CN102210873A - C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了C10orfl16基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性药物中的应用。本发明提出的C10orfl16基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用，为制备改善脂肪组织胰岛素敏感性的药物及制备促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物提供了新的技术方案。

Description

C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性的药物中的应用。

背景技术

糖尿病是严重危害人类身体健康和生活质量的一种代谢性疾病。目前，我国糖尿病构成以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90％以上，而且该病年轻化趋势日渐明显。其严重的危害性及在青年、儿童中不断增高的发病率引起了全球学者的广泛关注，已经成为医学领域中的重要研究方向。

糖尿病的发病机制主要有两个方面：一是胰岛素分泌不足，二是胰岛素抵抗。而肥胖，尤其是中心型肥胖是产生胰岛素抵抗的一个重要危险因素。脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞，其对葡萄糖摄取障碍是胰岛素抵抗产生的重要因素。因此，从脂肪组织中筛选出与胰岛素抵抗相关基因作为2型糖尿病防治的靶标业已成为研究热点之一。

C10orf116基因是我们在前期研究工作中以抑制性差减杂交(suppressive subtractivehybridization，SSH)技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪组织中的差异表达基因获得的一条新基因，该基因cDNA全长672bp(SEQ ID NO：1，NM_006829.2)，开放阅读框长221bp，编码76个氨基酸。该基因特异高表达于脂肪组织，在肥胖患者脂肪组织中表达显著上调，可促进脂肪细胞增殖、抑制脂肪细胞凋亡。但该基因与胰岛素敏感性之间的关系如何尚无知晓。

发明内容

本发明的目的是提供C10orf116基因在制备改善胰岛素敏感性的药物中的应用。

发明人检测了c10orf116基因过表达对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能及其对葡萄糖转运蛋白(GLUT4)基因mRNA表达水平的影响。结果发现，脂肪细胞在没有胰岛素作用的基础状态下对葡萄糖仅有低水平的摄取，c10orf116基因过表达虽不显著影响脂肪细胞在此基础状态下的葡萄糖摄取量，但却能显著提高成熟脂肪细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取，同时发现GLUT4的表达在c10orf116基因过表达的成熟脂肪细胞中也呈明显上调趋势。提示c10orf116基因与胰岛素抵抗可能密切相关，可用于开发改善胰岛素敏感性药物，另外，C10orf116基因也能促进脂肪组织摄取葡萄糖，因而提出“C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用”的技术方案。

本发明的有益效果：

本发明检测了c10orf116基因过表达对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取功能，考虑到葡萄糖转运体4(GLUT4)是胰岛素敏感葡萄糖摄取作用的重要功能执行者，GLUT4数量减少与转位障碍被认为是产生外周胰岛素抵抗或敏感性降低的重要机制之一，本发明同时检测了c10orf116基因过表达对GLUT4的影响。显示C10orf116基因能改善脂肪组织对胰岛素敏感性，同时也能促进脂肪组织摄取葡萄糖。

本发明公开了C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用，为制备改善脂肪组织胰岛素敏感性的药物及制备促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物提供了新的技术方案。

附图说明

图1pcDNA.3.1/myc-His(-)A载体图谱及插入位点

图2c10orf116基因稳定转染3T3-L1前体脂肪细胞株的鉴定

图3c10orf116基因过表达对成熟脂肪细胞糖摄取功能的影响。(^*，与pcDNA3.1Insulin相比P＜0.05)

图4c10orf116基因过表达对脂肪细胞中GLUT4基因表达的影响。(^*，与第4天pcDNA3.1相比P＜0.05；#，与第8天pcDNA3.1相比P＜0.001)

图3、4中□代表pcDNA3.1空载质粒的3T3-L1前体脂肪细胞(即pcDNA3.1-3T3L1细胞)，■代表转染c10orf116-pcDNATM3.1/myc-His(-)A质粒的3T3-L1前体脂肪细胞(即c10orf116-pcDNA3.1-3T3L1细胞)

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

1材料和方法

1.1试验材料

1.1试验材料

本试验所需的pcDNA^TM3.1/myc-His(-)A质粒购自美国Invitrogen公司；hC10orf116-pcDNA^TM3.1/myc-His(-)A真核表达载体由本实验小组自行构建；

Easy购自美国Promega公司；

质粒载体由本实验小组自行构建；2-deoxy-D-3[H]Glucose购自英国Amersham公司；RNA提取剂TRIzoL^TM Reagent购自美国Invitrogen公司；反转录试剂购自美国Promega公司；Advantage^TM 2PCR试剂盒购自日本Takara公司；TA载体购自美国Promega公司；实时荧光定量PCR中Master Mix购自美国ABI公司；引物由美国Invitrogen公司合成。

1.2(一)hC10orf116基因全编码区cDNA片段获取及TA克隆

1.总RNA抽提：采用Trizol法从人脂肪组织中抽提总RNA。

2.1.5％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳鉴定RNA完整性，利用紫外分光光度计完成总RNA定量和纯度分析。

3.反转录反应：

1)照下表，将试剂加入0.2ml去核酸酶处理过的离心管，混匀并短暂离心。

PE2400PCR仪70℃孵育5min，立即冰水浴。

2)按下表，将试剂加入上述反应管中，混匀并短暂离心。

PE2400PCR仪42℃孵育1hr，95℃孵育10min。

4.PCR反应：反应体系如下表所示，模板为人脂肪组织总cDNA，PCR上游引物为5’-tgg caa gca agg gct tgc ag-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物为5’-ttt cag gag gcc gaa tttttt ccc-3’(SEQ ID NO：3)；反应条件为95℃1min(预变性)，95℃30sec、68℃40sec，共30循环(变性、退火和杂交)，68℃1min(终末变性)。

5.2.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳鉴定PCR产物特异性，纯化PCR产物。

6.采用

克隆试剂盒将纯化后PCR产物按下表插入TA载体，连接条件：4℃，24hr。

7.将TA连接产物转化JM109感受态细菌。

8.取转化后菌液100μl，加到含100μg/ml氨卞青霉素的琼脂平板上，铺平，37℃孵箱中正置生长1hr，待菌液完全吸收后倒置培养过夜。

9.取上述阳性克隆，加入含100μg/ml氨苄青霉素的3ml LB培养基，37℃、200rpm振荡孵育过夜。待菌液OD600生长至3.0左右，采用质粒抽提试剂盒抽提质粒(TaKaRa-Bio，Inc.)。取抽提的质粒2μl，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

10.测序鉴定：所有被初步判断为阳性重组的质粒均经过测序鉴定(Invitrogen，Inc.)。选择插入hC10orf116基因全编码区，全编码区经测序验证且无任何突变、插入或缺失的阳性重组质粒(

质粒)即用于后续研究。

1.2(一)hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A真核表达载体构建：

1.PCR扩增获取hC10orf116基因全编码区cDNA片段

采用Advantage^TM 2PCR试剂盒(CLONTECH Laboratories，Inc.)进行PCR反应。其中，模板为经测序验证且无任何突变、插入或缺失的

质粒，引物序列如下，hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A上游引物：5’-

 ggatcc gccacc atggca agc aag ggc-3’(SEQ ID NO：4)，下游引物：5’-

 aagctt ttt cag gag gcc gaa-3’(SEQID NO：5)。黑体部分为保护碱基，下划线部分表示限制性内切酶识别位点，上游引物酶切位点为BamHI，下游引物酶切位点为Hind III，斜体部分表示Kozak序列。2.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳鉴定PCR产物特异性。

2.采用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa-Bio，Inc.)纯化PCR产物。

3.2.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳鉴定纯化后PCR产物特异性。

4.BECKMAN DU-600紫外分光光度计测定纯化后PCR产物浓度。

5.取pcDNA.3.1/myc-His(-)A菌种各5μl，分别加入3ml含有100μg/ml氨卞青霉素及100μg/ml卡那霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡孵育过夜。

6.待菌液OD600生长至3.0左右，采用质粒抽提试剂盒抽提质粒(TaKaRa-Bio，Inc.)。

7.1.0％琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳鉴定质粒浓度。

8.BECKMAN DU-600紫外分光光度计测定质粒浓度。

9.限制性内切酶消化

按下表所列反应体系加入限制性内切酶消化所需试剂，限制性内切酶及缓冲液购至TaKaRa-Bio公司。

10.反应物轻轻混匀，37℃孵育4hr(限制性内切酶消化)，70℃15min(灭活限制性内切酶)

11.20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定双酶切消化效率。

12.采用胶回收试剂盒(Watson Biotechnology，Inc.)纯化目的条带。

13.连接和转化

14.按下表，加入连接反应所需试剂，轻轻混匀，4℃过夜。连接酶及缓冲液购至TaKaRa-Bio公司。

15.连接产物转化JM109感受态细菌。

16.取转化后菌液100μl，加到含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板上，铺平，37℃孵箱中正置生长1hr，待菌液完全吸收后倒置培养过夜。

17.pcDNA.3.1/myc-His(-)载体图谱及插入位点，如图1所示。

18.阳性克隆鉴定和获取

19.菌落PCR鉴定，方法同hC10orf116基因核酸水平检测。

20.限制性内切酶消化鉴定：取上述阳性克隆，加入含100μg/ml氨苄青霉素的3mlLB培养基，37℃、200rpm振荡孵育过夜。待菌液OD600生长至3.0左右，采用质粒抽提试剂盒抽提质粒(TaKaRa-Bio，Inc.)。取抽提的质粒2μl，按照前述限制性内切酶消化方法消化，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果出现与插入片段大小一致的目的片段，初步判断为重组质粒。

21.测序鉴定：所有被初步判断为阳性重组的质粒均经过测序鉴定(Invitrogen，Inc.)。选择在既定酶切位点、按既定方向插入hC10orf116基因全编码区，全编码区经测序验证且无任何突变、插入或缺失的hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A阳性重组质粒用于后续研究。

1.2(二)LPS-free质粒抽提

所有用于哺乳动物细胞转染的质粒均必须经过去除内毒素(又称为脂多糖，LPS)的特殊处理，所用试剂盒为Qiagen公司提供的UltraMobius^TM 1000Plasmid Kit。质粒抽提操作流程见后。应用BECKMAN DU-600紫外分光光度计对LPS-free的hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A阳性重组质粒进行定量。分装，-20℃保存待用。

UltraMobius^TM 1000Plasmid Kit操作流程：

1.取试剂盒中RNase A，短暂离心，用无菌吸头全部加入细菌重悬液中(1ml)，作标记，4℃保存。

2.将新鲜生长的培养皿中的一个克隆接种到5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，300rpm孵育8小时。

3.将0.5ml菌液转移到35ml含有相应抗生素的无菌LB液体培养基中，37℃300rpm继续孵育12-16小时，收获时菌液OD600应达3-5。500g离心10分钟收获细菌，小心弃尽上清。

4.将细菌充分重悬于2.1ml裂解缓冲液中，上下抽吸或轻柔漩涡震荡直至菌体充分重悬。重悬不充分降低质粒产率。

5.加入2.1ml裂解缓冲液，确保中和缓冲液在使用之前至少在冰上放置了10分钟，盖上管盖，轻轻旋转混匀直至菌液变得清澈粘稠，千万不要漩涡震荡(将拉断基因组DNA，降低质粒DNA产率，并导致基因组DNA污染)。在室温中孵育细菌裂解液5分钟。

6.加入2.1ml预冷的Mobius中和缓冲液，盖紧，轻柔混匀，形成絮状沉淀。此时，由于基因组DNA、蛋白质、去污剂以及细胞碎屑的沉淀，混合物应变得不再粘稠。将混合物冰上孵育5分钟。

7.在孵育的同时，取出Mobius100纯化拄的上下盖，放掉过多的贮存缓冲液。将纯化柱放入一15ml离心管中，加入5ml Mobius平衡缓冲液，并证实其可以在重力作用下流出柱床。在5ml平衡缓冲液全部进入柱床以后再放液。由于缓冲半月板到达玻璃料的顶部时流动会自动停止，缓冲液不会流干。

8.10000g离心中和后的细菌裂解液2分钟(室温或4℃)，以去除不溶性细胞成分。将Mobius滤器装入一15ml离心管中，缓缓倒入上清。

9.向净化后的细菌裂解液中加入1ml Detox试剂，轻轻混匀，冰上孵育15分钟。10000g离心10分钟。

10.将平衡后的Mobius 200纯化柱放入一新的15ml离心管中，将细菌裂解液全部加入到柱床，使液体通过重力作用流出。

11.将层析柱转移到一新的15ml离心管中，加入5ml洗涤缓冲液，并使其在重力作用下流出。

12.将层析柱转移到一新的15ml离心管中，加入2ml洗脱缓冲液将质粒洗脱，收集。

13.从离心管中取出层析柱，将全部洗脱液转移到一个30ml聚碳酸酯离心管中，加入1.4ml异丙醇，轻轻混匀，15000g离心20分钟，或者转移1ml洗脱液到两个1.6-2mlEP管中，分别加入0.7ml异丙醇，轻轻混匀，15000g离心15分钟。

14.在管壁外沉淀所在位置作一标记，小心吸弃上清，避免接触管壁。异丙醇沉淀的DNA往往弥散、半透明、占据较大的表面积，标记将有助于沉淀的可视化。

15.加入2ml 70℃乙醇，轻轻旋转离心管以洗涤沉淀。如果使用的是EP管，则加入lml 70％的乙醇。15000g离心10分钟。弃上清，将管子倒置于一干净的纸巾上让残余的乙醇流尽。

16.空气中或真空干燥沉淀，直至可见的小液滴全部蒸发。避免过度干燥。这将降低质粒DNA的溶解性。将沉淀溶解于0.5-1ml TE缓冲液或无Dnase水中，并转移到一个新的1.5mlEP管中，-20℃保存。

1.2(三)Western Blot验证：

运用脂质体转染法分别将hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A载体质粒及pcDNA.3.1/myc-His(-)A载体质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞，采用G418筛选单克隆，运用Western Blot技术验证稳定表达细胞株。结果发现，C10orf116蛋白表达于转染hC10orf116-pcDNA3.1/myc-His(-)A载体质粒的细胞株中，转染空载质粒的细胞株中则无表达(图2)，提示C10orf116基因稳定过表达细胞株构建成功。

1.3C10orf116基因对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取量的影响

将稳定转染hC10orf116-pcDNA 3.1/myc-His(-)A载体质粒或空载质粒的3T3-L1前体脂肪细胞分化成熟后以KRPH buffer(KRPH buffer的配置：5mM Na₂HPO₄，20mMHEPES，1mM MgSO₄，1mM CaCl₂，4.7mM KCl，0.1％bovine serum albumin，pH7.4)。洗涤2次，并分别以同样的缓冲液不含胰岛素和含100nM胰岛素处理基础摄糖组和胰岛素刺激后的摄糖组，室温孵育30min。每孔加入2ml KRPH buffer稀释的2-Deoxy-[3H]glucose，37℃孵育5min。吸出2-Deoxy-[3H]glucose，加入含8％葡萄糖的预冷PBS终止摄糖反应。冰PBS洗涤细胞3次，将细胞溶解于0.8ml 1M NaOH中，1000g离心10min，收集细胞上清。对收集的细胞上清进行液闪计数。(由南京医科大学同位素教研室进行检测)结果见图3。

1.4c10orf116基因过表达对脂肪细胞中GLUT4基因表达的影响

由于pcDNA3.1-3T3L1细胞在第8天完全分化成熟，我们分别用TRIzoL一步法分别提取分化第0天、第4天、第8天即分化起始、中期、成熟三个时期的pcDNA3.1-3T3L1及c10orf116-pcDNA3.1-3T3L1细胞总RNA，经电泳显示28S，18S清晰2条带，测定A₂₆₀/A₂₈₀比值大于1.8。应用实时荧光定量RT-PCR法(ABI 7500型PCR仪，美国ABI公司)检测细胞中GLUT4基因mRNA表达水平，GLUT4基因上游引物序列：5′-ATTGGACGCTCTCTCTCCAA-3′(SEQ ID NO：6)，下游引物序列：5′-GATTCTGCTGCCCTTCTGTC-3′(SEQ ID NO：7)；内参β-actin上游引物序列：5′-ATCTGGCACCACACCTTC-3′(SEQ ID NO：8)，下游引物序列：5′-AGCCAGGTCCAGACGCA-3′(SEQ ID NO：9)。RT反应体系20μl，PCR反应体系25μl。PCR扩增反应条件为：50℃2min、95℃10min后，以95℃15s、60℃1min循环40次。结果见图4。

2结果

C10orf116基因过表达的成熟脂肪细胞在基础状态下的葡萄糖摄取量与对照组无明显差异，而胰岛素刺激状态下，C10orf116基因过表达的成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取则显著高于对照细胞。GLUT4基因在C10orf116基因过表达的脂肪细胞在分化成熟过程中表达较对照细胞显著上调。上述结果提示，C10orf116基因过表达能够显著提高成熟脂肪细胞的葡萄糖摄取，其机制可能与GLUT4基因表达上调有关。

序列表

<110>郭锡熔 朱春 倪毓辉 彭宇竹 刘晓梅 王欣 池霞 邱洁 曹新国

<120>C10orf116基因在制备改善胰岛素敏感性的药物中的应用

<160>9

 

<210>1

<211>672

<212>DNA

<213>天然序列，来源人类(human)组织细胞

<400>1

caggccagcc ctggggcgcc ttaaaaaccg gagctggcgc ttggcatcgc cactctgggc  60

aggatccaac gtcgctccag ctgctcttga cgactccaca gataccccga agccatggca 120

agcaagggct tgcaggacct gaagcaacag gtggagggga ccgcccagga agccgtgtca 180

gcggccggag cggcagctca gcaagtggtg gaccaggcca cagaggcggg gcagaaagcc 240

atggaccagc tggccaagac cacccaggaa accatcgaca agactgctaa ccaggcctct 300

gacaccttct ctgggattgg gaaaaaattc ggcctcctga aatgacagca gggagacttg 360

ggtcggcctc ctgaaatgac agcagggaga cttgggtgac cccccttcca ggcgccatct 420

agcacagcct ggccctgatc tccgggcagc caccacctcc tcggtctgcc ccctcattaa 480

aattcacgtt cccaccctgt gtccacttca tgattcctcg caagctgggc ccagtcctct 540

catcccaaga gcagagccac cgtagccgga gtcctagcct cccaaattcg gaaatccaat 600

ccaacggtct caggaatgtt ttccatcccg ccacgcgcct cccgaagctc ccagaccgga 660

ggctcagccc cc                                                     672

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>2

 

tggcaagcaa gggcttgcag  20

 

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>3

 

tttcaggagg ccgaattttt tccc  24

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A上游引物

 

<400>4

 

cgcggatccg ccaccatggc aagcaagggc 30

 

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hC10orf116-pcDNA.3.1/myc-His(-)A下游引物

 

<400>5

 

cccaagcttt ttcaggaggc cgaa 24

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GLUT4基因上游引物

<400>6

attggacgct ctctctccaa 20

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GLUT4基因下游引物

<400>7

gattctgctg cccttctgtc 20

 

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>内参β-actin上游引物

<400>8

atctggcacc acaccttc 18

 

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>内参β-actin下游引物

<400>9

agccaggtcc agacgca 17

Claims (1)

1.C10orf116基因在制备改善脂肪组织胰岛素敏感性和/或促进脂肪组织摄取葡萄糖的药物中的应用。

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