CN102212118A - 一种抗菌肽b及其应用 - Google Patents

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张尚立
张恒
常宏文
马剑峰
王丽
王萍
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Shandong University
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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽B，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用，实验显示：本发明所述抗菌肽B对革兰氏阳性菌或是革兰氏阴性菌都有很好地抑制作用，而且对真菌的抑制作用也很明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。

Description

一种抗菌肽B及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽，尤其涉及一种具有显著抑菌活性的抗菌肽B及其应用。
背景技术
目前，由于抗菌药物的广泛使用，使多数的常规抗生素都出现了相应的耐药性致病株系，因而寻找全新类型的抗菌药物成为解决耐药性问题的又一课题。
抗菌肽是对多种微生物、病毒、原虫甚至癌细胞都有明显抑杀作用的小分子多肽，广泛存在于生物体内。与抗生素不同，抗菌肽是特定基因编码的产物，它通过破坏细胞膜通透性使细胞内容物外流，最终导致细菌死亡，其抑菌过程中细菌不易产生耐药性，因此抗菌肽非常有望成为替代抗生素的新型抗菌药物。
近年来，多肽在人体中的作用已越来越多的被科学界发现，其产生的医药效果也引起了人们的高度重视。因此，开发具有诊断、监测、预防和治疗药作用的多肽药物的研究成为迫切任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有显著抑菌活性的抗菌肽B及其应用。
本发明所述的抗菌肽B，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；所述氨基酸序列具体信息是：
(a)序列特征
*长度：17氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述：
Leu Val Val Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ile Gly Ile Lys Lys Ile Gly Lys。
本发明提供的抗菌肽B不需任何修饰连接，且人工合成方便；试验证明具有显著的抑菌功能，同时对正常细胞无毒性。
本发明所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用。
功能实验显示：本发明所述抗菌肽B抗菌谱很广，无论是G+菌(革兰氏阳性菌)、还是G菌(革兰氏阴性菌)，都能被它很好地抑制，而且对真菌的抑制作用也很明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。
进一步的功能实验显示：本发明的抗菌肽B对细菌的抑制作用在10min之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80％，45min后就可达到95％以上。
鉴于上述多肽的性质和功能，本领域普通技术人员可以利用分子生物学技术，根据氨基酸与密码子的对应关系反推出核酸序列作为功能基因，用于制备转基因动物、植物或工程菌以表达功能蛋白，并用于药物的开发和临床治疗。
具体实施方式
实施例1
本发明所述抗菌肽B的设计与合成
1、依据目前国际主要抗菌肽数据库(http://www.imtech.res.in/raghava/antibp/；http://aps.unmc.edu/AP/main.php；http://www.bbcm.univ.trieste.it/；http://penbase.immunaqua.com/)中登陆的抗菌肽的序列，分析其一级结构与活性的关系的对应关系，设计人工多肽序列。
2、利用蛋白质分析数据库http://www.expasy.org/分析已知活性的多肽序列与设计的多肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
3、将设计的人工多肽序列(抗菌肽)送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成序列。HPLC检测纯度要大于96％，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。
4、合成后的多肽进行抑菌功能检测筛选。
5、通过功能检测，最终获得具有抑菌功能的多肽序列——抗菌肽B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
利用液体生长抑制法检测本发明所述抗菌肽B的抑菌活性
2.1材料、试剂
1)本发明所述抗菌肽B由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，氨苄青霉素(Amp)为solarbio公司产品，一次性滤器，为美国PALL公司产品，其它药品试剂为国产分析纯。
2)选用革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、藤黄八叠球菌(Sarcina ureae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、弧菌(Vibrio)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、变形杆菌(Proteus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；真菌：茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽病菌(Colletetrichum lagenarium)、苹果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)进行测试。
3)封闭液：0.4％BSA(w/v)，0.02％冰醋酸，配制后过滤除菌。
4)PB液体培养基(PH 7.4-7.6)
胰蛋白胨(Tryptone)    10g/L
氯化钠(NaCl)           5g/L
2.2实验
1)向无菌96孔酶标板所使用的孔中加入200μL封闭液，室温封闭24h。
2)用PB液体培养基过夜培养上述各种细菌，转培养使细菌处于对数生长期。用PB培养基调整菌液OD600约为0.005。
3)酶标板弃去封闭液，每孔加90μL步骤2)所述菌液，再加入用10μL无菌水配好的各种浓度梯度(浓度范围：20mg/mL～80mg/mL)的本发明所述抗菌肽B。阴性对照为90μL菌液+10μL无菌水；阳性对照为90μl菌液+10μL浓度为0.25mg/mL氨苄青霉素溶液(终浓度为0.025mg/mL，约62μM)。
4)将加好菌液和药品的酶标板置于28℃摇床，100rpm恒温培养。分别在培养后0.5h、3h、12h、15h、24h、36h，用BIOTEK ELX800酶标仪测定每孔的630nm吸光值(OD630)。
5)利用sigmaplot10和Excel软件分析处理数据。
结果表明，本发明的抗菌肽B对G+菌、或是对G-菌都具有明显的抑制作用，并且对真菌也有抑制作用；35mg/mL～70mg/mL浓度范围内，浓度越大抑菌效果越明显。提示其在抗菌药物开发和应用方面有重要价值。
实施例3
以大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌。
质量浓度为65mg/mL的本发明抗菌肽B，分别在作用大肠杆菌(Escherichia coli)10min，25min，45min，60min和90min后涂板。
大肠杆菌抑制曲线显示：本发明的抗菌肽B对细菌的抑制作用在10min之内就开始发挥，20min后抑制率即可达80％，45min后就可达到95％以上。

Claims (3)

1.一种抗菌肽B，其特征在于：所述抗菌肽B的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；其氨基酸序列具体信息是：
(a)序列特征
*长度：17氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述：
Leu Val Val Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ile Gly Ile Lys Lys Ile Gly Lys。
2.权利要求1所述抗菌肽B在制备抗菌药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细菌是革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105061562A (zh) * 2015-09-16 2015-11-18 山东电力中心医院 一种具有抗肺癌作用的寡肽及其应用
CN117551175A (zh) * 2024-01-10 2024-02-13 内蒙古农业大学 抗菌肽pln-2及其应用

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