CN102206603B - 以啤酒废弃物为原料制作Bt培养基的方法及产品 - Google Patents

Abstract

一种以啤酒废弃物为原料制作Bt培养基的方法，按重量百分比，以啤酒废水70%-80%和20-30%破壁灭菌后的酵母泥浸出液混合做为基本培养基，以(NH4)₂SO₄、ZnSO₄、麦芽糖或葡萄糖、KH₂PO₄或K₂HPO₄、NaH₂PO₄或Na₂HPO₄和吐温80为调节剂；基本培养基加调节剂调节后的目的培养基剂含TC：3500-4500mg/L、TN：200-300mg/L、TP：250-400mg/L，按重量百分比含Zn⁺²：0.03-0.04%、Na⁺¹0.25-0.35%、K⁺¹0.035-0.040%、吐温80为0.10-0.25%；该培养基培养Bt菌株8010，发酵25-30h有95%以上芽胞脱落。其发酵液稀释1000倍后，对Ⅱ-Ⅲ龄小菜蛾幼虫的校正死亡率可达95%以上，发酵培养十分良好。

Description

以啤酒废弃物为原料制作Bt培养基的方法及产品

所属技术领域   

本发明涉及一种微生物培养基，具体涉及一种以啤酒废弃物为原料制作苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)培养基的方法及产品。

背景技术   

Bt是一种革兰氏阳性细菌，主要特性在于形成芽胞的同时，在菌体内形成具有蛋白质性质的一个或多个伴胞晶体。由于这类蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生线虫等有较强的毒杀作用，而对人和家畜无毒、不污染环境、不产生抗药性等优点，在全球农、林、卫生害虫防治中得到广泛应用，是最普遍适用的微生物杀虫剂之一。据2005年统计，我国生物农药年产量只占农药总量的1%（约占1.4%的化学农药) ，离“世界环境与发展大会”提出生物农药要达到60%的目标甚远，其中主要原因之一是生产成本。生物农药其开发成本只有化学农药的十分之一，但其生产成本要高于化学农药。

一般工业化生产Bt的培养基是由大豆粉、鱼粉、葡萄糖、酵母浸膏、蛋白胨、微量元素组成，其成本都很高，其价格约占总生产成本的35％-59％。随着环境要求的提高和农业的不断发展，Bt的需求不断增大，而粮食类原料成本日益涨价，引起Bt的生产成本“水涨船高”，限制了Bt杀虫剂的普及。研究表明Bt在含氮0.075％-0.225％、含糖0.1％-1.5％和C：N 0.44-20.0的范围内都能生长良好。为了降低Bt的生产成本，促进Bt的应用，利用便宜的培养基培养Bt是明智的选择。最近50年不少研究者利用较便宜的原料，如工农业副产品、废弃物、污水、污泥等廉价原料，替代传统原料生产Bt杀虫剂，以达到节约粮食、就地取材、降低成本、提高经济的效果。采用低成本、当地易得的生产原料发酵生产Bt杀虫剂，是近年来国内外Bt发酵行业的研究热点。

研究表明利用污泥/污水培养Bt，基本可达到工业化的水平，与传统培养基比较，Bt增殖快，毒力更大或达同一数量级，形成芽胞更早，是Bt发酵的良好培养基。但存在消毒杀菌难、营养成分波动大，培养基营养受到污泥浓度的限制等问题，未见具体的工业生产应用的报道；农产品或农产品加工的废弃物、废水从理论上说也均可作为Bt的发酵原料或Bt的培养基，基本可以满足Bt生产的需要，但很多原料来源受限，如玉米浸泡液、丙酮丁醇废液、酒精醪液、玉米浆、淀粉等；并且有些加工的工业废水需要进行复杂的预处理，消除对Bt生长有害的物质，预处理繁琐、昂贵，如去除高浓度有毒的苯类有机物、脱脂、蛋白洗脱或浓缩等，因处理而导致原料成本提升；同时因原料不稳定，营养成分变化大，发酵难于控制，因此有大量有机废弃物不适合作为工业发酵培养基；因此Bt杀虫剂商业化中，生产发酵的培养基的选择尤为重要，一个有效的发酵培养基既要原料来源广、营养成分相对稳定、发酵水平高、原料成本低，又能充分发挥杀虫活性菌株的毒力和致病率。

发明内容   

本发明的目的是提供一种综合利用啤酒废水、酿酒废酵母及其他碳源、氮源、磷素和金属离子配制成高效的Bt液体发酵培养基，该培养基Bt发酵增殖快，毒力更大，对                                                -

龄小菜蛾幼虫毒力大，48h校正死亡率在95%以上，达到更高的水平。

本发明所述的一种以啤酒废弃物为原料制作Bt培养基剂的方法，以啤酒厂啤酒废水、破壁灭菌后的酵母泥浸出液、调节剂组成；调节剂由葡萄糖、麦芽糖、(NH4)₂SO₄、ZnSO₄、HPO₄ ^-2或H₂PO^-1 ₄的Na⁺¹和K⁺¹盐和吐温80组成。

各种原辅料组配及成份调整方法如下：

1、培养基基本成分按重量百分比是啤酒废水70%-80%+破壁灭菌后的酵母泥浸出液20-30%；

2、加调节剂调整后的混合液组成的目的培养基的全碳（TC）：全氮（TN）：全磷（TP）=15-25：1-1.5：1-1.5，其中TC：3500-4500mg/L、 TN: 200-300mg/L、 TP: 250-400mg/L、Zn⁺²：0.03-0.04%、Na⁺¹ 0.25-0.35%、 K⁺¹0.035--0.040%、吐温80为0.10-0.25%。

3、调节剂的的调整方法: 先根据啤酒废水的成分，按要求加入20-30%破壁灭菌后的酵母泥浸出液，再根据其混合液的各成分的含量分别加入氮源调节剂(NH4)₂SO₄、碳源调节剂麦芽糖或葡萄糖、钾离子与磷素调节剂KH₂PO₄或 K₂HPO₄、钠离子与磷素调剂 NaH₂PO₄或 Na₂HPO₄微调。TN不足加入(NH4)₂SO₄调节，TC不足加入葡萄糖或麦芽糖调节，TP不足加入KH₂PO₄或 K₂HPO₄调节，以确保培养基成分达到目的培养基的要求，最后加入吐温80 至0.10-0.25%；再经混合溶解，121℃高压蒸汽灭菌45min，即为产品。

    根据上述方法，制成以啤酒废弃物为原料制作的Bt培养基产品。

啤酒生产工业十分发达，生产过程中主要的副产品及废弃物有糖化过程中的糖化糟、酒花糟、沉淀蛋白，发酵过程中的剩余酵母，以及各工艺中排出的废水和废水处理沉淀下来的活性污泥等。啤酒废水废弃物的特点： ①我国啤酒产量已连续多年居世界第一，废弃物排放量大，啤酒厂分布于每个城市；②营养成分丰富（较城市污水高），数量比较稳定，含有大量的糖类、蛋白质和纤维素、多糖、醇类等中低分子有机物；③BOD/COD比值一般大于0.5，可生化性较好；④卫生性好：包装车间生产时，PH高达10以上，温度40-60度，整个生产过程致病菌污染机会少，重金属含量低，国家污水检测要求36项，而啤酒废水只要求检测其中6项，而不检测重金属元素。研究表明，啤酒废弃物不经预处理和营养配方即可以满足Bt生长的需要；但由于啤酒废水生产过程营养成分会波动，且啤酒废水+破壁灭菌后酵母泥浸出液培养Bt存在营养不均衡，发酵速度过短，产芽胞数和晶体量少，引起毒力效价低且波动大。

而采用本发明的方法，以破壁灭菌后的酵母泥浸出液、啤酒废水、葡萄糖、麦芽糖为碳源，以破壁灭菌后的酵母泥浸出液为主要氮源，提供了该菌生长和代谢所需的碳源和氮源；加入的金属离子无机盐是微生物细胞内分子的结构成分，并具有生理调节和酶激活剂的功能；还使用磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长所需的最适的pH，满足了该菌快速生长增殖的营养需要。苏云金芽胞杆菌菌株8010发酵培养25-30h，95%以上芽胞脱落。发酵液稀释1000倍后，对

-

龄的小菜蛾幼虫48h的致死率可达到95%以上；明显优于直接使用啤酒废水及城市污泥培养基，48h对

-

龄的小菜蛾幼虫的校正死亡率提高了十个百分点以上，效益十分明显。

具体实施例

为了更充分公开本发明的方法与产品，以下结合实施例加以说明。

实施例：由啤酒废水、破壁灭菌后的啤酒酵母泥浸出液、调节剂组成；各种原料所占的重量百分率如下：

原料1: 破壁灭菌后的酵母泥浸出液成分（mg/L）：TC 14850，TP 327.6，TN 604

原料2: 啤酒废水成分（mg/L）：TC 843，TP 0.72，TN 80 

上述原料以啤酒废水75%+破壁灭菌后的啤酒酵母泥浸出液25%混合，测的的混合液含有TC、TN、TP符合要求，Zn离子含量约为0，Na离子含量0.03%，K离子含量0.0026%。根据目的培养基的营养要求，此时调节剂应该加入：ZnCl₂ 0.05%（Zn⁺²0.032%）；加入NaCl 0.6%（Na离子含量计0.27%）：加入KH₂PO₄ 0.12%（K离子含量0.037%）；吐温80 0.10-0.25%；调整后TP为350 mg/L。TC：TP=12.5：1；TC：TN=20.6符合目的培养基要求。

按上述培养基配方混合溶解后，121℃蒸汽灭菌45min，即可使用。具体培养使用方法: 10L发酵罐装6L按以上配方的啤酒废弃物为原料的Bt菌株发酵培养基，用氢氧化钠调培养基pH值至7.5，接种活化过夜的Bt种子液5%，所述菌种为含10%甘油-20℃保存的苏云金芽胞杆菌8010菌株；发酵温度设定30±1℃，转速180r/min，培养时间25h，至95%以上芽胞脱落发酵结束。发酵液做芽胞计数，并做小菜蛾生物测定。

发酵液芽胞计数方法：取发酵液85℃加热处理5min，迅速冷却，采用稀释平板活菌技术法计数；

毒力测定方法：发酵液稀释1000倍浸小白菜，晾干制成大小一样的小片于培养皿，每个培养皿放10只小菜蛾，三个重复，24h、48h观察。测定结果见下表： 

 

结果：采用本发明方法的终产品芽胞数晶体蛋白（OD₅₉₅）明显提高；与直接用啤酒废弃物培养基和城市污泥培养基比较，产品48h对小菜蛾杀虫毒力（校正死亡率）分别提高了11%、22%。

Claims (2)

1.一种以啤酒废弃物为原料制作Bt培养基的方法，其特征是以啤酒厂啤酒废水、破壁灭菌后的酵母泥浸出液和调节剂组成；调节剂由葡萄糖、麦芽糖、(NH₄)₂SO₄、ZnSO₄、HPO₄ ^-2或H₂PO^-1 ₄的Na⁺¹和K⁺¹盐和吐温80组成，各种原辅料组配及成份调整方法如下：

A、基本培养基：按重量百分比取啤酒废水与破壁灭菌后的酵母泥浸出液混合，其啤酒废水占70％-80％、破壁灭菌后酵母泥浸出液占20-30％；

B、把A的基本培养基加调节剂：根据A的各成分的含量分别加入氮源调节剂(NH₄)₂SO₄、碳源调节剂麦芽糖或葡萄糖、钾离子与磷素调节剂KH₂PO₄或K₂HPO₄、钠离子与磷素调剂NaH₂PO₄或Na₂HPO₄微调；TN不足可加入(NH₄)₂SO₄调节，TC不足加入葡萄糖或麦芽糖调节，TP不足加入KH₂PO₄或K₂HPO₄调节，或NaH₂PO₄或Na₂HPO₄调节，以确保培养基成分达到目的培养基的要求，最后加入吐温80，占目的培养基的0.10-0.25％；

经上述各步骤调制后目的培养基剂，其TC∶TN∶TP＝15-25∶1-1.5∶1-1.5，具体是TC：3500-4500mg/L、TN：200-300mg/L、TP：250-400mg/L；按重量百分比Zn⁺²：0.03-0.04％、Na⁺¹0.25-0.35％、K⁺¹0.035-0.040％、吐温80为0.10-0.25％；经混合溶解121℃蒸汽灭菌45min，即为成品。

2.一种以啤酒废弃物为原料制作的Bt培养基产品，其特征是按权利要求1所提供的方法制成以啤酒废弃物为原料制作的Bt培养基产品。