所有扩增子都以相等效率生成，并且偶然地存在制备的极少扩增子，但相反可能存在大量引物二聚体。为了达到最佳测序结果，重要的是仅使用良好定量且相对纯（参见下文）的扩增子用于每种样品的最终混合物，甚至在一些扩增子的质量在标准以下时。由于各种扩增子之间相当大的重叠，可能并非所有6个扩增子都是完全覆盖给定样品所需的。当6个高质量扩增子组不可用时，根据下文规则用于选择扩增子用于每种样品的最终混合物：
i. 如果扩增子在Bioanalyzer上未识别为可定量条带，那么不将其用于6.2中的最终扩增子混合物。
. 如果引物二聚体与扩增子的摩尔比是3:1或更多，那么不用于最终扩增子混合物。这个测量将仅可用于低浓度的扩增子，其在6.1中用Agilent Bioanalyzer测定进一步定量。
. 如果扩增子不符合上述标准或完全缺失，那么根据下述方案增加其它重叠扩增子的量：
2. 如果扩增子IN3和IN4缺失，那么小部分的整合酶区域无法进行测序。可以使用加倍量的In1A和IN5，但应当指出将不存在关于与整合酶基因的密码子 130-181 对应的位置 484-636 的序列数据。可替代地，对于这些扩增子重复PCR。
3. 如果扩增子IN1A和IN1B缺失，那么整合酶区域无法进行完全测序。对于这些扩增子重复PCR。
4. 如果扩增子IN5和IN6缺失，那么整合酶区域无法进行完全测序。对于这些扩增子重复PCR。
5. 如果扩增子IN1A和IN3缺失，那么加倍扩增子IN1B和IN4的量。
6. 如果扩增子IN5和IN4缺失，那么小部分的整合酶区域无法进行测序。可以使用加倍量的IN6和IN3，但应当指出将不存在关于分别与整合酶区域的密码子 191-208 或密码子 284-290 对应的位置 667-717 或区域 947-965 的序列数据。可替代地，对于这些扩增子重复PCR。
此外，作为步骤415的部分，用于扩增子混合和稀释的下述过程可以用于在emPCR中使用：
1. 使用下述等式计算衍生自给定样品的6个扩增子各自以分子/μl计的浓度：
Figure 727638DEST_PATH_IMAGE002
。
2. 制备6个扩增子各自109个分子/μl的稀释物
向1 μl扩增子溶液中加入下述体积的1 x TE：
Figure 569692DEST_PATH_IMAGE003
。
3. 使等体积的6个扩增子稀释物各自混合，例如10 μl。如果扩增子中的任一缺失，那么根据步骤405中的指导增加重叠扩增子的体积。
4. 通过将1 μl 109个分子/μl溶液加入499 μl 1xTE中，进行混合扩增子至2x106 分个子/μl的进一步稀释。
5. 将最终稀释物（2x106 个分子/μl）贮存于-20℃、在具有o型圈盖的0.5 ml管中。
在扩增后，破坏乳状液，并且如步骤420中举例说明的富集具有固定核酸的扩增群体的珠。例如，如本说明书中其它地方描述的可以富集含DNA珠，这可以包括下述过程要素：
1. 紧接在建立乳状液前，通过将10μl加入90μl珠洗涤缓冲液中，进行6.3.4的2x106 个分子/μl溶液的10倍稀释。涡旋5秒以混合。
2. 对于每种样品，制备具有1 cpb的一种A和一种B乳状液（即，12μl上述稀释物/乳状液（2,400,000个珠））。
3. 用于给定样品的2种乳状液可以在破坏过程中合并，以便更容易处理。
富集的珠随后如步骤430中举例说明的进行测序。在某些实施方案中，每种样品如本说明书中其它地方描述的进行测序。例如，在用于测序的富集和处理后，80,000个珠（包括阳性对照样品）可以从组合的乳状液/泳道转移到配备16泳道垫圈的金属处理的70 x 75 metallized PTP上，并且在GS-FLX仪器（可从454 Life Sciences Corporation获得）上测序。
GS-FLX测序仪器包括3个主要部件：流体子系统、纤维光学载玻片药筒/流动室、和成像子系统。试剂吸入管路、多阀歧管和蠕动泵构成流体子系统的部分。个别试剂与合适的试剂吸入管路连接，这允许试剂以预编程的流速和持续时间递送到流动室内，一次一种试剂。纤维光学载玻片药筒/流动室具有在载玻片的蚀刻侧面和流动室顶面之间的250 μm间隔。流动室还包括用于试剂和纤维光学载玻片的温度控制的工具，以及不透光的外壳。载玻片的抛光（未蚀刻）侧面直接置为与成像系统接触。
通过流体系统的预编程操作达到测序试剂循环递送到纤维光学载玻片孔内和从孔中洗涤测序反应副产物。程序一般以界面控制语言（Interface Control Language）（ICL）脚本形式书写，指定每个脚本步骤的试剂名称（洗涤、dATPαS、dCTP、dGTP、dTTP和PPi标准）、流速和持续时间。例如，在一个可能实施方案中，流速对于所有试剂可以设为4 mL/分钟，其中在流动室内的线性速度约~1 cm/s。测序试剂的流动次序可以组构成内核程序，其中第一个内核程序包括PPi流动（21秒），随后为14秒的基底流动、28秒的腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤和21秒的基底流动。第一个PPi流动可以随后为dNTP流动（dC-基底-腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤-基底dA-基底-腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤-基底-dG-基底-腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤-基底-dT-基底-腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤-基底）的21个循环，其中每个dNTP流动由4个个别内核程序组成。每个内核程序是84秒长（dNTP-21秒、基底流动-14秒、腺苷三磷酸双磷酸酶洗涤-28秒、基底流动-21秒）；在21秒和63秒后捕获图像。在dNTP流动的21个循环后，引入PPi内核程序，并且随后为dNTP流动的另一次21个循环。测序运行结束随后为第三个PPi内核程序。总运行时间是244分钟。完成这个循环所需的试剂体积如下：500 mL每种洗涤溶液、100 mL每种核苷酸溶液。在运行过程中，所有试剂保持在室温下。流动室和流动室入口管道系统的温度控制在30℃，并且进入流动室的所有试剂预热至30℃。
随后，如步骤440中举例说明的分析输出序列数据。在某些实施方案中，使用特异性扩增子软件处理包含针对高质量过滤的流动图数据的SFF文件，且分析数据。
应当理解，上文描述的步骤仅用于举例说明的目的并且不意图是限制性的，并且进一步地，一些或所有步骤可以以各种组合在不同实施方案中采用。例如，在上文描述的方法中采用的引物可以与另外引物组组合用于询问其它HIV特征/区域，以提供更综合的诊断或治疗利益。在呈现的例子中，此类组合可以提供在板上的“弄干（dried down）”，并且包括所述整合酶引物，以及用于检测HIV药物抗性或向性区域以及任何其它目的区域的一些或所有引物。另外例子公开于2008年3月14日提交、名称为“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”的PCT申请序列号US 2008/003424；和/或于2009年6月17日提交、名称为“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”的美国专利申请序列号12/456,528中，其各自为了所有目的在此整体引入本文作为参考。
已描述了各种实施方案和实现，对于相关领域技术人员应显而易见的是，前述仅是举例说明性而不是限制性的，仅作为例子呈现。用于在举例说明的实施方案的各种功能元件中分配功能的许多其它方案是可能的。任何元件的功能可以以各种方式在可替代实施方案中执行。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 用于检测HIV整合酶变体的系统和方法
<130> 25962 WO
<150> US 61/118,815
<151> 2008-12-01
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n是a, c, g或t
<400> 1
ctatttttag atggaataga naargc 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
gtaccagcac acaaaggrat tgg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
ttgatccctg cccaccarca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggaaaaatta tcctrgtagc agt 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
cctgcactgt aycccccaat 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtaaaaacaa tacatacaga yaatgg 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 7
ctgtccctgt aataaacccg aa 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
gacagcagta caaatggcag t 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 9
gtgttttact aaactdttcc atg 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 10
gaataataga cataatagca wcaga 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 11
tgttctaatc ctcatcctgt c 21
<210> 12
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 12
agcaggaaga tggccagtaa aaacaataca tacagacaat ggcagcaatt tcaccagtac 60
tgcagttaag gccgcc 76
<210> 13
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
agcaggaaga tggccagtca aagtaataca tacagacaat ggcagtaatt tcaccagtaa 60
tgcagtgaaa gcagct 76
<210> 14
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 14
agcaggaaga tggccagtca aagtaataca tacagacaat ggcagtaatt tcaccagtaa 60
tgcagtgaaa gcagcc 76
<210> 15
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 15
agcaggaaga tggccagtca aagtaataca tacagacaat ggcagtaatt tcaccagcaa 60
tgcagtgaaa gcagcc 76

Claims (15)

1. 一种用于检测与整合酶相关的一种或多种HIV序列变体的低频率出现的方法，其包括步骤：
（a）生成来自HIV样品群体中的多个RNA分子的cDNA种类；
（b）由cDNA种类扩增多个第一扩增子，其中每个第一扩增子用一对核酸引物进行扩增；
（c）克隆扩增所述第一扩增子的扩增拷贝，以产生多个第二扩增子；
（d）测定所述第二扩增子的核酸序列组成；
（e）检测在所述第二扩增子的核酸序列组成中以5％或更少的频率出现的一种或多种序列变体；和
（f）使所述检测出的序列变体和与HIV整合酶相关的变异关联。
2. 权利要求1的方法，其中：
所述与HIV整合酶相关的变异已知与针对整合酶抑制剂的抗性相关。
3. 权利要求1的方法，其中：
所述HIV样品群体衍生自单个患者。
4. 权利要求1的方法，其中：
所述多个第一扩增子包括6个扩增子。
5. 权利要求1的方法，其中：
用于所述第一扩增子的所述引物对靶向低突变频率的区域。
6. 权利要求1的方法，其中：
所述第一扩增子靶向与HIV整合酶功能性相关的HIV区域。
7. 权利要求1的方法，其中：
所述第二扩增子使用一对共用引物进行扩增。
8. 权利要求1的方法，其中：
一种或多种序列变体在99％的置信水平下检测到。
9. 权利要求1的方法，其中：
测定来自至少400个固定群体的基本上等同拷贝的核酸组成，并且一种或多种检测到的序列变体以1.85％或更低的频率出现。
10. 权利要求1的方法，其中：
测定来自至少10000个固定群体的基本上等同拷贝的核酸组成，并且一种或多种检测到的序列变体以0.74％或更低的频率出现。
11. 权利要求1的方法，其中：
测定来自至少200000个固定群体的基本上等同拷贝的核酸组成，并且一种或多种检测到的序列变体以0.003％或更低的频率出现。
12. 权利要求1的方法，其中：
所述检测步骤采用包括单个检测装置的仪器，所述检测装置能够检测在单个基底上由多个测序反应生成的信号。
13. 权利要求1的方法，其中：
所述单个基底包括多个反应位点。
14. 一种用于检测与整合酶区域相关的一种或多种HIV序列变体的试剂盒，其包括：
用于扩增权利要求1的第一扩增子的多个核酸引物对。
15. 一种用于检测与整合酶区域相关的一种或多种HIV序列变体的试剂盒，其包括：
选自IN12F（SEQ ID NO：1）和IN2R（SEQ ID NO：3）；IN1F（SEQ ID NO：2）和IN2R（SEQ ID NO：3）；IN3F（SEQ ID NO：4）和IN3R（SEQ ID NO：5）；IN4F（SEQ ID NO：6）和IN4R（SEQ ID NO：7）；IN5F（SEQ ID NO：8）和IN5R（SEQ ID NO：9）；以及IN6F（SEQ ID NO：10）和IN6R（SEQ ID NO：11）的一个或多个引物对。
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