CN102220268B - 一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1及其应用。所述的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens），保藏号为CCTCC NO：M2011110。本发明提供的荧光假单胞菌可用于生产具有耐有机溶剂性质的脂肪酶，能够广泛应用于工业上生物柴油的制备以及利用有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，对筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域具有十分重要的意义。

Description

一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体是涉及一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1（荧光假单胞菌，Pseudomonas fluorescens）以及选育方法和产酶条件初步优化。

技术背景

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物中，它可将脂肪分解成甘油和脂肪酸，是一类特殊的酯键水解酶。它主要催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换及合成等，反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶作为一种重要的生物催化剂，已经被广泛应用于食品加工、医药研制、环境保护、造纸工业和生物产油的生产等领域。微生物来源的脂肪酶具有比植物动物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围和对底物的专一性类型，生产条件易于控制，成本低，便于进行工业生产，获取高纯度制剂，以及加上微生物脂肪酶在酶学理论研究和实际应用中的作用而得到广泛研究。据文献报道，自然界中的许多微生物都产脂肪酶，包括有黑曲霉、白地霉、毛霉、巢子须霉、假单胞菌等。

近年来，非水相酶学的研究又进一步拓展了脂肪酶的应用领域，在水相中，脂肪酶通常只能催化水解反应的进行，而在有机相中，它却能催化各种合成反应：如酯化、酯的醇解、酯的氨解和酯的酸解等。然而有机溶剂会使酶变性或使酶活力下降，因此寻找耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。至今，分离得到的耐有机溶剂的脂肪酶产生菌为数不多，其中包括有Bacillus sphaericus 205y、Bacillus sp.，Yarrowiasp.等，它们大部分是来自于土壤、深海以及沿岸沉积物中。

与国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发较晚，而且工业化的微生物脂肪酶制剂种类有限，因此，筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域是十分必要的。随着遗传工程的应用，酶的固定化技术及界面酶学和非水酶学的研究与应用，微生物脂肪酶将使诸多的传统产业面临新的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一株耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其产酶条件初步优化。该脂肪酶高产菌株C1可以产生能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶，对于工业上生物柴油的制备以及利用有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，对筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域具有十分重要的意义。

本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1，所述耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），于2011年4月7日，保藏于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2011110，其16SrDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1的形态学特征是：该菌株属于革兰氏阴性弯曲短杆菌，两端钝圆，无芽胞，大小为约0.8-1.2μm；在普通固体LB培养基表面生成淡黄色半透明菌落，表面光滑隆起，湿润，边缘整齐，较粘稠，易挑取，菌落大小均一，平均直径为1.5-2mm；在含有甘油三酯的固体培养基表面培养48-72h，菌落周围可形成透明圈；在肉汤中增菌培养72h出现均匀浑浊菌落生长，沿管壁表面有明显的菌膜或璧环。

本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1用于生产能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶。

    上述所说的生产能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶的方法步骤是：将耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1接种至种子培养基培养，将培养获得的种子液按1%转接于发酵培养基，28-30℃、pH7.0-8.5，200-220rpm摇床培养11-24h，获得发酵液离心留上清。

所述的种子培养基按组分重量（g）/培养基体积（mL）的百分比计，成分和比例如下：葡萄糖2%，蛋白胨2.5%，(NH₄)₂SO₄0.5%，K₂HPO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，橄榄油 1.0%，pH自然。

在菌株发酵培养的过程中，培养基的组成和成分（碳源、氮源、碳氮比），培养的条件（温度、时间、pH、转速）都对菌株发酵生产脂肪酶有显著影响。通过优化，确定最佳培养条件是：发酵培养基中，碳源为葡萄糖；氮源为复合氮源蛋白胨和硫酸铵；其中培养基按重量（kg）/体积（L）的百分比计，葡萄糖的使用量为1%，蛋白胨的使用量为2%，硫酸铵的使用量为0.5%；培养时间为15h，培养温度为30℃、初始pH为8.0、接种量为1%、转速为200rpm。

    本发明的的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1采用常规的斜面传代保藏法，此方法是将本发明菌种接种于PDA斜面培养基表面，30℃恒温培养箱倒置培养1-2天，再于4℃下低温保藏，可存放3个月左右；其PDA斜面培养基成分如下：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。

    本发明采用对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP）法来测定脂肪酶的活力大小，主要以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化反应，以产生的有色产物对硝基苯酚（p-NP）在410nm 波长下的吸收值来计算酶的活力。1个活力单位定义为：标准实验条件下，每分钟催化每毫升 p-NPP释放1μmol p-NP所需的酶量。该法为国外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便、反应快、灵敏度高，能够进行连续的定性和定量的检测，是一种精确而且高效的活力测定方法。

    本发明的显著优点：本发明的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）C1分离来自于汽车修理厂的含油污泥，具有良好的培养脂肪酶的生态环境，其生产的脂肪酶具有活力高，产量大的优点，并且可以耐受高浓度的甲醇、乙醇、正己烷等多种有机溶剂，对利用有机相催化反应生产多种高价值的产品，特别是工业上生物柴油的制备具有深远的意义。

附图说明

图1 是本发明菌株C1经革兰氏染色后在显微镜下的菌体形态。

图2 是本发明菌株C1以16SrDNA同源性为基础的系统发育树。

图3 是本发明菌株C1的生长曲线和产酶曲线。

图4 是氮源对产酶的影响，其中1：尿素2：硫酸铵3：蛋白胨4：酵母膏+硫酸铵5：牛肉膏+硫酸铵6：蛋白胨+硫酸铵。

图5是碳源对产酶的影响， 其中1：麦芽糖2：葡萄糖3：蔗糖4：乳糖5：可溶性淀粉6：环糊精。

图6是转速对产酶的影响。

图7是初始pH对产酶的影响。

图8是接种量对产酶的影响。

图9是温度对产酶的影响。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

除特别说明外，本发明中培养基组分都按组分重量（g）/培养基体积（mL）的百分比计。

实施例一：菌种的筛选

（1）样本采集

来自于南京金陵石化炼油厂附近土壤、南京雨润生肉销售点含油污泥、中国药科大学食堂长期积油土壤、粮油食品站油桶上油垢、汽车维修厂含油污泥等，共30个样本，用来分离选育耐有机溶剂的脂肪酶高产菌。

（2）富集培养 

称取2g土壤样本悬浮于20mL无菌水中，振荡制成土壤悬液，充分混匀并静置10min后，吸取3mL上清移入含有30mL富集培养基（富集培养基: 酵母膏 0.02% ，Na₂HPO₄ 0.35%，K₂HPO₄ 0.15%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，NaCl 0.05%，橄榄油1.0%，pH 7.0）的无菌三角瓶中，30℃、220rpm下，摇床培养72h后，无菌操作转接300μL浑浊菌液到新鲜的富集培养基中，连续富集3次。

（3）平板初筛和复筛

 吸取1mL富集培养液用无菌水洗涤2次后，按10^-4、10^-5、10^-6、10^-7配制不同梯度稀释液，分别取稀释液20μL均匀涂布平板初筛培养基（初筛培养基：酵母膏0.1%，蛋白胨0.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.2%，橄榄油乳化液1.2%，K₂HPO₄ 0.1%，KCl 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，琼脂1.5%，罗丹明B（0.1 mg/mL）10%，pH 7.0），倒置恒温培养箱30℃培养72h，挑选有黄色变色圈或透明圈菌落，经划线培养获得单菌落，PDA试管4℃保藏供平板复筛。

将初筛菌种取一环接种于LB培养基，30℃、220rpm活化12h，取1mL菌液梯度稀释至10^-5，取20μL稀释液均匀涂布于平板复筛培养基上（复筛培养基：蛋白胨1.0%，蔗糖0.5%，橄榄油乳化液1.2%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%，K₂HPO₄ 0.1%，KCl 0.1%，琼脂1.5%，pH 7.0），倒置恒温培养箱30℃培养72h，挑选透明圈较大的菌株进行摇瓶复筛。

（4）摇瓶复筛发酵

从复筛平板上挑选出的透明圈较大的菌株，取一环接种于含有50mL发酵培养基的无菌三角瓶中，30℃、200rpm，摇床培养24h。收集发酵液于4℃、12000rpm，冷冻离心20min，回收上清液测定酶活，以对硝基苯棕榈酸酯为底物，测定对硝基酚的产生量来计算脂肪酶酶活。经过富集，平板初筛、复筛，摇瓶复筛发酵，从30份土样中共分离得到33株有透明圈的菌株，经复筛发现有15株产酶特性较佳的菌株(>0.05U/mL)，其中有3株产酶能力相对最高(> 0.10U/mL)，在复筛培养基中生长快，透明圈较大，经反复培养产酶特性均很稳定，结果见表1。

表1   菌种筛选结果

产酶情况                   低                         中                       高
	酶活（U/mL）       0-0.05                0.05-0.10             > 0.10
菌株数                    18                         12                       3

实施例二：菌株有机溶剂耐受性测定

将实施例一中获得的15株脂肪酶高产菌株，分别从其PDA保藏斜面中挑菌一环接种至含有30mL LB培养基的无菌三角瓶中，30℃、220rpm，摇床培养复苏12h，移取复苏后的200μL种子液梯度稀释至10^-7，取15μL稀释液分别涂布含有5%、10%、15%、25%甲醇，5%、10%、15%、25%乙醇，1%、5%、10%正己烷，1%、5%、10%二甲苯等有机溶剂的平板复筛培养基和不含任何有机溶剂的对照复筛平板培养基，倒置恒温培养箱30℃培养72h，观察筛选板与对照板中菌株生长速度和生长状态的差异，结果见表2，从表2可以看出，在所有受试菌株中，菌株C1在含有高浓度的甲醇、乙醇、正己烷的筛选平板中生长状况都相对稳定，最高能耐受15%的甲醇和乙醇，在5%的正己烷中也能生长，综合考虑菌株对于这四种有机溶剂的耐受程度以及出于工业生产上对菌株甲醇耐受性的要求，故选择菌株C1作为后续研究工作的实验菌株。

表2  菌株的有机溶剂耐受性检测结果

（生长旺盛：+++ 生长正常：++  生长一般：+  不生长：-  对照平板生长状况均为++++）

实施例三：菌种的鉴定

（1）       菌株形态学鉴定

菌株C1属于革兰氏阴性弯曲短杆菌，两端钝圆，无芽胞，大小为约0.8-1.2μm，见图1；在普通固体LB培养基表面生成淡黄色半透明菌落，表面光滑隆起，湿润，边缘整齐，较粘稠，易挑取，菌落大小均一，平均直径为1.5-2mm；在含有甘油三酯的固体培养基表面培养48-72h，菌落周围可形成透明圈；在肉汤中增菌培养72h出现均匀浑浊菌落生长，沿管壁表面有明显的菌膜或璧环。

（2）16SrDNA序列同源性分析法鉴定和系统发育树的构建

 利用通用引物PCR扩增其16SrDNA 序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，其结果为一段大小为1329bp的16SrDNA基因组序列，将16SrDNA序列克隆结果提交GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），对测序结果进行BLAST比对，与Pseudomonas fluorescens种的多株菌相似度达到99%；选取该种属的9个菌株的16SrDNA序列，经Clustal X2多序列联配，利用MEGA 5.7 构建系统发育树，如图2显示相关假单胞菌的进化地位，鉴于16SrDNA的同源性比较结果，菌株C1鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。

实施例四：菌株发酵条件优化

（1）菌株C1生长曲线和产酶曲线的测定

从菌株C1的PDA保藏斜面挑菌一环接种于种子培养基，30℃、220rpm过夜培养，按1%转接于50mL含有发酵培养基的无菌三角瓶中，30℃、220rpm摇床培养并实时监测，从接种0min时开始每隔1h从发酵培养基中取样1mL，使用752型紫外可见分光光度计测定其OD₆₀₀，并留样1mL以备酶活测定之用，结果见图3，由图中可以看出，1-4h为它的生长延迟期，4-11h为它的生长对数期，11-15h为它的生长稳定期，15h以后为它的生长衰退期。该菌从7h开始产酶量逐渐增大，12h开始呈指数增长至稳定期后期15h达到峰值，之后产酶量开始下降。故确定发酵培养的时间为15h左右。

（2）培养基氮源对产酶的影响

在发酵培养基的基础上，分别向发酵培养基中添加2%的蛋白胨、硫酸铵、尿素以及复合氮源酵母膏和硫酸铵，蛋白胨和硫酸铵以及牛肉膏和硫酸铵，30℃、220rpm，摇床培养15h，取发酵液上清测定酶活力，由图4中可知，以上几种氮源对酶活的影响差异较大，加入复合氮源蛋白胨和硫酸铵时产酶效果最好，酶活可以达到0.26U/mL；单一氮源蛋白胨次之，酶活能达到0.23U/mL左右；而硫酸铵、尿素产酶效果较差，说明了有机氮源比无机氮源更有利于该菌株产酶。所以，确定复合氮源蛋白胨和硫酸铵为最适氮源。

（3）培养基碳源对产酶的影响

    在确定了最适氮源之后，分别加入1%的麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、环糊精等碳源，30℃、220rpm，摇床培养15h，取发酵液上清测定酶活力，由图5可知，除了麦芽糖以外，其他的碳源对产酶都有一定的促进作用，其中以葡萄糖作为碳源时产酶效果最好，可以使活力达到0.30U/mL以上，说明快速碳源更有利于菌株C1的生长。故确定葡萄糖为最适碳源。

（4）转速对产酶的影响

将摇床转速分别设为150rpm、180rpm、200rpm、220rpm、250rpm时进行发酵培养，结果如图6所示，由于摇床转速过慢或过快均会影响到发酵过程所需的通气量和培养基溶液中的溶氧量，从图中可以看出，转速在200rpm时酶活为最大，故确定转速为200rpm时为该株菌的最佳转速。

（5）培养基初始pH对产酶的影响

用1.0mol/L的HCl和1.0mol/L的NaOH调节发酵培养基初始pH分别为4.00、5.00、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00，30℃培养15h，测定发酵液上清酶活，结果如图7所示，由图中数据可知，pH从4.00开始逐渐增大，在pH8.00时酶活达到峰值，之后，酶活就缓慢降低，可能是因为在产脂肪酶的过程中，不断消耗橄榄油而产生脂肪酸，致使培养基偏酸性，故初始培养基需要偏碱性来稍微中和发酵过程中的pH环境。故确定pH8.0为其最适pH。

（6）接种量对产酶的影响

分别按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的比例接种种子液进行发酵培养，结果如图8所示，接种量偏小生物量增长缓慢，发酵周期延长，导致菌体活力降低，不利于产酶，接种量在1%时酶活最大，可以达到0.28U/mL，当接种量大于1%后，接种量越大，酶活越小，由于接种量过大，会导致菌体过快增长和带入过多的种子培养代谢物，使发酵微生物容易衰老，不利于稳定产酶。说明其最适接种量为1%。

（7）培养温度对产酶的影响

在以上实验的基础上，采用改良的发酵培养基，温度分别设为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、37℃进行摇瓶发酵，结果如图9所示，由图中可知，随着温度的增高，酶活是逐渐增大的，在30℃时达到最大值，超过30℃之后，酶活迅速下降，37℃时酶活几乎为0。故确定30℃为其最适温度。

本发明所说的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）C1，已于2011年4月7日，提交位于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2011110。

                           SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国药科大学

 

<120>  一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1329

<212>  DNA

<213>  Pseudomonas fluorescens

 

<400>  1

ctcttgagag cggcggacgg gtgagtaaag cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa     60

 

cgttcggaaa cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg    120

 

gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta atggctcacc    180

 

aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg    240

 

tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc    300

 

agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa    360

 

gggcattaac ctaatacgtt agtgttttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact    420

 

ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta    480

 

aagcgcgcgt aggtggtttg ttaagttgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact    540

 

gcattcaaaa ctgactgact agagtatggt agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt    600

 

gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actaatactg    660

 

acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg    720

 

taaacgatgt caactagccg ttgggagcct tgagctctta gtggcgcagc taacgcatta    780

 

agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc    840

 

gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt    900

 

gacatccaat gaactttcta gagatagatt ggtgccttcg ggaacattga gacaggtgct    960

 

gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac   1020

 

ccttgtcctt agttaccagc acgtaatggt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa   1080

 

ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggcctgg gctacacacg   1140

 

tgctacaatg gtcggtacag agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccacaaaac   1200

 

cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat   1260

 

cgcgaatcag aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac   1320

 

catgggagt                                                      1329

 

 

 

 

Claims (3)

1.一株耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1，其特征在于：所述耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），其保藏号为CCTCC NO：M2011110，其16SrDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1在生产耐有机溶剂的脂肪酶中的应用。

3.一种生产耐有机溶剂的脂肪酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1接种至种子培养基培养，将培养获得的种子液按1%转接于发酵培养基，28-30℃、pH7.0-8.5，200-220rpm摇床培养11-24h，获得发酵液离心留上清；所述的种子培养基按g/mL的百分比计，成分如下：葡萄糖2%，蛋白胨2.5%，(NH₄)₂SO₄0.5%，K₂HPO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，橄榄油 1.0%，pH自然；所述的发酵培养基中，碳源为葡萄糖；氮源为复合氮源蛋白胨和硫酸铵；其中培养基按g/mL的百分比计，葡萄糖的使用量为1%，蛋白胨的使用量为2%，硫酸铵的使用量为0.5%；发酵温度为30℃，发酵周期为15h，pH8.0，转速为200rpm。

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