CN102221614A - 一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，包括金纳米探针的设计及制备，金纳米探针的表征，金纳米探针的生物活性分析，运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定，靶点蛋白的验证等步骤。本发明方法可以在进行蛋白质组学分析前，通过金纳米探针的细胞活性检测，先确定连接在金纳米探针表面的化合物是否仍然保持其生物活性，从而优越于传统的亲和层析方法，大大提高了靶点鉴定的效率及其成功率，为研究药物的作用机理提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及小分子化合物作用靶点的分析方法，尤其涉及一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法。
背景技术
亲和层析法是一种常用的靶点鉴定方法。它将待测靶点的小分子化合物连接在一个固体支持物上，通过其与细胞裂解液的孵育、离心、洗涤，分离出靶点蛋白。对这些蛋白进行电泳及质谱分析，可以确定其种类。
为了改善靶点鉴定的效率，有各种各样的球珠被尝试用于亲和层析的固体支持物，比如琼脂糖球珠，磁性球珠，橡胶球珠等。然而亲和层析方法最主要的缺点在于，它无法确定待测的小分子在连接到固体支持物上之后是否仍然保持其生物活性。并且以上这些球珠的粒径都在200nm以上，存在不易进入细胞的不足。
金纳米材料的研究已经有几十年的历史。现有的研究表明，金纳米较其他纳米材料来说，具有易于合成，易于表面修饰的特点。金纳米颗粒可以通过金硫键与各种含有硫醇基团的小分子化合物相连接。同时，纳米毒理学的研究发现，金纳米颗粒易于被细胞摄取，且金纳米本身的细胞毒性较小。鉴于以上的特点，有金纳米被尝试用做靶点鉴定探针的报道。但是经权威机构检索，有关用金纳米探针从细胞全蛋白的层次来鉴别小分子化合物作用靶点的研究，目前国内外尚未见报道。
发明内容
针对现有靶点分析方法的不足，本发明的目的在于提供一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法。
本发明所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，步骤包括：
(I)金纳米探针的设计及制备
选取含有硫醇基团的化合物或经修饰能连接上硫辛酸的化合物，分别以如下方法连接在金纳米颗粒表面：
①将含有硫醇基团的化合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30±5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4±0.5小时，反应结束后，用盐酸调节pH值至7.0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3～5次，之后在50±5℃，真空干燥金纳米颗粒12±3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；
②以如下方法修饰化合物，得到连接上硫辛酸的化合物，然后再连接在金纳米颗粒表面：
1)在化合物的非活性部位加入一个羟基(5)；
2)将二缩三乙二醇(2)的一个羟基用对甲基苯磺酰氯保护，生成二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)；
3)二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)；
3)2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)与加入羟基的化合物(5)发生成醚反应，化合物连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)；
4)连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺的化合物(6)与水合肼反应将其上的邻苯二甲酰亚胺基替换成氨基，生成连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇的化合物(7)；
5)硫辛酸与连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇(7)的化合物发生偶合反应，生成连接上硫辛酸的化合物(8)；
反应式如下：
6)将上述连接上硫辛酸的化合物(8)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30±5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4±0.5小时，反应结束后，用盐酸调节pH值至7.0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3～5次，之后在50±5℃，真空干燥金纳米颗粒12±3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；
(II)金纳米探针的表征
采用高分辨透射电镜、高效液相色谱-质谱确定制备的金纳米探针的形貌特征，选定形貌为球形，粒径分布在2～5nm之间，且化合物在金纳米表面的上载量为0.3～0.6mmol/g的金纳米探针用于靶点鉴定；
(III)金纳米探针的生物活性分析
将步骤(II)选定的金纳米探针加入培养的处于对数生长期的癌细胞中处理48～60小时，以WTS-1方法检测细胞脱氢酶的活性，依据金纳米探针对细胞处理前后的检测结果及对细胞生长百分比的分析，判定金纳米探针是否仍保持修饰前的化合物应有的生物活性；
(IV)运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定
①常规方式培养癌细胞，然后将癌细胞用细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白，待用；
②将步骤(III)所述保持生物活性的金纳米探针与提取的癌细胞总蛋白在4±0.5℃孵育1～1.5小时；同时将设定的化合物分子与提取的癌细胞总蛋白在4±0.5℃孵育1～1.5小时后，再加入步骤(III)所述保持生物活性的金纳米探针，继续在4℃孵育1小时；孵育结束后，分别以15000±1000rpm离心10～30分钟分离金纳米探针，并用RIPA强裂解液和SDS上样缓冲液将蛋白从金纳米探针上解离下来，分别收集蛋白溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；
③对比未加设定化合物和加入设定化合物的两个样品凝胶电泳结果，从电泳谱图中找出金纳米探针特异性结合蛋白的条带，对其进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，鉴定出靶点蛋白的种类。
(V)靶点蛋白的验证
运用免疫荧光，western blot，ELISA，放射自显影等方法，对靶点蛋白或者靶点蛋白所影响的下游蛋白进行检测，可以进一步判断所述化合物是否作用于该靶点，从而验证靶点蛋白的真实性。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(I)所述经修饰能连接上硫辛酸化合物选噻唑烷酮类化合物。
其中：所述噻唑烷酮类化合物优选2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮或2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(I)所述含有硫醇基团的化合物选硫醇类化合物。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(II)所述粒径范围优选为2-4nm，化合物在金纳米表面的上载量优选为0.4～0.5mmol/g。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(IV)所述设定的化合物选噻唑烷酮类化合物。
其中，所述设定的化合物优选2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮或2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(IV)所述癌细胞优选肺癌细胞H460。
上述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法中：步骤(IV)所述离心时间优选15～20分钟。
为了更好地理解本发明的实质，下面以噻唑烷酮类化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮化合物的靶点鉴定为例，来进一步说明本发明所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的具体分析方法。
2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的结构式为：
根据前期的研究结果表明，2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮化合物能够选择性的杀死非小细胞肺癌H460细胞(EC50＝0.9μM)及对紫杉醇具有抗药性的H460细胞(EC50＝0.8μM)，而对人的正常成纤维细胞NHFB几乎没有毒性(EC50＞100μM)。但是该化合物的作用靶点尚不明确，运用本发明所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的方法可以实现对其作用靶点的分析鉴定。
一.金纳米探针的制备
1.化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮的制备(结构式如下)：
a.二缩三乙二醇(2)与对甲基苯磺酰氯反应生成相应的二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯
(3)：
将对甲基苯磺酰氯溶解于二氯甲烷中，在0℃条件下缓慢的滴加到溶有三聚乙二醇的二氯甲烷中。室温搅拌5小时，减压蒸馏反应液除去二氯甲烷。剩余产品用33.3％的乙醚二氯甲烷溶液进行柱层析纯化，获得二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯。
b.二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)：
将二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)，邻苯二甲酰亚胺钾，十六烷基三丁基溴化磷(PTC)溶于甲苯中，通氮气保护，100℃加热回流反应4小时。反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏滤液除去甲苯，剩余产品用50％的乙酸乙酯石油醚溶液进行柱层析纯化得到2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)。
c.3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮(5)的制备：
向溶解有5-氨基-2-甲基苯酚(10)的盐酸溶液加入硫氰酸胺，搅拌条件下加热到85℃，反应8小时后冷却至室温，过滤，然后用水和10％HCl水溶液洗涤，真空干燥得到高纯度高产量的3-羟基-4-甲基苯硫脲(11)。将3-羟基-4-甲基苯硫脲(11)和无水硫酸钠加入到20mL的乙醇中，搅拌条件下加入氯代乙酸乙酯，加热至60℃，反应6小时。反应完成后冷却至4℃，有沉淀析出。将反应液过滤，固体用乙醇洗涤，得到部分粗产物。滤液减压蒸馏，然后用乙酸乙酯和水萃取，合并有机相得到更多的粗产物。粗产物在乙酸乙酯中重结晶，得到产物3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮。
d.2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)和3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮(5)反应生成相应的2-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)：
将三苯基磷溶于二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，然后加入3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮(5)，10分钟后加入2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)室温下反应10小时。反应完成后减压蒸馏出去二氯甲烷，剩余产物用75％的乙酸乙酯石油醚溶液柱层析纯化的得到-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)。
e.2-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)与水合肼反应生成相应的2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)：
将2-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)溶于乙醇中，加入水合肼，加热至80℃反应4小时。反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏蒸干溶剂得到2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)。
f.2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)与硫辛酸反应生成相应的2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)：
将2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，二环己基碳二亚胺(DCC)，硫辛酸加入二氯甲烷中，室温搅拌，反应10小时。反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏滤液得到2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)。
g.2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)与对二甲氨基苯甲醛反应生成相应的2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(9)：
将2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)，对二甲氨基苯甲醛加入到乙醇中，然后加入哌啶，70℃下回流反应8小时。反应结束后，减压蒸馏去除溶剂乙醇，用50％的乙酸乙酯石油醚溶液柱层析纯化得到2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(9)。
2.金纳米颗粒的制备
将化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30分钟。之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4小时。反应结束后，用盐酸调节pH值到7.0。离心取沉淀得到金纳米颗粒。分别用甲醇和水洗涤沉淀，共5次。之后在50℃真空干燥金纳米颗粒12小时，备用。
其结构示意图如下：
二.对金纳米探针进行表征，以确定其形貌特征，粒径及其表面连接的小分子的数量
1.用高分辨透射电镜观察金纳米探针的形貌特征，并确定其粒径分布：
将金纳米探针分散在二甲基亚砜(DMSO)中，用高分辨透射电镜进行观察。结果表明金纳米探针的形态呈球形(见图1a)，且粒径分布均匀，平均粒径在2.5nm(见图1b)
2.通过碘切的方法和高效液相色谱-质谱连用仪对连接在金纳米探针表面的化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮进行定量分析：
金纳米表面连接小分子化合物的金硫键可以被碘单质切断，所以可以用碘切的方法将金纳米表面的小分子切下来，从而进行定量分析。将金纳米探针分散在甲醇中，加入碘的乙醇溶液，室温震荡30分钟，离心取上清液进行高效液相色谱-质谱分析。同时，用不同浓度(0.2mM，0.5mM，1mM)的2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮做标准曲线，从而计算出金纳米探针表面分子的上载量。结果计算出上载量为0.45mmol/g(见图2)。
三.WST-1方法检测细胞脱氢酶的活性，从而分析金纳米探针的生物活性
将肺癌细胞H460接种于96孔板中培养24小时，后经不同浓度(20、5、2.5、1μM)的金纳米探针处理48小时，分别用WST-1方法检测琥珀酸脱氢酶的活性，同时检测未经金纳米探针处理前的细胞(即接种后培养24小时后的细胞，计为Day0值)，计算生长百分比。生长百分比＝(实验组OD值-Day0 OD值/对照组OD值-Day0 OD值)×100％(以不含细胞的培养液为空白组)。实验结果表明金纳米探针对H460细胞有明显的生长抑制作用，实验组细胞生长百分比较对照组降低且呈剂量依赖性(见图3)。说明该金纳米探针表面连接的小分子化合物依然保持它的生物活性。
四.利用金纳米探针，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的靶点蛋白
将金纳米探针与肺癌细胞H460的细胞总蛋白4℃孵育1小时。同时为了确保只有特异性与金纳米探针结合的蛋白被鉴定出来，设置一个平行样品：将化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮先与细胞总蛋白4℃孵育1小时，再加入金纳米探针4℃孵育1小时。孵育结束后，离心分离金纳米探针，并将蛋白从纳米探针上解离下来，收集蛋白溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。对比事先加入化合物和不加入化合物的两条泳道，申请人发现有四个蛋白条带有明显的差异(见图4)。将这四个蛋白条带进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，鉴定出四种蛋白，分别是1——β-热激蛋白90；2——多聚腺苷酸结合蛋；3——热激蛋白70；4——α-微管蛋白。其中由于热激蛋白90和微管蛋白是已经被报道过的经典抗癌靶点，所以被认为是该化合物的潜在作用靶点，故对这两个靶点进行了如下的验证。
五.化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的潜在靶点蛋白的验证
1.体外微管聚合实验验证化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮抑制微管的聚合。
化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮溶解在二甲基亚砜中，浓度为10μM，同时以秋水仙素(5μM)和二甲基亚砜做对照组，根据微管聚合实验试剂盒的操作步骤进行实验。结果表明，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮可以抑制微管的聚合，与秋水仙素有相似的作用(见图5)。
2.微管免疫荧光实验验证化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在H460细胞内抑制微管的聚合。
将肺癌细胞H460接种于48孔板中培养24小时，后分别经1μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮和秋水仙素处理24小时。用4％多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤3次后，用山羊血清封闭，室温条件下孵育20分钟。之后加入α-微管蛋白的抗体4℃孵育过夜，再加入异硫氢酸荧光素(FITC)标记的二抗37℃孵育20分钟，用荧光显微镜进行观察。结果表明，经化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理的细胞与秋水仙素处理过的细胞有同样的效果，微管都呈点状，表明微管的网络结构被破坏，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理的细胞和秋水仙素一样都起到了抑制微管聚合的作用(见图6a，b，c)。
3.微管干扰试剂的标志现象c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化的检测。
将用浓度为10μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理不同时间(0，12，24，48小时)的H460细胞进行裂解，提取细胞总蛋白。用提取的蛋白进行Western blot实验检测磷酸化JNK及总JNK的表达情况。结果表明，在经过2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的作用后，磷酸化JNK的水平有明显提高，且在12小时达到峰值。而同时JNK总水平没有改变。说明2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮可以引起JNK的激活(见图7)。
4.检测热激蛋白90抑制剂的标志现象CRAF-1，ERBB2蛋白的降解以及AKT磷酸化水平的下降。
将用浓度为5μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理不同时间(0，24，48小时)的H460细胞进行裂解，提取细胞总蛋白。同时用同样的方法提取被已知的热激蛋白90的抑制剂17-DMAG处理过的细胞总蛋白(处理0，24，48小时)。用提取的蛋白进行Western blot实验检测CRAF-1，ERBB2以及磷酸化AKT的表达。结果表明，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮与17-DMAG一样都可以引起CRAF-1，ERBB2并抑制AKT的磷酸化(见图8)。
由以上实验及其结果可以得出如下结论：
本发明所描述的方法，先经过金纳米探针的细胞活性检测，确定了连结在金纳米探针表面的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮仍然保持其生物活性；然后运用这个金纳米探针鉴定出并验证了微管蛋白和热激蛋白90是该化合物的作用靶点。由此证明了利用纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法的可行性。
本发明更为突出的优点是：因为本发明所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的方法可以在进行蛋白质组学分析前，通过金纳米探针的细胞活性检测，先确定连接在金纳米探针表面的化合物是否仍然保持其生物活性，从而优越于传统的亲和层析方法，大大提高了靶点鉴定的效率及其成功率，为研究药物的作用机理提供了新的途径。
附图说明
图1，金纳米探针的形貌特征及粒径分布
其中：a：为金纳米探针在高分辨透射电子显微镜下的图片。其中比例尺为10nm。b：根据电镜照片得到的金纳米探针粒径分布图。
图2，为金纳米表面化合物的表征结果。
其中：a：为金纳米探针被碘切后的自由小分子与碘单质混合物的液相谱图。其中保留时间为5.3分钟的峰为碘单质峰，保留时间为6.6分钟的峰为化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(9)的峰。b：为对应于保留时间为6.6分钟的峰的电喷雾质谱图。
图3，为WST-1金纳米探针作用于H460细胞的剂量效应分析。
其中：金纳米探针的浓度从左到右依次是1、2.5、5、20μM。实验数据以平均值±标准误差表示，*P＜0.05，表示实验组与对照组有明显差异。
图4，通过金纳米探针进行靶点鉴别的SDS-PAGE凝胶图像。
四种蛋白，分别是1——β-热激蛋白90；2——多聚腺苷酸结合蛋；3——热激蛋白70；4——α-微管蛋白。
图5，体外微管聚合实验的时间效应图。
化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮与秋水仙素的浓度分别是10μM和5μM。实验数据以平均值±标准误差表示。
图6，微管免疫荧光照片。
其中：a.H460细胞在1μM化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理24小时后的微管免疫荧光照片。比例尺为25μm。b.H460细胞在1μM秋水仙素处理24小时后的微管免疫荧光照片。比例尺为25μm。c.H460细胞仅用二甲基亚砜处理24小时后的微管免疫荧光照片。比例尺为25μm。
图7，H460在10μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮不同时间(0，12，24，48小时)处理后的磷酸化JNK和JNK的表达量。
图8，验证热激蛋白90是化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的作用靶点的实验结果。H460在5μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮和200nM的17-DMAG分别不同时间(0，24，48小时)处理后的CRAF-1，ERBB2和磷酸化AKT的表达量。
图9，通过金纳米探针进行靶点鉴别的SDS-PAGE凝胶图像。
五种蛋白，分别是1——氨甲酰磷酸合成酶；2——亚甲基四氢叶酸脱氢酶；3——β-热激蛋白90；4——热激蛋白70；5——α-微管蛋白。
图10，验证微管蛋白是化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的作用靶点的实验结果。
其中：a.体外微管聚合实验的时间效应图。化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮与秋水仙素的浓度都为5μM。实验数据以平均值±标准误差表示。b.H460细胞在5μM化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理14小时后的微管免疫荧光照片。c.H460细胞在200nM秋水仙素处理14小时后的微管免疫荧光照片。d.H460细胞仅用二甲基亚砜处理14小时后的微管免疫荧光照片。
图11，验证热激蛋白90是化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的作用靶点的实验结果。
H460在2μM的化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮和200nM的17-DMAG分别不同时间(0，48，72小时)处理后的CRAF-1，ERBB2的表达量。
具体实施方式
实施例1
化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮的制备：
二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)的制备
将对甲基苯磺酰氯(100mmol，19g)溶解于100mL的二氯甲烷中，在0℃条件下缓慢的滴加到溶有三聚乙二醇(500mmol，75g)的二氯甲烷(50mL)中。
当对甲基苯磺酰氯滴加完毕后，在室温下搅拌反应5小时。薄层色谱层析法监测反应，直至对甲基苯磺酰氯反应完全。
减压蒸馏反应液除去二氯甲烷。剩余产品用33.3％的乙醚二氯甲烷溶液进行柱层析纯化，获得二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯。
2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)的制备
将二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(20mmol，5.96g)，邻苯二甲酰亚胺钾(24mmol，4.44g)，十六烷基三丁基溴化磷(PTC)(2.5mmol，1.272g)溶于80mL甲苯中，通氮气保护，100℃加热回流反应4小时，薄层色谱层析法检测反应。
反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏滤液除去甲苯，剩余产品用50％的乙酸乙酯石油醚溶液进行柱层析纯化得到2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺。
3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮(5)的制备：
向溶解有5-氨基-2-甲基苯酚(10)(10.0mmol)的盐酸溶液(HCl∶H2O＝1∶4)加入硫氰酸胺(1.14g，15.0mmol)，搅拌条件下加热到85℃，反应8小时后冷却至室温，过滤，然后用水和10％HCl水溶液洗涤，真空干燥得到高纯度高产量的3-羟基-4-甲基苯硫脲(11)(6mmol)。将3-羟基-4-甲基苯硫脲(11)(6mmol)和无水硫酸钠加(2.479g，30mmol)入到20ml的乙醇中，搅拌条件下加入1.28ml的氯代乙酸乙酯(12mmol)，加热至60℃，反应6小时。反应完成后冷却至4℃，有沉淀析出。将反应液过滤，固体用乙醇洗涤，得到部分粗产物。滤液减压蒸馏，然后用乙酸乙酯和水萃取，有机相合并得到更多的粗产物。粗产物在乙酸乙酯中重结晶，得到产物3-羟基-4-甲基苯亚氨基-1，3-噻唑-4-酮。
2-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)的制备
将三苯基磷(3.6mmol，943.2mg)溶于二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，3.6mmol，858μL)，然后加入3-羟基-4-甲基苯氨甲基-1，3-噻唑-4-酮(5)，10分钟后加入2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)室温下反应10小时。反应完成后减压蒸馏出去二氯甲烷，剩余产物用75％的乙酸乙酯石油醚溶液柱层析纯化的得到-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)。
2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)的制备：
将2-(2-(2-(2-甲基-5-((4-噻唑烷酮-2-亚基)胺基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)溶于乙醇中，加入水合肼(2mmol，121μL)，加热至80℃反应4小时。反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏蒸干溶剂得到2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)。
2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)的制备：
将2-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(7)(1mmol，339mg)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，二环己基碳二亚胺(DCC 0.73mmol，151mg)，硫辛酸(0.67mmol，137mg)加入5mL二氯甲烷中，室温搅拌，反应10小时。反应完成后过滤除去沉淀，减压蒸馏滤液得到2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)。
2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(9)的制备：
将2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮(8)(1mmol，527mg)，对二甲氨基苯甲醛(1.2mmol，179mg)加入到5mL乙醇中，然后加入200μL哌啶，70℃下回流反应8小时。反应结束后，减压蒸馏去除溶剂乙醇，用50％的乙酸乙酯石油醚溶液柱层析纯化得到2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(9)。
实施例2
金纳米颗粒的制备
将化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮(36mg，0.054mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(20.0mL)中，加入氯金酸水溶液(33.1mg，0.08mmol)，室温搅拌30分钟。之后逐滴加入硼氢化钠水溶液(8.8mg，0.232mmol)，室温搅拌4小时。反应结束后，用盐酸调节pH值到7.0。15000rpm离心15分钟取沉淀得到金纳米颗粒。分别用甲醇和水洗涤沉淀，共5次。之后在50℃真空干燥金纳米颗粒12小时，备用。
实施例3
用高分辨透射电镜观察金纳米探针的形貌特征，并确定其粒径分布
将金纳米探针分散在二甲基亚砜中，用高分辨透射电镜进行观察，照片由AMT 2k CCD照相设备得到结果表明金纳米探针的形态呈球形(见图1a)，且粒径分布均匀，平均粒径在2.5nm(见图1b)。
实施例4
通过碘切的方法和高效液相色谱-质谱连用仪对连接在金纳米探针表面的化合物2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮进行定量分析
将金纳米探针(1mg)分散在400μL甲醇中，加入碘的乙醇溶液(400μL，13mg/mL)，室温震荡30分钟，15000rpm离心15分钟取500μL上清液进行高效液相色谱-质谱分析。同时，用不同浓度(0.2mM，0.5mM，1mM)的2-(3-(2-(2-(2-硫辛酸酰氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲基苯基亚胺基)-5-(4-N，N二甲基苯亚甲基)-1，3-噻唑-4-酮做标准曲线，从而计算出金纳米探针表面分子的上载量。结果计算出上载量为0.45mmol/g(见图2)。
实施例5
WTS-1方法检测细胞脱氢酶的活性，分析金纳米探针的生物活性
将肺癌细胞H460以2×104的密度接种于96孔板中，用含有10％胎牛血清，2mM L型谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基培养24小时，后经不同浓度(20、5、2.5、1μM)的金纳米探针处理48小时，分别用WST-1方法检测琥珀酸脱氢酶的活性，同时检测未经金纳米探针处理前的细胞(即接种后培养24小时后的细胞，计为Day0值)，计算生长百分比。生长百分比＝(实验组OD值-Day0 OD值/对照组OD值-Day0 OD值)×100％(以不含细胞的培养液为空白组)。实验结果表明金纳米探针对H460细胞有明显的生长抑制作用，实验组细胞生长百分比较对照组降低且呈剂量依赖性(见图3)。说明该金纳米探针表面连接的小分子化合物依然保持它的生物活性。
实施例6
利用金纳米探针，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的靶点蛋白
将肺癌细胞H460以2×104的密度接种于10cm的培养皿中，用含有10％胎牛血清，2mML型谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基培养24小时。用RIPA弱裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。
将3.2mol金纳米探针分散在300μL RIPA弱裂解液中，与300μL肺癌细胞H460的细胞裂解液4℃孵育1小时。同时为了确保只有特异性与金纳米探针结合的蛋白被鉴定出来，设置一个平行样品：将化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮先与细胞裂解液4℃孵育1小时，再加入金纳米探针4℃孵育1小时。孵育结束后，离心分离金纳米探针，并将蛋白通过RIPA强裂解液从纳米探针上洗脱下来，收集蛋白进行10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
对比事先加入化合物和不加入化合物的两条泳道，申请人发现有四个蛋白条带有明显的差异(见图4)。将这四个蛋白条带进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，鉴定出四种蛋白，分别是1——β-热激蛋白90；2——多聚腺苷酸结合蛋白；3——热激蛋白70；4——α-微管蛋白。
实施例7
体外微管聚合实验验证化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮抑制微管的聚合。
化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮溶解在二甲基亚砜中，浓度为10μM，同时以秋水仙素(5μM)和二甲基亚砜做对照组，根据微管聚合实验试剂盒的操作步骤进行实验。结果表明，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮可以抑制微管的聚合，与秋水仙素有相似的作用(见图5)。
实施例8
微管免疫荧光实验验证化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在H460细胞内抑制微管的聚合。
将肺癌细胞H460以1×104的密度接种于48孔板中，用含有10％胎牛血清，2mM L型谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基培养24小时，后分别经1μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮和秋水仙素处理24小时。将细胞用1M的PBS洗一遍，用4％多聚甲醛固定10分钟，再用PBS洗涤3次后，用山羊血清封闭，室温条件下孵育20分钟。之后加入α-微管蛋白的抗体4℃孵育过夜。在用PBS洗三次后，再加入异硫氢酸荧光素(FITC)标记的二抗37℃孵育20分钟，用荧光显微镜进行观察。结果表明，经过的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理的细胞与秋水仙素处理过的细胞有同样的效果，微管都呈点状，表明微管的网络结构被破坏，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理的细胞和秋水仙素一样都起到了抑制微管聚合的作用(见图6a，b，c)。
实施例9
c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化的检测。
将肺癌细胞H460以4×104的密度接种于6cm的培养皿中，用含有10％胎牛血清，2mML型谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基培养24小时后，用浓度为10μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理不同时间(0，12，24，48小时)。用细胞裂解液提取H460细胞总蛋白。用提取的蛋白进行Western blot实验检测磷酸化JNK及总JNK的表达情况。结果表明，在经过2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的作用后，磷酸化JNK的水平有明显提高，且在12小时达到峰值。而同时JNK总水平没有改变。说明2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮可以引起JNK的激活(见图7)。
实施例10
CRAF-1，ERBB2蛋白的降解以及AKT磷酸化水平的下降的检测。
将肺癌细胞H460以4×104的密度接种于6cm的培养皿中，用含有10％胎牛血清，2mML型谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基培养24小时后，用浓度为5μM的化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理不同时间(0，24，48小时)。用细胞裂解液提取H460细胞总蛋白。同时用同样的方法提取被已知的热激蛋白90的抑制剂17-DMAG处理过的细胞总蛋白(处理0，24，48小时)。用提取的蛋白进行Western blot实验检测CRAF-1，ERBB2以及磷酸化AKT的表达。结果表明，化合物2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮与17-DMAG一样都可以引起CRAF-1，ERBB2并抑制AKT的磷酸化(见图8)。
实施例11
按照实施例1-10所描述的方法，鉴定并验证了另一个噻唑烷酮类化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的靶点蛋白。
所述化合物结构式如下：
根据前期的研究结果表明，该化合物也能够选择性的杀死非小细胞肺癌H460细胞(EC50＝0.7μM)及对紫杉醇具有抗药性的H460细胞(EC50＝0.9μM)，而对人的正常成纤维细胞NHFB几乎没有毒性(EC50＞100μM)。
应用本发明所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，首先制备出适用于化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮靶点鉴定的金纳米探针，其结构示意图如下：
然后鉴定出该化合物潜在的靶点为：1——氨甲酰磷酸合成酶；2——亚甲基四氢叶酸脱氢酶；3——β-热激蛋白90；4——热激蛋白70；5——α-微管蛋白。(见图9)。
因为热激蛋白90与微管蛋白是已知的抗癌靶点，所以对这两个靶点进行了验证。
由验证结果可以得出，化合物2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮确实作用于微管(见图10)及热激蛋白90(见图11)，从而起到杀死癌细胞的作用。
Claims (9)
1.一种利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，步骤包括：
(I)金纳米探针的设计及制备
选取含有硫醇基团的化合物或经修饰能连接上硫辛酸的化合物，分别以如下方法连接在金纳米颗粒表面：
①将含有硫醇基团的化合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30±5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4±0.5小时，反应结束后，用盐酸调节pH值至7.0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3～5次，之后在50±5℃，真空干燥金纳米颗粒12±3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；
②以如下方法修饰化合物，得到连接上硫辛酸的化合物，然后再连接在金纳米颗粒表面：
1)在化合物的非活性部位加入一个羟基(5)；
2)将二缩三乙二醇(2)的一个羟基用对甲基苯磺酰氯保护，生成二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)；
3)二缩三乙二醇单对甲苯磺酸酯(3)与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成相应的2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)；
3)2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(4)与加入羟基的化合物(5)发生成醚反应，化合物连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺(6)；
4)连接上2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基邻苯二甲酰胺的化合物(6)与水合肼反应将其上的邻苯二甲酰亚胺基替换成氨基，生成连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇的化合物(7)；
5)硫辛酸与连接有2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙醇(7)的化合物发生偶合反应，生成连接上硫辛酸的化合物(8)；
反应式如下：
6)将上述连接上硫辛酸的化合物(8)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氯金酸水溶液，室温搅拌30±5分钟，之后逐滴加入硼氢化钠水溶液，室温搅拌4±0.5小时，反应结束后，用盐酸调节pH值至7.0，离心取沉淀，分别用甲醇和水洗涤沉淀3～5次，之后在50±5℃，真空干燥金纳米颗粒12±3小时，得到连接有所述化合物的金纳米探针；
(II)金纳米探针的表征
采用高分辨透射电镜、高效液相色谱-质谱确定制备的金纳米探针的形貌特征，选定形貌为球形，粒径分布在2～5nm之间，且化合物在金纳米表面的上载量为0.3～0.6mmol/g的金纳米探针用于靶点鉴定；
(III)金纳米探针的生物活性分析
将步骤(II)选定的金纳米探针加入培养的处于对数生长期的癌细胞中处理48～60小时，以WTS-1方法检测细胞脱氢酶的活性，依据金纳米探针对细胞处理前后的检测结果及对细胞生长百分比的分析，判定金纳米探针是否仍保持修饰前的化合物应有的生物活性；
(IV)运用金纳米探针对设定的化合物进行靶点鉴定
①常规方式培养癌细胞，然后将癌细胞用细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白，待用；
②将步骤(III)所述保持生物活性的金纳米探针与提取的癌细胞总蛋白在4±0.5℃孵育1～1.5小时；同时将设定的化合物分子与提取的癌细胞总蛋白在4±0.5℃孵育1～1.5小时后，再加入步骤(III)所述保持生物活性的金纳米探针，继续在4℃孵育1小时；孵育结束后，分别以15000±1000rpm离心10～30分钟分离金纳米探针，并用RIPA强裂解液和SDS上样缓冲液将蛋白从金纳米探针上解离下来，分别收集蛋白溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；
③对比未加设定化合物和加入设定化合物的两个样品凝胶电泳结果，从电泳谱图中找出金纳米探针特异性结合蛋白的条带，对其进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，鉴定出靶点蛋白的种类。
2.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(I)所述经修饰能连接上硫辛酸化合物选噻唑烷酮类化合物。
3.如权利要求2所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：所述噻唑烷酮类化合物选2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮或2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。
4.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(I)所述含有硫醇基团的化合物选硫醇类化合物。
5.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(II)所述粒径范围为2-4nm，化合物在金纳米表面的上载量为0.4～0.5mmol/g。
6.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(IV)所述设定的化合物选噻唑烷酮类化合物。
7.如权利要求6所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(IV)所述设定的化合物选2-(4-苯甲基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮或2-(2-氯苯基亚氨基)-5-(4-二甲氨基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。
8.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(IV)所述癌细胞为肺癌细胞H460。
9.如权利要求1所述利用金纳米探针来鉴别小分子化合物作用靶点的分析方法，其特征在于：步骤(IV)所述离心时间为15～20分钟。
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