CN102215866A - 疫苗制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

一种液体或冷冻液体组合物，所述组合物包含：改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物以及甘露糖醇，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。甘露糖醇可以在0至+10℃下或在冷冻液体组合物中、例如在-10℃至-30℃或-20℃至-23.5℃之间提供稳定效应。MVA可以在哺乳动物、优选为人类中用作疫苗，用在基因治疗、病毒治疗、免疫治疗或癌症治疗中。

Description

疫苗制剂及其应用

发明领域

本发明涉及病毒和基于病毒的疫苗的稳定剂型。在低于水的冰点的温度下使病毒稳定的难点是在冷冻和融化过程中防止结构和功能组分的物理破坏。为了确保储存期间的稳定性，感染性病毒的原种通常储存在≤60℃下。此外，病毒的冷藏(例如5-8℃)制剂可能具有有限的稳定性。

发明一般背景

改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒属(Orthopoxvirus)的高度减毒的成员。被工程化改造以表达外源基因的痘病毒是在生物医学研究中用于靶蛋白合成和疫苗开发的公认工具。它们的有利特性包括对重组DNA的大包装能力、靶基因表达的精确的病毒特异性控制、在宿主中缺乏持久性或基因组整合、作为疫苗的高免疫原性以及载体和疫苗容易生产。

在安全性顾虑主导的人类中复制缺陷型病毒的开发后，MVA作为痘苗病毒(VV)天花疫苗的替代物出现。在鸡胚成纤维细胞中传代超过570代之后，MVA失去了VV的广谱细胞宿主范围，在许多哺乳动物来源的细胞、包括人类细胞中不能有效生长。MVA已经用于超过100,000人的初次天花疫苗接种而没有严重问题，并且在试验动物中测试后被认为是无致病力的。

对于大多数目的来说，MVA载体的产生需要来自质粒的单一基因组插入片段，该片段带有一个或两个置于VV特异性启动子控制下的重组基因。在MVA基因组或编码VV蛋白胸腺嘧啶核苷激酶或血细胞凝集素的基因座中天然存在的缺失位点，被用作插入重组基因序列的位点。

许多早期研究致力于开发对抗人类多种病毒感染的MVA候选重组疫苗，所述多种病毒包括引起AIDS、流感、早期儿童呼吸道疾病、麻疹、日本脑炎、登革热或疟疾的病毒。因为迫切需要对抗AIDS的有效疫苗，产生免疫缺陷病毒抗原的重组MVA是在人类中作为候选疫苗而被评估的第一批载体病毒之一。

病毒在其天然环境之外通常是不稳定的，所述环境在细胞区室与细胞外流体之间可能相当不同。如果某些条件不能维持，纯化的病毒可能不能正常发挥作用或保持可溶。此外，病毒滴度可能受到蛋白水解、聚集和亚最适缓冲条件的影响。例如，在疫苗接种中使用的纯化病毒通常需要储存较长时间，同时保持其原始结构完整性和/或活性。储存“货架寿命”的范围可以从数周到一年以上不等，并依赖于病毒的性质和使用的储存条件。

为了确保稳定性，治疗性病毒制剂一般作为冻干物质提供，其在临使用前溶解在独立包装的水溶性稀释剂中；然而，这种方法增加了制造成本，并牵涉不正确给药的增加风险，因为冻干蛋白需要在临使用前溶解，并且经常在冻干过程后观察到感染性滴度的损失。可选地，治疗性病毒制剂可以作为溶液提供，其含有用于增加稳定性的添加剂。例如，已经提出了可用于配制蛋白溶液的添加剂例如游离氨基酸(例如亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、精氨酸和组氨酸)。一些目前在市场上可获得的病毒制剂含有蛋白质作为稳定剂。人血清白蛋白(HSA)或纯化的明胶可用于抑制病毒溶液中的化学和物理变化。但是，添加这些蛋白牵涉用于除去病毒污染的复杂过程。此外，它们可能产生强过敏反应，其限制了它们的应用。

液体病毒制剂通常作为冷冻固体储存。常规的深低温保藏法利用各种添加剂来促进玻璃化。玻璃化是通过快速移除或添加热量或通过与添加剂混合，将材料转变成不含任何晶体结构的玻璃样无定形固体的过程。玻璃状固体的固化发生在玻璃化转变温度下(由于过冷现象，其低于熔化温度T_m)。在低温生物学中使用或由生活在极地区域的生物体天然产生的添加剂被称为低温保护剂。常规的低温保护聚焦于获得对生物材料的长期储存最为有利的固体状态，即聚焦于从液体向固体状态的转变。

然而，本研究令人吃惊地发现，一旦获得固体冷冻状态后，病毒组合物可能不稳定。

发明概述

本发明的第一方面提供了液体或冷冻液体组合物，其包含：

(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物；以及

(b)甘露糖醇，

其中(b)是组合物的唯一稳定剂。

本发明的组合物是稳定的。

甘露糖醇通常在冻干病毒疫苗剂型中用作增量或结块剂。例如，Maa等(2004，J.Pharm.Sci.93(7)：1912-1923)公开了包含甘露糖醇、葡聚糖和肌醇的流感疫苗喷雾冷冻干燥剂型。作者主要使用甘露糖醇作为吸湿剂，但是也假设通过增加脱水粒子的机械强度而改进疫苗稳定性。

在冻干的基于MVA的疫苗中使用甘露糖醇作为稳定剂，在本技术领域中是已知的。Zang等(2007，Chem.Res.Chinese U.，23(3)：329-332)描述了包含海藻糖、甘露糖醇、葡聚糖和肌醇的稳定的冻干MVA疫苗组合物。据报道，海藻糖和葡聚糖促进蛋白质天然结构的保护，而甘露糖醇和肌醇据说起到自由基氧化抑制剂的作用。

甘露糖醇已被用于液体疫苗剂型中，包括基于MVA的疫苗。美国专利申请No.11/202,516在其一般性公开内容中将甘露糖醇与海藻糖和/或葡萄糖的组合列于可能的赋形剂中。然而，没有描述所预期的甘露糖醇的性质。同样，美国专利申请No.10/379,572公开了口服MVA-天花疫苗剂型，其任选共同包含甘露糖醇以及其他赋形剂包括AFFA(一种营养级鱼油)、羟乙基淀粉和甘油。同样地，没有描述甘露糖醇的所预期的功能性质。美国授权专利7,256,037描述了MVA液体剂型，其任选包含甘露糖醇作为等渗剂。

在液体和冷冻液体病毒疫苗组合物中使用甘露糖醇作为稳定剂，也已有报道。在WO 2001/066137和WO 2005/052116中，叙述了甘露糖醇由于既是低温保护剂又是自由基清除剂而将其作为病毒稳定剂。WO2001/066137也陈述了组合物的病毒可以任选是痘苗病毒。此外，美国专利4,147,772也叙述了甘露糖醇作为液体疫苗剂型的稳定剂。然而，这些公开都没有使用甘露糖醇作为唯一稳定剂。相反，稳定性是使用可以包含甘露糖醇的赋形剂的组合而获得的。

使用“变体”，我们是指病毒基因组不具有与改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)(GenBank登记号AY603355，VRL 2004年5月15日)100％的核酸序列同一性，但仍然能够赋予对天花的免疫性并感染鸡胚成纤维细胞，同时不能在人类HeLa细胞系中复制。例如，基因组可以包含与MVA的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列，更优选与所述核酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一。

百分同一性可以通过本技术领域公知的方法来确定，例如使用Expasy实验室网站上的LALIGN程序(Huang和Miller，Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357)，使用整体比对选项(global alignment option)、计分矩阵(scoring matrix)BLOSUM62、孔间隙罚分(opening gap penalty)-14、扩展间隙罚分(extending gap penalty)-4的参数。

使用“衍生物”，我们是指包含基因组插入、缺失和/或取代的重组MVA。

使用“稳定的”，我们是指在8℃±2℃或-23℃±5℃下储存4周后，组合物的病毒滴度为使用前原始病毒滴度的至少20％，优选为原始感染性的至少30％或40％或50％或60％或70％或80％或85％或90％，最优选为原始病毒滴度的至少95％、96％、97％、98％或99％。优选情况下，在储存至少3个月后并且优选在储存6个月、1年、2年、3年或4年后，最优选在储存5年或更多年后，组合物的病毒滴度维持在该/这些水平上。

使用“稳定剂”，我们是指与缺乏某种试剂的相同组合物相比，促进病毒滴度维持的试剂。典型情况下，可以在冷冻储存的一个月至几个月内的比较性研究中检测不稳定性。然而，由本发明的试剂提供的稳定性效应可能扩展到组合物的整个使用寿命，其可以是5年或更长时间。优选情况下，在8℃±2℃或-23℃±5℃下储存4周后，包含稳定剂的组合物与不含稳定剂的相同组合物相比，具有高至少20％的病毒滴度，更优选高至少30％或40％或50％或60％或70％或80％或85％或90％的病毒滴度。优选情况下，在储存至少3个月后并且优选在储存6个月、1年、2年、3年或4年后，最优选在储存5年或更多年后，包含稳定剂的组合物的病毒滴度与不含稳定剂的相同组合物相比，维持在该/这些水平上。使用“稳定剂”，我们不包括典型的药物组合物赋形剂，例如(但不限于)防腐剂、缓冲剂、抗微生物剂、增量/填充剂、黏度调节剂、等渗剂、去污剂、乳化剂和表面活性剂。

相反，使用“稳定剂”，我们包括了简单的糖例如蔗糖、右旋糖、葡萄糖和果糖，糖醇/多元醇例如甘油、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和肌醇，以及血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)。

病毒滴度可以使用本技术领域已知的任何标准技术，例如噬菌斑测定法(在适合时)或TCID₅₀测定法等来测量。在病毒噬菌斑测定法中，在包含在某些营养培养基中的细胞培养物中形成可见的结构。通过在细胞培养物中繁殖，病毒产生被称为噬菌斑的细胞破坏区。这些噬菌斑可以凭视觉检测，有时使用裸眼，有时通过其他技术例如染色、显微术、红细胞吸附或免疫荧光，以确定病毒滴度。

TCID₅₀(组织培养感染剂量50)测定法测定当接种到大量易感组织培养物中时将感染50％的个体培养物的感染性因子、例如病毒的量。

为了测定TCID₅₀，按照例如基本上如下所述的US 5,391,491的方法(含有或不含血清)制备鸡胚胎细胞(CEC)。将微孔板接种有100μlCEC悬液，浓度为5x10⁵±20％个细胞/ml。将板在36℃±2℃下在CO₂培养箱中温育过夜。

稀释前，将样品和对照制剂(对照)用超声波处理。将样品和对照以10倍的步级在细胞培养基中稀释，产生覆盖整数对数或半对数步级的连续稀释液。稀释步级的适合数量取决于预计的病毒滴度。重组MVA空白对照样品从未稀释的样品开始测试。

分别将100μl每种制备的样品或对照稀释液转移8次到含有CEC单层的制备好的微孔板中。另外8个孔用细胞培养基接种，作为阴性(细胞)对照。随后将微孔板在36±2℃下在CO₂培养箱中温育5±1天。

将微孔板的孔在倒置光学显微镜下筛选细胞层中的局部病变(由MVA引起的细胞病理效应(CPE))。从每个稀释度下显示出CPE的孔的百分数计算TCID₅₀。

如果细胞对照没有CPE并且阳性对照的病毒滴度在理想值的范围内，测定被视为有效。TCID₅₀的统计计算按照已知算法(例如Reed&Muench，1938，Am.J.Hyg.，27：493-497)，例如适合的计算机程序进行计算。典型情况下，单独地对一个样品的双份或多份测定值进行计算。所有有效的单个结果的算术平均值使用下列公式计算：

$\stackrel{\‾}{X}=\frac{1}{n}*\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{X}_i|$

X＝样品病毒滴度的算术平均值[TCID₅₀/ml]

X_i＝样品病毒滴度的有效的单个结果[TCID₅₀/ml]

n＝单个测定的数量

用于冷冻食品的长期储存的常规冰箱或冷室，通常也用于储存活疫苗。它们被设计以≤-15℃运行，但是通常达到-18℃至-26℃之间的温度。

疫苗组合物也可以储存在低于常规冰箱的温度下，例如-80℃(在用于生物材料的长期储存的工业冰箱中)或-160℃下(在液氮中)。将疫苗储存在常规的冷藏温度(例如2℃至8℃)或环境温度下，也可能是优选的。

由于耗电量增加以及用于冷冻的化学物质的生产/释放，疫苗的冷冻储存既昂贵又破坏环境。特别是在气候炎热的地区，特别是在需要维持从制造实验室到使用地点的冷藏线路的情况下，冷藏可能被证明是不充分的或可能被中断。因此，优选提供稳定耐热的疫苗，其能够在意外暴露于高温时抵抗变质。即使按照极端严格的储存和运输限制，也不总是能够避免疫苗在其储存和运输过程中暴露于高温。这可能导致这些疫苗的病毒效价的丧失并因此丧失其活性。因此，希望提供也能在高于冷藏温度下提高病毒稳定性的添加剂。

优选情况下，当组合物处于固体状态下，例如当组合物低于冰点温度时(即冷冻液体组合物)，甘露糖醇为组合物的病毒提供稳定效应。优选情况下，当组合物不处于固体状态下，例如当组合物高于冰点温度时(即液体组合物)，甘露糖醇也提供稳定效应。优选情况下，组合物的甘露糖醇可以在10℃至0℃之间、例如8℃至2℃之间、6.5℃至3.5℃之间或5℃至3℃之间的储存温度下提供稳定效应。

甘露糖醇可以在组合物的重结晶窗口中提供稳定效应。术语“重结晶窗口”是指在给定压力下，一种晶体结构(例如在冰或笼形水合物中)能够转变成不同的晶体结构、从无定形结构到晶体结构或从晶体结构到无定形结构的温度范围。这种物理转变对悬浮或包含在冷冻液体中的材料产生机械应力例如压缩或剪切。在中低温度(例如≤-15℃和≥-28℃)下保护病毒免于失活的重要因素，是在冷冻和储存过程中防止结构和功能组分的变性或破坏。

术语“重结晶”是指固态液体例如冰的相变。平常的冰和雪具有六边形晶体结构(冰I_h)。经历不同温度和/或压力后，冰可以形成超过十几种不同的相。这包括II、III、V、VI、VII、VIII、IX和X；其每种可以在环境压力下形成。冰的不同类型通过它们的晶体结构、排序和密度来区分。并在压力下还存在两种亚稳定相，都是氢键完全无序的，即IV和XII。

除了晶体形式之外，固态水可以无定形状态，作为无定形固态水(ASW)存在。无定形冰是缺少晶体结构的冰，并以至少三种形式存在：在大气压或以下形成的低密度(LDA)、在较高压力下形成的高密度(HDA)和极高密度无定形冰(VHDA)。LDA通过液体水的极快冷却(“超淬火玻璃状水”，HGW)、通过将水蒸气沉积在非常冷的基质上(“无定形固态水”，ASW)或通过在常压下加热高密度形式的病(“LDA”)来形成。然而，病毒组合物中多种溶质的存在意味着可能不能观察到纯冰中的晶体形式和相变。

本发明的组合物的重结晶窗口可以在例如-10℃至-30℃之间或-20℃至-23.5℃之间。

重结晶窗口可以使用差示热分析(DTA)或差示扫描量热法(DSC)等来测定。

热分析包含一组技术，其中随着时间变化测量物质的物理性质，同时物质经历受控的温度程序。在差示热分析中，当样品与惰性参比材料两者都经历同样的热处理时，测量在两者之间发生的温度差。相关的差示扫描量热法技术依赖于将样品和参比物维持在相同温度下所需的能量差异。在膨胀测定法中检测对材料进行热处理时发生的长度或体积变化；X-射线或中子衍射也可用于测量维度变化。热解重量分析术和逸出气体分析两者都是依赖于在高温下分解的样品的技术。前者监测样本加热后质量的变化，而后者是基于加热样品后释放出的气体。从这些技术获得的数据可以与材料的的缺失密度的变化相关联，或用于研究相变(例如结晶或重结晶)。

例如，结晶和其他相变可以使用DCS Q1000差示扫描量热器(可以从TA Instruments，New Castle，Delaware，USA获得)，按照制造商的说明书进行测定。

组合物可以是疫苗或可用于基因治疗、病毒治疗、免疫治疗或癌症治疗中。优选的组合物是活疫苗。组合物可用于免疫接种哺乳动物，优选为人类。

基因治疗是将基因插入到个体的细胞和组织中以治疗疾病，以及在遗传疾病中将缺陷的突变等位基因用有功能的等位基因代替。尽管该技术仍然处于其初期，但它已经使用并获得一些成功。反义治疗严格来说不是基因治疗的一种形式，但它是遗传介导的治疗，并通常与其他方法一起考虑。

病毒治疗是一种使用被修饰的病毒定向攻击癌细胞而留下健康细胞不被损坏的癌症治疗形式。免疫治疗是通过给药在一个个体中主动产生的预制抗体(血清或γ球蛋白)对另一个个体进行被动免疫；通过引申，该术语已变成包括免疫增强剂的使用、免疫活性淋巴组织(例如骨髓或胸腺)的置换等。

病毒可用于免疫接种，以对抗由选自下列病毒科的病毒引起的疾病或病症：腺病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、肝DNA病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科和披膜病毒科。病毒可用于免疫接种，以对抗由腺病毒、单纯性疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、细胞肥大病毒、爱泼斯坦巴尔(Epstein Barr)病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、副流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒、天花病毒、轮状病毒、嗜人类T淋巴细胞病毒-1、人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、风疹病毒、虫媒病毒，或由细胞内病原体/寄生虫包括阿菲波菌(Afipia spp)、布鲁菌(Brucella spp)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、衣原体(Chlamydia)、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、立克次氏体(Rickettsiae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、疟原虫(Plasmodium spp)、小泰累尔梨浆虫(Theileria parva)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、利什曼原虫(Leishmania)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)引起的疾病或病症。

具体来说，病毒可用于免疫接种，以对抗天花或黄热病。

可选地，病毒可用于免疫治疗(通过重组表达表的的肿瘤相关抗原(TAA)诱导免疫应答)、癌症治疗(参见上述，包括通过具有肿瘤向性的活病毒进行的肿瘤消解治疗)或病毒相关恶性肿瘤的治疗。

病毒可以是无包膜病毒或有包膜病毒。病毒可以是痘病毒，例如改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒。优选情况下，病毒是重组的改良安卡拉痘苗病毒。

病毒可以是用于预防接种以对抗天花的非重组MVA。

病毒可以是重组的MVA痘病毒，其递送编码肿瘤相关抗原的基因。这样的修饰病毒被用于癌症治疗以诱导免疫应答。

组合物可以包含一种或多种防腐剂、缓冲剂、等渗剂或其他在配制药物组合物中使用的常规组分，例如Tween聚山梨酸酯、聚乙二醇、氯化钙、卵磷脂例如磷脂酰胆碱、磷酸盐、维生素A、维生素E、维生素C、棕榈酸视黄酯、硒、甲硫氨酸、柠檬酸、柠檬酸钠或合成的防腐剂例如对羟基苯酸甲酯和对羟基苯酸丙酯。组合物可以是pH缓冲的，例如使用Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸缓冲盐水(PBS)。

组合物的pH可以在6至9之间，例如在6.5至8.5、7至8.5、7.5至8.5或8至8.5之间。组合物的pH可以为8.2。

组合物优选基本上不含人血清白蛋白，并优选基本上不含任何血清白蛋白。组合物也优选基本上不含非病毒蛋白。

使用“基本上不含人血清白蛋白”，我们是指组合物包含0.1％(w/v)或更少的人血清白蛋白。例如，组合物可以包含0.01％、0.001％、0.0001％或0.00001％(w/v)人血清白蛋白。优选情况下，不存在人血清白蛋白。

使用“基本上不含非病毒蛋白”，我们是指组合物含0.1％(w/v)或低于0.1％的非病毒蛋白。例如，组合物可以包含0.01％、0.001％、0.0001％或0.00001％(w/v)非病毒蛋白。优选情况下，不存在非病毒蛋白。

组合物优选包含0.01％至40％(w/v)之间的甘露糖醇，例如0.1％至10％、1％至20％、1％至10％、2％至9％、3％至8％之间或4％至6％之间。最优选情况下，组合物包含约5％(w/v)甘露糖醇。组合物也可以包含20mM Tris、135mM NaCl，并且它可以使用HCl调整到pH 8.2。

本发明的适合于口服给药的组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊或扁囊剂，其各含预定量的组合物；作为水性液体或非水性液体中的溶液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。组合物也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂存在。

优选情况下，本发明的组合物适合于肠胃外给药，包括水性和非水性无菌无热原注射溶液，其可以包含缓冲剂、抑菌剂和使组合物与目标受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。组合物可以存在于单剂或多剂容器中，例如密封的安瓿和玻璃管。在一个实施方案中，组合物是基本上水性的。

应该理解，除了上面具体提到的成分之外，本发明的剂型可以包括在本技术领域中常用的与所涉及的组合物类型相关的其他药剂，例如适合于口服给药的剂型可以包括调味剂。

本发明的第二方面提供了使包含改良阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物的液体或冷冻液体组合物稳定的方法，所述方法包含添加足够量的甘露糖醇，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。

该药剂可以提供如上所定义的稳定效应，并且组合物可用于如上所定义的目的。组合物的病毒可以如上所定义，并且组合物本身可以如上所定义。

本发明的第三方面提供了甘露糖醇的应用，用于使包含改良阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物的液体或冷冻液体组合物稳定，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。

该药剂可以提供如上所定义的稳定效应，并且组合物可用于如上所定义的目的。组合物的病毒可以如上所定义，并且组合物本身可以如上所定义。

附图简述

图1-MVA TBS(冷冻液体)组合物在-60℃至-80℃之间的TCID₅₀值。将两批MVA TBS组合物(批次A和B)在-60℃(±5℃)下储存39个月的时间。以一定时间间隔取样并测定TCID₅₀值。制剂在试验过程中稳定。

图2-MVA TBS(冷冻液体)组合物在-23℃(±2℃)下的TCID₅₀值。将一批MVA TBS组合物(批次A)在-23℃(±2℃)下储存36个月的时间。以一定时间间隔取样并测定TCID₅₀值。制剂在试验过程中不稳定。

图3-MVA TBS(液体)组合物在+2℃至+8℃之间的TCID₅₀值。将一批MVA TBS组合物(批次A)在+2℃至+8℃下储存36个月的时间。以一定时间间隔取样并测定TCID₅₀值。制剂在试验过程中不稳定。

图4-重组MVA TBS-甘露糖醇(液体)组合物在+2℃至+8℃之间的TCID₅₀值。将三批重组MVA TBS-甘露糖醇(5％w/v)组合物(批次D、E和F)在+2℃至+8℃下储存12个月的时间。以一定时间间隔取样并测定TCID₅₀值。两种制剂在试验过程中稳定。

图5-重组MVA TBS-甘露糖醇(液体)组合物在-23℃下的TCID₅₀值。将五批重组MVA TBS-甘露糖醇(5％w/v)组合物(批次D到H)在-23℃下储存18个月的时间。以一定时间间隔取样并测定TCID₅₀值。每种制剂在试验过程中稳定。

参考上面的图，在下面的非限制性实施例中对本发明的示例情况进行了描述。

实施例

实施例A-冷冻液体疫苗剂型在常规储存温度下不稳定。添加甘露糖醇赋予疫苗剂型以常规储存温度下的稳定性。

介绍

本研究使用重组MVA和MVA作为试验物进行。重组MVA是基于基因的抗癌症免疫治疗剂。改良安卡拉痘苗病毒(MVA)天花疫苗是活的、减毒的疫苗，用于预防和控制天花。本研究的目的是测试储存在常规冷藏条件下的液体剂型的稳定性

材料和方法

制剂

在US 5,391,491中描述的方法的无血清修改方法中实现了MVA的大规模生产。制剂通过批料MVA的稀释来制造，在TBS中稀释到1x10⁹TCID₅₀/ml的靶滴度。

储存性质研究

将制剂储存在：

(i)-23℃±2℃下；

(ii)＜-60℃下。

TCID₅₀的测定

将微孔板接种有100μl CEC悬液，浓度为5x10⁵±20％个细胞/ml。将板在36℃±2℃下在CO₂培养箱中温育过夜。

稀释前，将样品和对照制剂(对照)用超声波处理。将样品和对照以10倍的步级在细胞培养基中稀释，产生覆盖整数对数或半对数步级的连续稀释液。稀释步级的适合数量取决于预计的病毒滴度。

分别将100μl每种制备的样品或对照稀释液转移8次到含有CEC单层的制备好的微孔板中。另外8个孔用细胞培养基接种，作为阴性(细胞)对照。随后将微孔板在36±2℃下在CO₂培养箱中温育5±1天。

将微孔板的孔在倒置光学显微镜下筛选细胞层中的局部病变(由MVA引起的细胞病理效应(CPE))。从每个稀释度下显示出CPE的孔的百分数计算TCID₅₀。

如果细胞对照没有CPE并且阳性对照的病毒滴度在理想值的范围内，测定被视为有效。TCID₅₀的统计计算按照已知算法(例如Reed&Muench，1938，Am.J.Hyg.，27：493-497)，例如适合的计算机程序进行计算。

对照样品是标准的MVA在TBS中的制剂(以数百个冷冻等份试样储存在低于-60℃下)，其已经被滴定几次(10-20次或更多次)。重复滴定产生了稳定的平均滴度值，其可用作滴定标准品。

结果

发现在Tris缓冲盐水(TBS)中的MVA组合物在低于-60℃下在39个月的时间内稳定(参见图1)。一般相信，储存在通常冷冻条件下(即约-20℃)的液体冷冻剂型也将是稳定的。因此，预计同样的MVA TBS制剂在正常冷冻温度下将是稳定的。

然而，如图2中所示，在36个月的时间后，令人吃惊地发现MVATBS制剂在-23℃下是不稳定的。添加5％甘露糖醇足以使这种组合物的病毒稳定(参见图5)。

讨论

发现液体MVA TBS制剂在-22℃至-23.4℃之间的温度下不稳定。这种不稳定性的原因可能是在该制剂的该温度范围内发生了水性相的重结晶。在该温度范围内，通过添加5％(w/v)甘露糖醇使制剂稳定。因此，液体MVA TBS-甘露糖醇制剂在-23℃±2℃的典型储存温度下是稳定的。

实施例B-液体TBS疫苗剂型在+2℃至+8℃下不稳定，而TBS-甘露糖醇疫苗剂型在这些温度下稳定

介绍

该液体剂型研究的目的是确定向Tris缓冲盐水(TBS)疫苗剂型添加甘露糖醇是否影响其在冷藏(非冷冻)储存过程中的稳定性。

材料和方法

制剂

在US 5,391,491中描述的方法的无血清修改方法中实现了MVA的大规模生产。制剂通过批料MVA的稀释来制造，在TBS中稀释到1x10⁹TCID₅₀/ml的靶滴度。添加甘露糖醇至终浓度为5％。

储存条件

(i)5℃±3℃。

TCID₅₀的测定

与实施例A(如上)相同。

结果

储存稳定性

发现MVA TBS组合物当在2℃至8℃下储存12至36个月的时间时不稳定(参见图3)。然而，发现含有5％w/v甘露糖醇的三批MVA TBS组合物在18个月的试验过程中稳定(参见图4)。

讨论

这些数据表明，尽管液体TBS疫苗制剂在冷藏温度(+2℃至+8℃)下不稳定，但添加5％甘露糖醇提供了稳定效应。

Claims (17)

1.一种液体或冷冻液体组合物，其包含：

(a)改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒或其变体或衍生物；以及

(b)甘露糖醇，

其中(b)是组合物的唯一稳定剂。

2.权利要求1的组合物，其中甘露糖醇在10℃至0℃之间的储存温度下提供稳定效应。

3.权利要求1的组合物，其中组合物是疫苗或在哺乳动物、优选为人类中用于基因治疗、病毒治疗、免疫治疗或癌症治疗。

4.权利要求3的组合物，其中组合物是活疫苗。

5.权利要求4的组合物，其中病毒用于免疫接种，以对抗由选自下列的微生物引起的疾病或病症：腺病毒、单纯性疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、细胞肥大病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、副流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒、大天花病毒、类天花病毒、轮状病毒、嗜人类T淋巴细胞病毒-1、人类免疫缺陷病毒(HIV)、狂犬病病毒、风疹病毒、黄热病毒、虫媒病毒、阿菲波菌(Afipia spp)、布鲁菌(Brucella spp)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、衣原体(Chlamydia)、贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、立克次氏体(Rickettsiae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、疟原虫(Plasmodium spp)、小泰累尔梨浆虫(Theileria parva)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、利什曼原虫(Leishmania)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。

6.权利要求1的组合物，其中组合物基本上是水性的。

7.权利要求1的组合物，其包含0.01％至40％(w/v)的甘露糖醇。

8.权利要求7的组合物，其包含0.1％至10％(w/v)的甘露糖醇。

9.权利要求8的组合物，其包含约5％(w/v)的甘露糖醇。

10.一种使液体或冷冻液体组合物稳定的方法，所述组合物包含改良的阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物，所述方法包含添加足够量的甘露糖醇，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。

11.权利要求10的方法，其中组合物用于权利要求3或4任一项中限定的目的。

12.权利要求10或11的方法，其中组合物的病毒如权利要求5中所限定。

13.权利要求10到12任一项的方法，其中组合物如权利要求6到9任一项中所限定。

14.甘露糖醇的应用，用于使包含改良阿卡拉痘苗病毒(MVA)或其变体或衍生物的液体或冷冻液体组合物稳定，其中甘露糖醇是组合物的唯一稳定剂。

15.权利要求14的应用，其中组合物用于权利要求3或4任一项中限定的目的。

16.权利要求14到15的应用，其中组合物的病毒如权利要求5中所限定。

17.权利要求14到16任一项的应用，其中组合物如权利要求6到9任一项中所限定。

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