CN102206641A - 一种启动子SiUbi1、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种启动子，特别是一种植物例如改良冀张谷1号的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。本发明所述启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的选自如下的变体：1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子的制备方法以及所述启动子在调控植物中目的基因表达和水稻育种中的用途。

Description

一种启动子SiUbi1、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种启动子，特别是一种植物例如谷子的启动子，以及所述启动子的制备方法及用途。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。

目前广泛应用的一种组成型启动子为CaMV35S，它在单子叶植物和双子叶植物中都产生较高效率的表达，但Ajith Anand等将水稻几丁质酶基因chitinase转入小麦，发现使用CaMV35S作为启动子时，转入的植株到第二代时chitinase全部表现出基因沉默，而使用玉米泛素Ubiquitin启动子，在第四代时，该基因的表达量仍然较大(AjithAnand等，Plant Biotechnology Journal，2003(1)：241-251)。

人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如泛素(Ubiquitin)和肌动蛋白(Actin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在植物中驱动外源基因的转录。

泛素(Ubiquitin，Ubi)启动子广泛存在于真核生物中，在增强基因表达的长期性，稳定性等方面有显著功效，并且以启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐(谢伟，乐超银.三峡大学学报，2007，29(2)：176-179)。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括：玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbB1启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubi1-1启动子、大麦泛素Mub1启动子等等。其中，玉米泛素Ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。

Ubi启动子能够有效促进外源基因的长期稳定高效表达，现在已经有很多的Ubi启动子在单子叶植物和双子叶植物中得到应用。并且Ubi启动子跟源于T-DNA的nos、ocs、mas和源于病毒的CaMV35S、CsVMV等启动子相比，具有更高水平的转录调节作用。郭殿京等(遗传学报，1999，26(2)：168-173)发现在转基因小麦愈伤组织中，Ubi启动子的效率最高，是CaMV 35S启动子的4-5倍。Genschik等(Gene，1994，148：195-202)将分离得到烟草泛素基因Ubi.U4的启动子序列导入转基因烟草中启动GUS表达，结果表明Ubi.U4启动子启动GUS基因的表达量是CaMV35S的7倍。

随着植物基因工程的发展，人们不再满足把特定的外源基因转入受体植物，而是要外源基因特定而高效的表达。外源基因表达量不足往往是得不到理想转基因植物的重要原因，而启动子在决定基因表达方面起到关键作用(侯丙凯等.遗传，2001，23(5)：492-497)。利用Ub i启动子在细胞体内持久而高水平的转录调节作用，将其整合至附加型的载体中，可获得高水平的表达系统，因而在转基因植物中，泛素启动子有巨大的应用潜力。

发明内容

为了给植物研究中调控目的基因表达提供一种新的工具和选择，本发明人通过对谷子基因组的深入研究，提供了一种新的泛素启动子，所述启动子能够用于调控植物中目的基因表达。

本发明的一个方面，提供了一种具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的植物启动子。在本发明中，所述启动子的具体碱基序列长度为2020个碱基，如SEQ ID NO：1所示：

ACTTAGCTTCTGGCCATCTCCAGAGACAGTGAGTTGATGCTTGATGCTAGACGAGGGGAAAAAAAGCAGAAAATCAGCCATACTAAATCAACTAATGATT TCAAAGAGAGGTACCTAATGCTCAAAAAGGAAGAGATTGGGCGATTTGCGACTAAAGAAGAGAATAAAATAGATTTTTTATAGCGTTAAGAAGTGTGTCA CAGCTCTTACAGGAATGCTTGATCTACAAATGGAATAGATGATAATGGCAGCGGATATGGACGGATCGGGGTTGTTTAGTTCCTAATTTTTTAAAAAGTT TTTCGTCACATCGAATCTTATAACACATGTGTGAGTATTAAATATAGATAAAAAATAACTAATTACATAATTTATTTGTAGTTTGCTAGATAAAATTTTT GAGCCTAGGGTTAGTTTATGATTGAATAATAATTATCACGAAAGTACTACAGTAGTTAAATTTAAAATTGTTCGCAAACTAAACAAGGCCATGGTGTGTT TTTATTTTACTCTCTAAAAATCTGCACAAAGGTTTTCTGACTCATGGGCCACACGTCTCAGTGTCGGTAAACACGGACGGAATCACGGGAGAAGGCATTA ACAGCGTCGGGTCTAACGGCCACAAACCAGCGACGAACGAAACAGACGTTCTGACGTCTCCGTGTCCACTCCGTCACTGGTTCCTTCTGGAGAGCTCTGA CCTCCTCCGTCTCTATCTACGGCCGGCTCGCCTTCCGTTCCGCGTTCGCGTTGGACTCTTTGCGCTGGCGTGTTCCTGGAATTGCGTGGCGGAGACGAGG CGGATTTCTCTCGCACGGAACGGAACCGCCACGGGCCCAAAGGCACGGTGATTCCTTCTCCACCAACATAAATAGCCAGGACCCCTCCTCGCCTTTCCCC AATCTCATCTCGCATTGTGTTGTTCGGAGCAAGGAGAACCCAGCCCCCCATCGCTCTCAATCCCAATCGATCTTCTTCTCGTGAGCCTCGTCAATCCATC ACCCGCTTCTAAGGTACGGCTCCCCCTCTAATCTTCTCTTCCCATCTCAGATTGGCGAGTTTATGTGATTAGATTAGATGCTTCTCATCTAGATTGCGAG TTTCTGTTCGTAGATGGCTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGTTTCTGTTCGTAGATGACTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGATCGTTCTGATG ATTTCTTTGGCTGCTGCGTAGAGATAGATCTGGTCCTGCTTTTCTTAATTCTTGGTGCAGATTTTGTGACCTGGTTCTATGTTCTTGTTCCTGCTTTGTA GCTCAAATAGTTGTCTTAACTAGCTGGGCTTATTATTTGATTTGTACCTGCATGTATTATCACCAAATACAATTACTGTGAAGGAGTCAATATACCCTGC TCTGTACCTTTTACCTGACGAGCCATACTATCATTTTGATTCGTGTCATATGCATGCCAGATACGGAAATTATATGCTGCTACTTGCGTTATTATCATGC TGATTTGTTTCATATGCACGCCTAGATAGATGGAAATTATATGCTACTGCTGAGCGTTATTATCATGCTGATTCGTTTCATATGCATGCCTAGATAGTTG GAAGTTTTGTTGTTTGCTGAGTGTTACTATCATGTTGATTTGTAATCATATGCATGCCTAGATAGATGAAGATACATGAATGTTATTCGTTTCAGATAGA TGGAATATGCTGCTACTGAGCGTTACTATCATGTTGATTTGTTTCATATACACGCCTAGATAGATGAAGAGATGGATGTTGATTTGTTTCATATGCATGC CTAATAGATGAAGATATATGCTGCTACTGATGATTACTTACTACTTCGTGCCCATGCATGCTCTTTGGTTTACTTGGATGGTGACATGCTGATGCAGTTT

在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的启动子序列称为启动子SiUbi1，也简称为启动子P 603。

该启动子为组成型启动子，带有该启动子和GUS的水稻愈伤组织以及转基因水稻苗经GUS染色实验后，所述水稻愈伤组织和转基因水稻苗的根、茎、叶等都变蓝色。

本发明的又一方面，涉及具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补的序列的启动子。

本发明的又一方面，还涉及SEQ ID NO：1所示启动子的具有启动子功能的选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，

2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物，具体地，所述单子叶植物为谷子，例如所述谷子为改良冀张谷1号(改良冀张谷1号种子于2010年4月1日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCP201006)。

本发明的又一方面，还涉及一种含有本发明所述启动子的重组载体。所述重组载体可以通过将上述启动子插入到克隆载体或表达载体而得到。

适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19-T Simple Vecter等。

适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pBI121、p13W4、pGEM等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为p8+P603重组载体。

本发明的又一方面，还涉及含有本发明所述启动子的所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将含有本发明所述启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P603。

本发明的又一方面，还涉及一种单子叶植物愈伤组织，所述愈伤组织转化有本发明所述的启动子。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻。所述水稻包括但不限于，例如：中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。在本发明的又一实施方案中，所述水稻为日本晴。

本发明的又一方面，还涉及一种制备本发明所述启动子的方法，包括如下步骤：

1)根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，

2)以改良冀张谷1号的种子基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。

本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增引物对如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明的又一方面，还涉及一种调控植物中目的基因表达的方法，所述方法包括用本发明所述启动子转化植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明所述启动子的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组根癌农杆菌EHA105-P603。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。

在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

本发明中，可利用所述单子叶植物启动子调控目的基因表达的植物包括但不限于，例如：水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。

本发明的又一方面，还涉及本发明所述启动子在植物中调控目的基因表达的应用。在本发明的一个实施方案中，所述植物为单子叶植物。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地所述水稻为日本晴。

为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子和/或增强子联用。

本发明的又一方面，涉及本发明所述启动子在水稻育种中的用途。所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本晴。

本发明的启动子可成为一种新的启动子，作为植物：例如水稻，转基因的工具启动子。本发明的启动子由于是组成型启动子，同时还可跨物种调控目的基因的表达，故本发明的启动子可为多种植物育种提供便利，如低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究。将可能极大的缩短优良品种的选育时间。

本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等植物。

发明的有益效果

本发明人通过生物信息学研究获得一种来源于谷子的泛素启动子，并采用生物学实验验证了所述启动子P603的功能，该启动子具有跨物种调控目的基因表达的作用，为组成型启动子。具体地，所述启动子能够在水稻中调控GUS基因表达：在水稻的愈伤组织、水稻转基因小苗的根、茎、叶中都能调控gus基因的高效表达。

附图说明

图1是启动子P603的PCR扩增检测结果，其中，泳道M：200bp DNALadder Marker，其左侧的数字表示所指向的Ladder Marker的条带的大小，单位都是bp；泳道1：PCR扩增产物。

图2是用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。

图3是p8质粒示意图中多克隆位点和GUS序列部分的示意图。

图4是p8质粒示意图。

图5是经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P603序列的重组根癌农杆菌p8+P603转化的水稻愈伤组织(左)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织(对照，右)经GUS染色后颜色未发生变化。

图6是经过转化的转基因水稻苗的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P603序列的重组根癌农杆菌p8+P603转化的水稻苗(右)经GUS染色后，其根、茎、叶呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8转化的水稻苗(对照，左)经GUS染色后其根、茎、叶的颜色未发生变化。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：启动子P603片段的PCR扩增和pMD18-T+P603重组载 体的构建

PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取改良冀张谷1号种子的基因组DNA(gDNA)，根据该启动子在改良冀张谷1号gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点Sbf I和保护碱基)。以上述提取的改良冀张谷1号的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。

其中，上游引物F1：GGGAATTCACTTAGCTTCTGGCCATCTCCAGA(SEQ IDNO：2)，其中下划线代表EcoR I酶切位点。

下游引物R1：GCCCTGCAGGCTGTAGAAGAAAAAACAAGCAA(SEQ ID NO：3)，其中下划线代表Sbf I酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为2038bp的条带(图1)，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收。

pMD18-T+P603重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序(如SEQ ID NO：4所示)，证明正确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：        10μl

pMD18-T              1μl

2*solution I         5μl

PCR扩增产物(回收插入片段)10ng～20ng，根据其浓度定

ddH₂O                补齐至10μl

于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+P603重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P603重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有pMD18-T+P603克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-P603。深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+P603克隆载体中的P603进行测序，结果如下：

GGGAATTC

GACAGTGAGTTGATGCTTGATGCTAGACGAGGGGAAAAAAAGCAGAAAATCAGCCATACTAAATCAACTAATGATTTCAAAGAGAGGTACCTAATGCTCAAAAAGGAAGAGATTGGGCGATTTGCGACTAAAGAAGAGAATAAAATAGATTTTTTATAGCGTTAAGAAGTGTGTCACAGCTCTTACAGGAATGCTTGATCTACAAATGGAATAGATGATAATGGCAGCGGATATGGACGGATCGGGGTTGTTTAGTTCCTAATTTTTTAAAAAGTTTTTCGTCACATCGAATCTTATAACACATGTGTGAGTATTAAATATAGATAAAAAATAACTAATTACATAATTTATTTGTAGTTTGCTAGATAAAATTTTTGAGCCTAGGGTTAGTTTATGATTGAATAATAATTATCACGAAAGTACTACAGTAGTTAAATTTAAAATTGTTCGCAAACTAAACAAGGCCATGGTGTGTTTTTATTTTACTCTCTAAAAATCTGCACAAAGGTTTTCTGACTCATGGGCCACACGTCTCAGTGTCGGTAAACACGGACGGAATCACGGGAGAAGGCATTAACAGCGTCGGGTCTAACGGCCACAAACCAGCGACGAACGAAACAGACGTTCTGACGTCTCCGTGTCCACTCCGTCACTGGTTCCTTCTGGAGAGCTCTGACCTCCTCCGTCTCTATCTACGGCCGGCTCGCCTTCCGTTCCGCGTTCGCGTTGGACTCTTTGCGCTGGCGTGTTCCTGGAATTGCGTGGCGGAGACGAGGCGGATTTCTCTCGCACGGAACGGAACCGCCACGGGCCCAAAGGCACGGTGATTCCTTCTCCACCAACATAAATAGCCAGGACCCCTCCTCGCCTTTCCCCAATCTCATCTCGCATTGTGTTGTTCGGAGCAAGGAGAACCCAGCCCCCCATCGCTCTCAATCCCAATCGATCTTCTTCTCGTGAGCCTCGTCAATCCATCACCCGCTTCTAAGGTACGGCTCCCCCTCTAATCTTCTCTTCCCATCTCAGATTGGCGAGTTTATGTGATTAGATTAGATGCTTCTCATCTAGATTGCGAGTTTCTGTTCGTAGATGGCTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGTTTCTGTTCGTAGATGACTGGCTTGTAAGCGGTTCCTAGGTGGGATCGTTCTGATGATTTCTTTGGCTGCTGCGTAGAGATAGATCTGGTCCTGCTTTTCTTAATTCTTGGTGCAGATTTTGTGACCTGGTTCTATGTTCTTGTTCCTGCTTTGTAGCTCAAATAGTTGTCTTAACTAGCTGGGCTTATTATTTGATTTGTACCTGCATGTATTATCACCAAATACAATTACTGTGAAGGAGTCAATATACCCTGCTCTGTACCTTTTACCTGACGAGCCATACTATCATTTTGATTCGTGTCATATGCATGCCAGATACGGAAATTATATGCTGCTACTTGCGTTATTATCATGCTGATTTGTTTCATATGCACGCCTAGATAGATGGAAATTATATGCTACTGCTGAGCGTTATTATCATGCTGATTCGTTTCATATGCATGCCTAGATAGTTGGAAGTTTTGTTGTTTGCTGAGTGTTACTATCATGTTGATTTGTAATCATATGCATGCCTAGATAGATGAAGATACATGAATGTTATTCGTTTCAGATAGATGGAATATGCTGCTACTGAGCGTTACTATCATGTTGATTTGTTTCATATACACGCCTAGATAGATGAAGAGATGGATGTTGATTTGTTTCATATGCATGCCTAATAGATGAAGATATATGCTGCTACTGATGATTACTTACTACTTCGTGCCCATGCATGCTCTTTGGTTTACTTGGATGGTGACATGCTGATGCAGTTTTGCTGGTTCTATAGTACCTATGTGCTTAGCATGTATATCTGTTTCTTGTTGCTGACTGTTTCTTTCCCTCCTTAGTCTACCGCCGTATACTTATCATG

CCTGCAGGGC(SEQ ID NO：4)

上面的序列中，带下划线的为酶切位点(EcoRI+SbfI)，带方框的为引物序列。

测序结果表明，获得的pMD18-T+P603克隆载体中P603启动子序列正确。

实施例2载体-p8+P603重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从实施例1构建的转化有启动子P 603的大肠杆菌DH5α-P603中提取带有本发明P603启动子序列的克隆载体pMD18-T+P603；纯化后用相应的限制性内切酶EcoR I(NEB)和Sbf I(NEB)进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与p8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。

将所得连接产物p8+P603重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5α，37℃倒置培养16～24h，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。

p8质粒构建

本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，或者可从The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee，Australia获得)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下：

用Kpn I/Nco I(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图2)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列：GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAG GATCCGTCGACCATGG(SEQ ID NO：5)(包含的酶切位点是Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化top 10细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO：6)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQID NO：7)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子(参见图4)。

所述p8质粒中的多克隆位点和GUS序列的长度2353碱基，如SEQID NO：8所示(参见图3)：

GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC

GAGCTC AAGCTT

C

G

GGAT CC

C

(SEQ ID NO：8)

如上序列所示本发明中所构建的p8质粒，其多克隆位点中的EcoRI/Sac I/Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I限制性酶切位点分别用加框和下划线表示，筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTA AC(即SEQ ID NO：6和7)用双下划线表示，GUS序列用斜体表示，其内含子序列分别用斜体加底纹示出。

重组载体p8+P603的构建

根据限制性内切酶EcoR I(NEB)和Sbf I(NEB)操作说明，按照如下条件处理实施例1中所得到的克隆载体pMD18-T+P603，以及如上所述构建的p8质粒。

其中，克隆载体pMD18-T+P603及p8质粒的酶切条件如下：

酶切体系：                        50μl

无菌水                            34.8μl

10*buffer H                       5μl

EcoR I                            0.1μl(10U)

Sbf I                             0.1μl(10U)

克隆载体pMD18-T+P603或p8质粒      10μl(＜1000ng)

使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP 209-03)分别回收经酶切的p8质粒，以及启动子P603插入片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系：                        10μl

10*T4buffer                       1μl

酶切后的p8质粒                    1μl(20ng)

回收的启动子P603插入片段          10-20ng，根据其浓度定

无菌水                            补齐至9.5μl

T4 ligase(TaKaRa，D2011A)         0.5μl

T4 buffer冰上融化，酶切后的p8质粒载体加入量约20ng，本发明中的P603片段加10-20ng。于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl 4℃预冷的SOC，37℃下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37℃倒置培养16～24h。得到重组载体p8+P603。

分别以F1(SEQ ID NO：2)和R1(SEQ ID NO：3)为引物对所得重组载体p8+P603进行PCR检测，以确证所得重组载体p8+P603中含有所需启动子P603。通过EcoR I/Sbf I酶切筛选含有重组载体p8+P603转化子。

实施例3重组根癌农杆菌EHA105-P603细胞的制备

将如实施例2所述方法构建的p8+P603重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 209315)的感受态细胞，具体方法如下：

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，分别加入5μl的p8+P603重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/lKan，10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28℃倒置培养2-3天。

以F1(SEQ ID NO：2)和R1(SEQ ID NO：3)为引物进行PCR检测和通过Kpn I/Sbf I酶切筛选转化子。

PCR扩增出约2038bp条带和酶切出约2027bp条带的为重组载体p8+P603的重组根癌农杆菌。

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p8+P603的重组根癌农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-P603。

按照本发明所述方法，得到的带有p8质粒的对照重组根癌农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p8。

实施例4水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P603和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子(2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC P200910)去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表2)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3-4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1-3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P603或重组根癌农杆菌EHA105-p8)，于添加抗生素(50mg/l Kan，10mg/l Rif)的YM培养基(具体配方参见表3、表4)上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl 100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表5)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P603或重组根癌农杆菌EHA105-p8)；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(配方参见表6)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48-60h；

6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Cb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周。

实施例5水稻愈伤组织中的GUS的表达

为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen S Y等在Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P603或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织进行染色。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P603或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图5所示，经含有启动子的p8+P603重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图5左)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照，图5右)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P603启动子对GUS基因表达具有调控作用。

实施例6：转基因水稻苗中GUS的表达

将实施例4中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表7)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表8)进行生根筛选。

转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例5中愈伤组织的染色过程。结果如图6所示，经含有启动子的p8+P603重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、茎、叶(图6右)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、茎、叶(作为对照，图6左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P603启动子对GUS基因表达具有调控作用。

本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：

以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20分钟。

表2N6D培养基

用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。

N₆macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

N₆micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄.7H₂O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2h，冷却后4℃保存不超过1个月。

N₆维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.10g，维生素B₆0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表3YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

表4YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

表5AAM培养基

加1N氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。

AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1.5g二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H₃BO₃)，25mg二水钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl₂.6H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1g VB6(Pyridoxine)，1g VB1(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表6N6-AS共培养基

调pH至5.2。

N₆macro母液(20X)，N₆micro母液(1000X)，铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)，N₆维生素贮存液(1000X)：均见表2。

表7MS-R分化培养基：

调PH值至5.8，常规方式灭菌。

MS macro(20X)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS micro(1000X)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存。

MS维生素贮存液(1000X)：维生素B₁0.010g，维生素B₆0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

表81/2MS生根培养基

调PH值至5.8。

MS macro(20X)见表7。

MS micro(1000X)MS维生素贮存液(1000X)见表7。

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)：见表2。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>深圳华大基因科技有限公司

<120>一种启动子SiUbi1、其制备方法及用途

<130>IDC100025

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

 

<210>1

<211>2020

<212>DNA

<213>改良冀张谷1号

<400>1

acttagcttc tggccatctc cagagacagt gagttgatgc ttgatgctag acgaggggaa    60

aaaaagcaga aaatcagcca tactaaatca actaatgatt tcaaagagag gtacctaatg   120

ctcaaaaagg aagagattgg gcgatttgcg actaaagaag agaataaaat agatttttta   180

tagcgttaag aagtgtgtca cagctcttac aggaatgctt gatctacaaa tggaatagat   240

gataatggca gcggatatgg acggatcggg gttgtttagt tcctaatttt ttaaaaagtt   300

tttcgtcaca tcgaatctta taacacatgt gtgagtatta aatatagata aaaaataact   360

aattacataa tttatttgta gtttgctaga taaaattttt gagcctaggg ttagtttatg   420

attgaataat aattatcacg aaagtactac agtagttaaa tttaaaattg ttcgcaaact   480

aaacaaggcc atggtgtgtt tttattttac tctctaaaaa tctgcacaaa ggttttctga   540

ctcatgggcc acacgtctca gtgtcggtaa acacggacgg aatcacggga gaaggcatta   600

acagcgtcgg gtctaacggc cacaaaccag cgacgaacga aacagacgtt ctgacgtctc   660

cgtgtccact ccgtcactgg ttccttctgg agagctctga cctcctccgt ctctatctac   720

ggccggctcg ccttccgttc cgcgttcgcg ttggactctt tgcgctggcg tgttcctgga   780

attgcgtggc ggagacgagg cggatttctc tcgcacggaa cggaaccgcc acgggcccaa   840

aggcacggtg attccttctc caccaacata aatagccagg acccctcctc gcctttcccc   900

aatctcatct cgcattgtgt tgttcggagc aaggagaacc cagcccccca tcgctctcaa   960

tcccaatcga tcttcttctc gtgagcctcg tcaatccatc acccgcttct aaggtacggc  1020

tccccctcta atcttctctt cccatctcag attggcgagt ttatgtgatt agattagatg  1080

cttctcatct agattgcgag tttctgttcg tagatggctg gcttgtaagc ggttcctagg  1140

tgggtttctg ttcgtagatg actggcttgt aagcggttcc taggtgggat cgttctgatg  1200

atttctttgg ctgctgcgta gagatagatc tggtcctgct tttcttaatt cttggtgcag  1260

attttgtgac ctggttctat gttcttgttc ctgctttgta gctcaaatag ttgtcttaac  1320

tagctgggct tattatttga tttgtacctg catgtattat caccaaatac aattactgtg  1380

aaggagtcaa tataccctgc tctgtacctt ttacctgacg agccatacta tcattttgat  1440

tcgtgtcata tgcatgccag atacggaaat tatatgctgc tacttgcgtt attatcatgc  1500

tgatttgttt catatgcacg cctagataga tggaaattat atgctactgc tgagcgttat  1560

tatcatgctg attcgtttca tatgcatgcc tagatagttg gaagttttgt tgtttgctga  1620

gtgttactat catgttgatt tgtaatcata tgcatgccta gatagatgaa gatacatgaa  1680

tgttattcgt ttcagataga tggaatatgc tgctactgag cgttactatc atgttgattt  1740

gtttcatata cacgcctaga tagatgaaga gatggatgtt gatttgtttc atatgcatgc  1800

ctaatagatg aagatatatg ctgctactga tgattactta ctacttcgtg cccatgcatg  1860

ctctttggtt tacttggatg gtgacatgct gatgcagttt tgctggttct atagtaccta  1920

tgtgcttagc atgtatatct gtttcttgtt gctgactgtt tctttccctc cttagtctac  1980

cgccgtatac ttatcatgtt gcttgttttt tcttctacag                        2020

 

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gggaattcac ttagcttctg gccatctcca ga                                  32

 

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gccctgcagg ctgtagaaga aaaaacaagc aa                                  32

 

<210>4

<211>2038

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gggaattcac ttagcttctg gccatctcca gagacagtga gttgatgctt gatgctagac    60

gaggggaaaa aaagcagaaa atcagccata ctaaatcaac taatgatttc aaagagaggt   120

acctaatgct caaaaaggaa gagattgggc gatttgcgac taaagaagag aataaaatag   180

attttttata gcgttaagaa gtgtgtcaca gctcttacag gaatgcttga tctacaaatg   240

gaatagatga taatggcagc ggatatggac ggatcggggt tgtttagttc ctaatttttt   300

aaaaagtttt tcgtcacatc gaatcttata acacatgtgt gagtattaaa tatagataaa   360

aaataactaa ttacataatt tatttgtagt ttgctagata aaatttttga gcctagggtt   420

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cgcaaactaa acaaggccat ggtgtgtttt tattttactc tctaaaaatc tgcacaaagg   540

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gacgtctccg tgtccactcc gtcactggtt ccttctggag agctctgacc tcctccgtct   720

ctatctacgg ccggctcgcc ttccgttccg cgttcgcgtt ggactctttg cgctggcgtg   780

ttcctggaat tgcgtggcgg agacgaggcg gatttctctc gcacggaacg gaaccgccac   840

gggcccaaag gcacggtgat tccttctcca ccaacataaa tagccaggac ccctcctcgc   900

ctttccccaa tctcatctcg cattgtgttg ttcggagcaa ggagaaccca gccccccatc   960

gctctcaatc ccaatcgatc ttcttctcgt gagcctcgtc aatccatcac ccgcttctaa  1020

ggtacggctc cccctctaat cttctcttcc catctcagat tggcgagttt atgtgattag  1080

attagatgct tctcatctag attgcgagtt tctgttcgta gatggctggc ttgtaagcgg  1140

ttcctaggtg ggtttctgtt cgtagatgac tggcttgtaa gcggttccta ggtgggatcg  1200

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tggtgcagat tttgtgacct ggttctatgt tcttgttcct gctttgtagc tcaaatagtt  1320

gtcttaacta gctgggctta ttatttgatt tgtacctgca tgtattatca ccaaatacaa  1380

ttactgtgaa ggagtcaata taccctgctc tgtacctttt acctgacgag ccatactatc  1440

attttgattc gtgtcatatg catgccagat acggaaatta tatgctgcta cttgcgttat  1500

tatcatgctg atttgtttca tatgcacgcc tagatagatg gaaattatat gctactgctg  1560

agcgttatta tcatgctgat tcgtttcata tgcatgccta gatagttgga agttttgttg  1620

tttgctgagt gttactatca tgttgatttg taatcatatg catgcctaga tagatgaaga  1680

tacatgaatg ttattcgttt cagatagatg gaatatgctg ctactgagcg ttactatcat  1740

gttgatttgt ttcatataca cgcctagata gatgaagaga tggatgttga tttgtttcat  1800

atgcatgcct aatagatgaa gatatatgct gctactgatg attacttact acttcgtgcc  1860

catgcatgct ctttggttta cttggatggt gacatgctga tgcagttttg ctggttctat  1920

agtacctatg tgcttagcat gtatatctgt ttcttgttgc tgactgtttc tttccctcct  1980

tagtctaccg ccgtatactt atcatgttgc ttgttttttc ttctacagcc tgcagggc    2038

 

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggtaccaagc ttactagtcc tgcaggtcta gaggatccgt cgaccatgg                49

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcttccggct cgtatgttgt    20

 

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gagtcgtcgg ttctgtaac     19

 

<210>8

<211>2353

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat    60

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt   120

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt   180

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat   240

tacgaattcg agctcggtac caagcttact agtcctgcag gtctagagga tccgtcgacc   300

atggtagatc tgagggtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt   360

ttctcttttt atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat   420

tggttatggt gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg   480

tctatgatga tgatgatagt tacagaaccg acgactcgtc cgtcctgtag aaaccccaac   540

ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg   600

aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg   660

cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta   720

tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga   780

tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg   840

cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg   900

tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat   960

taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg  1020

aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt  1080

ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa  1140

tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg  1200

cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct  1260

ctatgaactc gaagtcacag ccaaaagcca gacagagtct gatatctacc cgcttcgcgt  1320

cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta  1380

ctttactggc tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt  1440

gctgatggtg cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc  1500

gcattaccct tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat  1560

tgatgaaact gctgctgtcg gctttcagct gtctttaggc attggtttcg aagcgggcaa  1620

caagccgaaa gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt  1680

acaggcgatt aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag  1740

tattgccaac gaaccggata cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc  1800

ggaagcaacg cgtaaactcg acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg  1860

cgacgctcac accgatacca tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta  1920

cggatggtat gtccaaagcg gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact  1980

tctggcctgg caggagaaac tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac  2040

gttagccggg ctgcactcaa tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg  2100

gctggatatg tatcaccgcg tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg  2160

gaatttcgcc gattttgcga cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg  2220

gatcttcact cgcgaccgca aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac  2280

tggcatgaac ttcggtgaaa aaccgcagca gggaggcaaa caagctagcc accaccacca  2340

ccaccacgtg tga                                                     2353

Claims (10)

1.一种具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列的启动子，或其具有启动子功能的选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，

2)对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和

3)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的启动子，优选地，所述重组载体为p8+P603重组载体。

3.一种含有权利要求2所述重组载体的重组细胞。

4.权利要求3所述的重组细胞，其为重组根癌农杆菌EHA105-P603。

5.一种植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有权利要求1所述的启动子，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，更优选地，所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻为日本晴。

6.一种制备权利要求1中所述的启动子的方法，包括如下步骤：

1)根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，具体地，所述PCR扩增引物对为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

2)以改良冀张谷1号基因组DNA为模板，使用步骤1)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。

7.一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括用权利要求1所述的启动子转化植物的愈伤组织的步骤，优选地，所述愈伤组织为水稻愈伤组织，特别优选地，所述水稻为日本晴。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物愈伤组织的转化过程中利用了权利要求4所述的重组根癌农杆菌EHA105-P603。

9.权利要求1所述的启动子在调控植物中目的基因表达的用途，其中所述目的基因为GUS，所述植物为水稻，优选地，所述水稻为日本晴。

10.权利要求1所述的启动子在水稻育种中的用途，优选地，所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特别优选地，所述水稻为日本晴。

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