CN102221548B - 淋巴细胞核化学染色表面分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淋巴细胞核化学染色表面分析方法，包括如下步骤：血细胞化学染色载体选择；外周血淋巴细胞标本提取；根据计算机对血细胞图像分析的要求，采用小波变换和经验模式分解的方法提取淋巴细胞核图像的表面纹理特征，并将表面纹理特征与光密度值和图像能量相结合，构成一种多维特征向量，最后用支持向量机对该多维特征向量完成分类识别。实验结果表明，该方法较好地区别了正常人与肝硬化、肝癌病人以及肝硬化与肝癌病人的外周血淋巴细胞，解决了淋巴细胞核染色表面微小变化人眼不能定量分析识别的问题。

Description

淋巴细胞核化学染色表面分析方法

技术领域

本发明涉及一种细胞核表面分析方法，特别是一种淋巴细胞核化学染色表面分析方法。

背景技术

人体血细胞染色后核表面的纹理结构是细胞核内在物质结构的一种反映，正常情况下，不同类型的血细胞和同类型的血细胞在不同分化阶段，都有不同的核纹理结构，如细网状、细沙粒状、紧密条块状等等。而当细胞受病理影响时，核染色质则会出现轻微排列紊乱、方向性发生稍许改变、染色质略为变粗、出现微细裂纹以及细胞黏附异常等等肉眼不易观察到的细微改变。所以通过分析核表面纹理结构，可以获得细胞内部重要的生命活动信息。因此可以说细胞核表面纹理的变化为疾病的诊断及治疗观察提供了重要的分析依据。但是，由于人眼对色彩、粗糙度等分辨能力有较大的局限性，对其细胞核表面的细微变化(如颜色、粗糙度、粒度、网度和染色质方向性等)不能进行准确的量化分析，而且人眼的观察识别还带有很大的主观性和随意性。因此应用计算机图像处理和模式识别技术对血细胞核表面进行分析，给出一定的客观量化数据和进行细胞核纹理的分类识别，对疾病的诊断和治疗观察具有十分重要的意义。

另外，目前广泛应用的血细胞染色检查方法，一般不考虑载玻片表面的光学和化学性质，在载玻片的选取上比较随意。从生物表面化学知识可知，实际上血液中的蛋白质在载体表面的吸附会影响白细胞、血小板等的黏附，从而会影响其形态，普通的载玻片一般不能很好地满足细胞化学染色微量定量分析的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术，而提供一种能满足细胞化学染色微量定量分析的要求，且准确性和重复性较高的淋巴细胞核化学染色表面分析方法。实现淋巴细胞核纹理的分类识别。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、血细胞化学染色载体选择；

(2)、外周血淋巴细胞标本提取；

(3)、小波变换和经验模式分解：用显微镜随机摄取分散在标本中的淋巴细胞，获取淋巴细胞图像，对淋巴细胞图像中的细胞核表面图像作小波变换，提取小波系数矩阵，再用经验模式分解法获取固有模式函数；

(4)、数据融合：选取所述固有模式函数组成矩阵，对该矩阵作奇异值分解得到所述细胞核表面图像的纹理特征值，把该纹理特征值与测得的细胞核表面图像光学特征数据相融合，构成一多维特征向量；

(5)、采用模式识别方法对所述的多维特征向量进行分类识别。

考虑到在作血液涂片细胞分析时载体表面化学性质的一致性以及载体光学性质的一致性，选用分光光度计石英玻璃比色杯的透明面作为所述的血细胞化学染色载体，这样可以满足细胞化学染色微量定量分析的要求。

所述的外周血淋巴细胞标本提取包括以下步骤：

a、取定量的外周血液涂片，干燥后放入已经配置好的混合固定液中进行固定，然后取出，干燥。

b、滴加配好的染色液于血液涂片上，对血细胞进行染色，其染色的基本原理为染色液能与聚合程度不同的DNA、RNA及蛋白质等结合，因染色液与生物大分子的结合强度不同而表现出不同的染色效果；

c、用蒸馏水对血液涂片进行冲洗；

d、用乙醇溶液对血液涂片进行分色处理，处理完毕后晾干，然后用显微镜检查并摄取淋巴细胞图像。

所述的图像光学特征数据包括图像的光密度和图像的能量。具体地，图像光密度可以用红光光密度、绿光光密度、蓝光光密度、平均光密度、最大光密度和累积光密度来表示。各光密度值可代表或反映细胞核内着色的深浅及颜色结构，用于了解核内物质的构成与相对含量。同时测定图像的能量，能量用于分析图像灰度分布均匀程度和图像表面纹理粗细度，图像表面纹理越细，能量就越小，纹理越大，能量就越大。

可以采用多种模式识别的方法对所述的组合特征多维向量进行分类识别，作为优选方案，本发明采用的是支持向量机方法。

所述的外周血淋巴细胞标本提取中的步骤a中所述的固定液组分及体积配比为：

冰醋酸8～10；

甲醇28～31；

无水乙醇59～62。

可以用多种化学染料对血液涂片进行染色，作为优选方案，本发明采用的是甲基绿-派罗林染色液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：该分析方法能满足淋巴细胞化学染色微量定量分析的要求，同时把图像的光密度、图像能量和图像的纹理特征相融合，并用计算机图像处理和模式识别技术对淋巴细胞核表面图像进行分析处理，解决了人眼对淋巴细胞核染色表面微小变化不能进行定量识别的问题，实验结果的准确性和重复性较高，对疾病诊断和治疗观察具有重要意义。实验结果表明，该方法较好地区别了正常人与肝硬化、肝癌病人以及肝硬化与肝癌病人的外周血淋巴细胞。

附图说明

图1为正常淋巴细胞的染色显微图像；

图2为肝癌淋巴细胞的染色显微图像；

图3为肝硬化淋巴细胞的染色显微图像；

图4为肝癌淋巴细胞的另一幅染色显微图像；

图5为图1经小波变换后再经经验模式分解后的第一分量；

图6为图1经小波变换后再经经验模式分解后的第二分量；

图7为图1经小波变换后再经经验模式分解后的第三分量；

图8为图1经小波变换后再经经验模式分解后的第四分量。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

血细胞化学染色载体的选择对实施效果有着显著影响。从生物表面化学知识可知，血液中蛋白质在载体表面的吸附会影响白细胞、血小板等的黏附从而会影响其形态，为尽量减少白细胞在载体上黏附时发生形态的细微变化，在选择载体时，需同时考虑载体表面光学性质的一致性和载体化学性质的一致性。特别重要的是载体光学性质的一致性，推导如下：

设M为被测物质质量；S为象素点面积；r₀为图像背景灰度；r为象素点变化量；由Lambert-Beer定律知：

$M=\frac{S}{E_{\mathrm{\λ}}}\underset{r=0}{\overset{Q}{\mathrm{\Σ}}}f\left(r\right)\lg \frac{r_o}{r}$

式中，λ为入射光波长，单位nm；而

就是积分光密度∑OD。E_λ则为给定波长时吸光物质的吸光系数，在一定状态和条件下为一常数。这个一定状态和条件包括显微镜光程、入射光波长、染色剂和血细胞涂片载体(载片)，所以当显微镜光程和入射光波长给定及染色剂确定后，剩下所要考虑的应当就是载片了。但一般血细胞染色所用的载玻片，其每张玻璃片的表面化学性质和其光学性质都不是一样的，因此普通载玻片一般不能很好满足细胞化学染色微量定量分析的要求，所以我们选用分光光度计石英玻璃比色杯的透明面作血细胞涂片的载体(载片)，满足上式的分析条件，取得较好效果。

载体选择完毕，接下来进行外周血淋巴细胞标本提取，具体步骤如下：首先采集血液样本推制成血液涂片，等血液涂片干燥后放入提前配制好的混合固定液中，固定10分钟后取出，干燥；然后滴加配好的甲基绿-派罗林染液在血液涂片上，对血细胞进行染色，染色时间为15分钟；

本实施例中，固定液的组分及体积配比如下：冰醋酸8～10，甲醇28～31及无水乙醇59～62混合成固定液，作为最佳，用冰醋酸9，甲醇29.5及无水乙醇61.5混合成固定液。

本实施例中，甲基绿-派罗林染液的配制如下：

(1)0.2mol/L乙酸缓冲液

A.冰乙酸1.2ml加蒸馏水到100ml。

B.乙酸钠2.27g溶于100ml水中。

A∶B＝2∶3比例混合使用。

(2)甲基绿-派罗林染液

甲液：2g甲基绿加0.2mol/L乙酸缓冲液到100ml。

乙液：1.0g派罗林加0.2mol/L乙酸缓冲液到100ml。

临用时，甲∶乙＝5∶2混合。

染色完成后，用蒸馏水冲洗血液涂片；最后，用乙醇溶液对血液涂片进行分色并晾干，晾干后，用OLYMPUS CX31摄像显微镜检查血液涂片并摄取其中的淋巴细胞图像，获取的淋巴细胞图像存储在计算机硬盘以便进行处理。这里选取三类不同淋巴细胞标本，正常淋巴细胞的染色图像如图1所示，肝癌淋巴细胞标本取自经临床确诊为病毒性肝炎肝硬化病人外周血，其染色图像如图2和图4所示，肝硬化淋巴细胞标本取自经临床确诊为原发性肝癌病人外周血，其染色图像如图3所示。

本实施例中，血液制成血液涂片后，在偏酸性固定液作用下，核内DNA、RNA及蛋白质等大分子结构、表面性质均发生了变化。根据核酸的理化性质，在酸性条件下，嘌呤碱糖苷健易断裂，核酸受损，正常DNA超螺旋结构变得松弛，分子大小和分子构象发生改变；核酸解离而带电。因此染料与DNA的结合，无论是插入方式和沟槽方式，与用乙醇或10％甲醛生理盐水作固定液的细胞相比，核表面会出现更多的色彩与纹理。在统一的化学染色条件下，肝癌、肝硬化疾病时受损淋巴细胞核中生物大分子物质性质已发生改变，因而与染料结合后所产生的核表面色彩及纹理与正常淋巴细胞比较则出现一定的差异。

对淋巴细胞核图像的处理有很多数学方法，本实施例采用小波变换(WaveletTransform)和经验模式分解(Empirical Mode Decomposition EMD)的方法对淋巴细胞核图像进行处理。为保证小波变换的有效性和运算速度，首先，从淋巴细胞核图像分割出40像素×40像素的核表面图像作为小波变换的处理单元。提取图像在水平、垂直和对角方向的分量构成小波系数矩阵，取小波系数矩阵的数据做平均运算，得到一个长序列并对该长序列作经验模式分解。通过经验模式分解，该长序列被分解成有限个具有不同特征尺度的数据序列，其中，每一个序列为一个固有模式函数(intrinsic mode function，IMF)。由于经验模式分解出来的前几个固定模式函数分量往往集中了原始信号最显著和最重要的信息，如图5至图8所示，是把正常淋巴细胞作为处理样本所得到的前4个固定模式函数分量。因此这里选取前面4个固定模式函数分量组成矩阵，对该矩阵作奇异值分解可以得到小波纹理特征值。

为深入考察细胞内生物大分子的表面几何复杂性及其理化性质的变化与细胞染色后核表面纹理和颜色结构变化之间的关系，进一步地，对淋巴细胞核表面图像的光密度和能量进行测定。具体地，可以测定红光光密度(density<red>)、绿光光密度(density<green>)和蓝光光密度(density<blue>)，平均光密度(density<mean>)、最大光密度(density<max>)和累积光密度(IOD Integrated Optical Density累积光密度是测量被测图像面积内各像素点光密度之和)。光密度值可代表或反映细胞核内物质着色的深浅及颜色结构，用于了解核内物质的构成与相对含量，而能量(energy E)用于分析图像灰度分布均匀程度和图像表面纹理粗细度，图像表面纹理越细，能量就越小，纹理越大，能量就越大。将图像光密度、图像能量和已经提取的小波纹理特征值想融合，构成一个图像组合特征多维向量，各种不同淋巴细胞核表面的差异性都隐含在该特征向量当中。最后用支持向量机方法对该组合特征多维向量进行模式识别，区分出不同类型的淋巴细胞核纹理。另外，在本实施例中，还测定了淋巴细胞核图像的对比度(contrast C)、均匀性(homogeneity H)、相关性(correlation R)等，但在分类识别测试试验中，发现它们对提高淋巴细胞核表面图像的分类识别率影响不是很大，因此最后舍去了。

本实施例中，选取了600多幅淋巴细胞核表面图像作为处理数据，三类不同淋巴细胞的互相识别率均达到了85％以上，具体见下表：

细胞核表面组合特征识别结果

可见图像组合特征多维向量作为识别淋巴细胞核染色表面变化新的特征量，可以有效地反映不同淋巴细胞核表面的差异。可以看出，将淋巴细胞核图像的表面纹理特征、能量与表达反应强度或物质含量的测量参数光密度值等结合起来构成组合特征，可以同时客观地获得染色淋巴细胞核表面的更多特征信息和核内一些物质(如DNA，RNA等)的量及结构信息，克服了淋巴细胞核染色表面微小变化人眼不能定量区分识别的困难，较好地分类识别了正常与肝癌、肝硬化患者以及肝癌与肝硬化患者的外周血淋巴细胞。

Claims (7)

1.淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、血细胞化学染色载体选择；

(2)、外周血淋巴细胞标本提取；

(3)、小波变换和经验模式分解：用显微镜随机摄取分散在标本中的淋巴细胞，获取淋巴细胞图像，对淋巴细胞图像中的细胞核表面图像作小波变换，提取小波系数矩阵，再用经验模式分解法获取固有模式函数；

(4)、数据融合：选取所述固有模式函数组成矩阵，对该矩阵作奇异值分解得到所述细胞核表面图像的纹理特征值，把该纹理特征值与测得的细胞核表面图像光学特征数据相融合，构成一多维特征向量；

(5)、采用模式识别方法对所述的多维特征向量进行分类识别。

2.根据权利要求1所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤(1)中采用分光光度计石英玻璃比色杯的透明面作为所述的血细胞化学染色载体。

3.根据权利要求1所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的外周血淋巴细胞标本提取包括以下步骤：

a、取外周血液涂片，干燥后放入混合固定液中进行固定，然后取出，干燥；

b、滴加染色液于上述血液涂片上；

c、对血液涂片进行蒸馏水冲洗；

d、对血液涂片进行乙醇溶液分色，晾干。

4.根据权利要求3所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤a中所述的固定液组分及体积配比为：

冰醋酸8～10份；

甲醇28～31份；

无水乙醇59～62份。

5.根据权利要求3所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤b中所述的染色液为甲基绿-派罗林染色液。

6.根据权利要求1所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤(4)中所述的细胞核表面图像光学特征数据包括图像光密度和图像能量。

7.根据权利要求1所述的淋巴细胞核化学染色表面分析方法，其特征在于：步骤(5)所述的模式识别方法采用支持向量机。

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