CN102202503A

CN102202503A - 放射性碘化苯甲酰胺衍生物的药用组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN102202503A
Application number: CN2009801447128A
Authority: CN
Inventors: J·陈; J·F·克罗瑙奇; J·W·巴比奇
Original assignee: Molecular Insight Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Molecular Insight Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2011-09-28
Also published as: RU2011112946A; CA2736237A1; AU2009289553A1; JP2012502060A; US20110206608A1; WO2010028281A1; EP2328411A1

Abstract

提供包含式I的放射性碘化N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺的药用组合物。药用组合物提供稳定制剂用于贮存和给予患黑素瘤的患者。还提供使前体化合物碘化的新方法。

Description

放射性碘化苯甲酰胺衍生物的药用组合物及其制备方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年9月5日提交的临时美国申请序列号61/094,838的权益，其通过引用完全结合到本文中。

发明背景

发明领域

本发明涉及包含放射性碘化苯甲酰胺衍生物N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺和药学上可接受的赋形剂的药用组合物。本发明还涉及制备碘化衍生物和药用组合物的方法，以及用本发明的药用组合物治疗具黑素瘤肿瘤的患者的方法。

技术状态

在美国，目前每年有62,000例新诊断的黑素瘤病例。在任何癌症中黑素瘤发病率上升最快，特别险恶，因为早期和广泛转移。当患者的原发肿瘤直径超过3毫米时，大多数情况下手术切除恶性黑素瘤无效。患有恶性黑素瘤的IV期患者具有6个月预期寿命。

75-90％恶性黑素瘤包含黑色素，一种包含具有羧基和酚羟基的吲哚单元的生物聚合物。有机胺、金属和多环芳烃能够与黑色素结合。体外和体内研究也已证实放射性标记的苯甲酰胺衍生物与黑色素结合，表现高摄取并保留在黑素瘤细胞中。参阅例如WO 2005/089815。具体来讲，已显示化合物N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺具有特别理想的与黑色素结合的能力，可用作显像剂和治疗剂。参阅′815说明书。

由于几种原因当配制放射性标记药品时存在各种困难。首先，在放射性碘化过程中产物可能严重降解。第二，因为溶解度低所以药品可能通常难以配制。第三，放射性标记药品可能不表现适合治疗靶向疾病的足够高的放射化学产率。而且，最终的放射性产物在运输要求的浓度下可能不稳定，降解产物例如游离碘化物可对正常器官包括甲状腺、内分泌器官和消化系统产生严重的威胁生命的细胞毒性作用。

已开发多种¹²³I-苯甲酰胺用于转移性黑素瘤的诊断性显像。证明快速肿瘤清除排除了将其¹³¹I-标记配对物用于治疗目的的可能性。一些实例包括：

在B16黑素瘤荷瘤C57BL/J1小鼠模型中¹²³I-BZA快速肿瘤清除(％ID/g)的实施例公开于Moreau MF et al.Nucl Med Biol.1995，22：737-47。结果显示于表A。

表A：¹²³I-BZA的肿瘤清除(％ID/g)

1h	24h	72h
			6.8	0.8	0.3

因此，有需要用包含治疗剂的基本纯和稳定的药品治疗黑素瘤。

发明概述

本发明涉及用于治疗黑素瘤肿瘤的药用组合物。本发明的药用组合物还可用作诊断剂，即用于使肿瘤显像的目的。

在一个实施方案中，提供包含式I的放射性碘化N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺的药用组合物：

在组合物中还提供至少一种增溶剂和至少一种防腐剂。本发明的组合物具有约4.0-约4.8的pH。在另一个实施方案中，pH为约4.4。选择这样的pH以便在贮存时组合物保持最佳稳定性和纯度。在一个实施方案中，式I化合物以约1.25mCi/毫升浓度存在于组合物中。在另一个实施方案中，组合物包含约6％聚乙二醇(w/v)；约2％乙醇(v/v)；约3％龙胆酸钠(w/v)；和约6％抗坏血酸(w/v)。在另一个实施方案中，抗坏血酸为约3.7％抗坏血酸钠和2.7％抗坏血酸。在另一个实施方案中，组合物还包含N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺。

还提供制备式III化合物：

的方法，其中R是氟、氯或甲氧基。该方法包括在反应条件下使式II化合物：

接触溶液，所述溶液包含至少约1当量三(2，2，2-三氟乙酰基)铊和1∶1体积的三氟乙酸和乙酸，以得到式III化合物。

在本发明另一方面提供制备式IA化合物：

的方法，其中R是氟、氯或甲氧基。该方法包括在第一反应条件下使式II化合物：

接触溶液，所述溶液包含至少约1当量三(2，2，2-三氟乙酰基)铊和约1∶1体积比的三氟乙酸和乙酸，以得到式III化合物：

在第二反应条件下使式III化合物接触溶液，所述溶液包含至少约0.5-约0.7当量¹³¹碘化钠，以得到式I化合物。

在一个实施方案中，式II化合物存在于含有乙酸的溶液中。在另一个实施方案(或刚才提到的相同实施方案)中三(2，2，2-三氟乙酰基)铊存在于还含有三氟乙酸的溶液中。在一个实施方案中，¹³¹碘化钠处于还含有氢氧化钠和硫酸钠的溶液中。

在一个实施方案中，反应条件包括在约25摄氏度约15分钟反应时间。在另一个实施方案中，第一反应条件包括在约25摄氏度约10分钟反应时间。在还有另一个实施方案中，第二反应条件包括在约25摄氏度约5分钟反应时间。

本发明的方法还包括分离式I(或IA)化合物。在一个实施方案中，通过高效液相层析分离化合物。

本文还提供制备本发明药用组合物的方法。制备组合物的步骤参阅说明书和附加附件各处，其由此通过引用结合到本文中。当通过本发明方法制备时，当在冰箱中贮存1周时本发明的组合物具有约70-约90％放射化学产率和约95％或更大的放射化学纯度。在一个实施方案中，式I化合物在制备后至少约1或2天具有大约104mCi/mg的比放射性。

在另一个实施方案中，本发明涉及通过给予药学有效量的本文所述药用组合物治疗患有黑素瘤的患者的方法。

发明详述

在描述本组合物和方法之前，应理解本发明不限于描述的具体化合物、组合物、方法、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解本文所用术语意欲描述本发明的具体实施方案，绝非意欲限制如在附属权利要求和实施例中列出的本发明范围。

附图简述

请注意化合物A也称为″Cmpd A″。化合物B也称为″Cmpd B″或″BA-52″。化合物B的降解产物也称为″Cmpd BD″或″BA-52D″。化合物C也称为″Cmpd C″或″MIP-1143″。化合物D也称为″Cmpd D″或″MIP-1144″。

图1显示在注射后120小时¹³¹I-Cmpd B在黑素瘤患者中的全身图像。前两格显示在一种强度设定下的左侧和右侧视图，第三和第四格显示在另一种强度设定下的左侧和右侧视图；

图2显示¹³¹I-Cmpd B形成的副产物的HPLC层析图和反应方案。副产物的结构用LC/MS确认；

图3显示在B16F10荷瘤小鼠中¹³¹I-Cmpd B和¹³¹I-Cmpd BD的生物分布。图表表明副产物¹³¹I-Cmpd BD的黑色素靶向能力低；

图4显示在B16F10荷瘤小鼠中¹³¹I-Cmpd A、¹³¹I-Cmpd B、¹³¹I-Cmpd C和¹³¹I-Cmpd D的生物分布。图表表明在所有四种待测化合物中都观察到理想的分布特性；

图5显示¹³¹I-Cmpd A的高稳定性。上方两幅HPLC层析图表明用250mCi Na¹³¹I使Cmpd A-p放射性碘化得到RCP＞95％(具体来讲是96.5％和96.2％)的¹³¹I-Cmpd A。下方HPLC层析图表明用25mCiNa¹³¹I使Cmpd B-p放射性碘化得到RCP～65％的¹³¹I-Cmpd B；

图6显示在各种剂量水平¹³¹I-Cmpd A(68mCi/m²)对SK-MEL-3肿瘤生长的作用。图表显示在用盐水、达卡巴嗪×3、¹³¹I-Cmpd A×1、¹³¹I-Cmpd A×2和¹³¹I-Cmpd A×3的情况下时间与肿瘤变化相比的曲线；

图7显示在各种剂量水平¹³¹I-Cmpd A(68mCi/m²)对小鼠中SK-MEL-3肿瘤生长的作用。图表显示在用盐水、达卡巴嗪×3、¹³¹I-Cmpd A×1、¹³¹I-Cmpd A×2和¹³¹I-Cmpd A×3治疗时实耗时间与动物存活百分数相比的曲线。(请注意如果肿瘤体积＞1500mm³则使动物安乐死)。

定义

用于本文时，某些术语可具有以下限定的含义。

用于本文时，术语″包括″指组合物和方法包括叙述的元素，但不排除其它。当用于限定组合物和方法时，″基本包括″应指当用于预期目的时排除其它元素对组合的任何必需重要性。因此，基本包括如本文限定的元素的组合物将不排除痕量污染物或惰性载体。″由...组成″应指排除超过制备药用组合物的其它成分和基本方法步骤的痕量元素。由这些过渡术语各自限定的实施方案在本方法的范围内。

在描述组合物的细节时，本文给定的数字范围是在组合物中提供功能性结果的那些量。因此，通常用术语″约″引入范围以表明该范围的一定灵活性，即在给定的低和高数字范围±10％或更小。

术语″增溶剂″指用于增溶式I化合物的物质。在一个实施方案中，增溶剂是聚乙二醇或″PEG″。用于本文时，术语″聚乙二醇(PEG)″指式-(OCH₂CH₂)_nOH的聚醚，其中n可根据组合物非常大地改变。例如，PEG可具有约100-约1000g/mol的分子量。在本发明的一些实施方案中，PEG具有约400g/mol的分子量，在本文称为PEG400。

在本发明组合物中另一种合适的增溶剂是式R-OH的醇，其中R是直链或支链的C₁-C₄烃基。实例包括但不限于甲醇、乙醇和丙醇。在一个实施方案中，增溶剂是乙醇。

在一些实施方案中存在不止一种增溶剂。例如，在一个实施方案中，乙醇和PEG都存在于组合物中。

术语“防腐剂”指在使用或贮存条件下保护、预防或阻止腐烂、褪色或其它腐败形式的物质。因此，防腐剂可以是一种或多种抗氧化剂、螯合剂、抗菌剂等。合适的防腐剂包括龙胆酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇、抗坏血酸、咪脲、硫柳汞(thimerisal)、没食子酸丙酯、BHA、BHT、柠檬酸、依地酸二钠等。在一个实施方案中，将龙胆酸钠用于组合物中。

在本发明的一个实施方案中，防腐剂还可充当缓冲剂以调节组合物的pH至约4.0-约4.8的理想范围。在一些实施方案中，pH为约4.1-约4.7。在一个实施方案中，pH为约4.4。用于本目的的合适防腐剂是抗坏血酸。例如，约3.7％抗坏血酸钠和2.7％抗坏血酸可用于达到约4.4的理想pH。

在一个实施方案中，存在至少两种防腐剂。例如，在一个实施方案中，存在龙胆酸钠、抗坏血酸和抗坏血酸钠。

术语″化合物A″指N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代-苯甲酰基氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺。

术语″化合物A前体″或″化合物A-p″指N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰基氨基)-2-甲氧基苯甲酰胺。

术语″化合物B″指苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酸[4-(2-二乙基氨基-乙基氨基甲酰基)-2-碘代-5-甲氧基苯基]酰胺。

术语″化合物B前体″或″化合物B-p″指苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酸[4-(2-二乙基氨基-乙基氨基甲酰基)-5-甲氧基苯基]酰胺。

术语″化合物C″指4-(4-氯代苯甲酰基氨基)-N-(2-(二乙基氨基)乙基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺。

术语″化合物C前体″或″化合物C-p″指4-(4-氯代苯甲酰基氨基)-N-(2-(二乙基氨基)乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺。

术语″化合物D″指N-(2-二乙基氨基-乙基)-5-碘代-2-甲氧基-4-(4-甲氧基(methyoxy)苯甲酰基氨基)苯甲酰胺。

术语″化合物D前体″或″化合物D-p″指N-(2-(二乙基氨基)乙基)-甲氧基-4-(4-甲氧基(methyoxy)苯甲酰基氨基)-苯甲酰胺。

化合物A-D的结构如下显示。

药用组合物

测试所有化合物A、B、C和D，发现在体外和体内都具有黑色素靶向能力。结果证实所有四种待测化合物都具备类似的黑色素靶向能力并从正常组织/器官快速清除。其中化合物A显示明显更高的水溶性和稳定性。

如在实施例中解释，化合物B的制剂试验证实在放射性碘化过程中产物降解；降解杂质的百分数随所用放射性剂量成比例增加。例如，在具有23mCi Na¹³¹I的化合物B制剂中42％所用放射性变成降解副产物。降解杂质的结构用LC/MS确定，其显示化合物B二氧杂环戊烯部份氧化为二羟基的副产物。而且，生物学测试结果显示降解产物的黑色素结合能力明显低于化合物B。

如本文描述优化化合物A制剂和制备方法。一方面，根据修改的Tl((TFA)₃/TFA碘化化学作用评估和优化放射性碘化方法。通过将乙酸加入已知的碘化方法中，本文所述方法可用于剂量递增研究。例如，在不明显改变杂质谱的情况下，在250mCi剂量水平化合物A制剂中获得～90％的放射化学产率(RCY)。另一方面，研究赋形剂的组分，显示提高化合物A药品的溶解度和稳定性。例如，将6％PEG400(w/v)加入赋形剂内明显改善化合物A的溶解度和回收率。又一方面，评估从存在于化合物A粗反应溶液中的剩余前体和任何可能的化学和放射性杂质纯化化合物A药物的HPLC纯化方法。

概括地说，如自始至终证实，(1)化合物A的赋形剂制剂表现比其它衍生物更高的化学稳定性；(2)根据优秀的溶解度、稳定性、黑色素靶向能力以及在荷瘤动物模型中理想的分布特性优选化合物A；(3)提供化合物A强大的制备和纯化过程；(4)提供制剂增强以增加化合物A的稳定性和贮存期；(5)还提供化合物A药品的贮存条件和杂质谱。总之，可制备化合物A药品(在TOC 1.25mCi/mL)，总RCY为70-95％，在冷冻状态下贮存1周(TOE)后RCP＞95％(游离I-131＜5％)。

制备式I化合物和包含式I的药用组合物的方法

还考虑本文提供的方法可用于使化合物A、C和D放射性碘化。本领域教导的已有方法应用三氟乙酸(TFA)和三(2，2，2-三氟乙酰基)铊。因为TFA的严重腐蚀性，所以随时间推移可能发生前体和产物在三氟乙酸(TFA)溶液中降解。因此，考虑在碘化之前使前体溶于乙酸中改善稳定性和/或产率。而且，因为TFA的低熔点和沸点，可以很容易蒸发，特别是使用小体积时。这种蒸发有可能影响标记的重现性。但是，考虑加入乙酸克服这个问题。在大剂量碘化过程如在碘化药物用于治疗目的的情况下，考虑使用乙酸甚至更有价值。通常在治疗时，以每批约3居里制备放射性标记药物，自动化系统通常用于该目的。在通常应用溶液转移技术的自动化系统中TFA的蒸发成问题。考虑加入乙酸增加反应体积用于Tl-复合物形成，不增加降解的水平。

因此，在本发明的一个实施方案中提供制备式I化合物的方法：

化合物可根据方案A合成：

方案A

在提供具体反应之前，应注意所有缩写可见于实施例部份。

将80微克化合物A前体(化合物A-p，以5mg/mL溶于乙酸中)与Tl(TFA)₃(以10mg/mL溶于TFA中)以约1∶1.2的摩尔比混合。在50％乙酸/50％TFA(v/v)中使溶液达到终体积为300μL。在室温下将混合物培养10分钟后，将溶液转移至含有50-100mCi I-131在～50μL 0.1N NaOH/0.02M Na₂SO₄的2-mL Na¹³¹I源瓶内。混合反应溶液，让其在室温下再培养5分钟。

将粗反应物稀释在1.5mL赋形剂(6％PEG400(w/v)，2％乙醇(v/v)，6％抗坏血酸(w/v)，和3％龙胆酸钠(w/v)，pH 4.4)中，用具有C18柱的RP-HPLC纯化产物。用2.5％抗坏血酸(w/v)/0.5％乙酸(v/v)在水中(缓冲液A)和2.5％抗坏血酸(w/v)/85％乙醇(v/v)在缓冲液B中作为溶剂，以2mL/min流速经10分钟用25-60％水(缓冲液B)梯度洗脱化合物。将产物峰收集入30-mL瓶内，通过在真空/氮气流下将瓶在70℃加热30分钟除去收集溶液内的挥发性有机物。

将另外的化合物A(每患者剂量至44μg，在TOC 5mCi)加入散料制剂容器内。将化合物A制剂稀释在赋形剂中，在TOC约104mCi/mg的比放射性中终放射性浓度为1.25mCi/mL。通过使终产物溶液穿过无菌的0.2μm Millex GV注射器式滤器，然后无菌分配至无菌和无热原的2mL瓶内，将溶液灭菌。产物的目标RCP是≥90％，在TOE游离I-131≤5％。

刚才提供的合成可以很容易适用于化合物C和D。

按照以下方案B显示的类似方式还合成¹³¹I-化合物B。

方案B

治疗黑素瘤的方法

如上所述，与黑色素特异性结合的放射性碘化苯甲酰胺衍生物显示它们用作诊断黑素瘤的分子靶向显像剂的潜能；但肿瘤的快速清除影响它们用于治疗目的。但是，¹³¹I-化合物A，N-(2-二乙基氨基-乙基)-4-(4-氟-苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基-苯甲酰胺显示明显高的肿瘤摄取和延长保留。与其它待测化合物相比，¹³¹I-化合物A已证实优秀的稳定性、溶解度、黑色素靶向能力，以及在荷瘤动物模型中理想的分布特性。而且，在人黑素瘤小鼠异种移植模型中已观察到对¹³¹I-化合物A治疗(68mCi/m²)的完全应答(CR)。

因此，本发明的一个实施方案涉及治疗患有黑素瘤的患者的方法，包括给予所述患者药学有效量的本发明组合物。

术语″治疗(treatment)″或″治疗(treating)″指在受试者中对疾病或病症的任何治疗，包括：预防或防御疾病或病症，即导致临床症状不发展；抑制疾病或病症，即阻止或抑制临床症状的发展；和/或缓解疾病或病症，即导致临床症状恢复。

可通过合适途径将本发明组合物给予哺乳动物，例如口服、静脉内、胃肠外、经皮、局部、经直肠或鼻内给药。在一个实施方案中，静脉内给予组合物。

哺乳动物包括，例如人及其它灵长类、宠物或伴侣动物例如狗和猫，实验动物例如大鼠、小鼠和兔，和家畜例如马、猪、羊和牛。在一个实施方案中，哺乳动物是人。

肿瘤或新生物包括组织细胞的生长，其中细胞的增殖不受控制和进行性。一些此类生长是良性的，但其它称为″恶性的″，可导致生物体的死亡。恶性新生物或″癌″与良性生长不同，除了表现侵犯性细胞增生之外，它们可侵入周围组织和转移。而且，恶性新生物的特征在于它们显示较大的分化损失(较大的″去分化″)和相互之间和与周围组织之间机化。这种特性称为″间变″。

通常将组合物以上文描述的药用组合物形式给予患者。这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或者可以过滤灭菌。可将所得水溶液包装使用，或者冻干，在给药之前将冻干制剂与无菌水载体合并。应理解使用上述某些赋形剂、载体或稳定剂将导致药用盐的形成。

本发明化合物和/或组合物的治疗剂量将根据，例如治疗的具体用途、化合物的给药方式、患者的健康和状态以及处方医生的判断而改变。例如，对于口服给药，剂量将通常为每天每公斤体重约5μg-约50mg，优选每天每公斤体重约1mg-约10mg。或者，对于静脉内给药，剂量将通常为每公斤体重约5μg-约50mg，优选每公斤体重约500μg-约5000μg。备选的给药途径考虑包括但不限于鼻内、经皮、吸入、皮下和肌内。可从用体外或动物模型测试系统产生的剂量-效应曲线中推断有效剂量。

给予患者的量将根据给予的药物、给药目的、疗法、患者状态、给药方式等而改变。在治疗应用时，将充分治愈或至少部份阻止疾病及其并发症的进展或症状的量的组合物给予已患疾病的患者。足够完成此目的的量限定为“治疗有效剂量”。有效用于此项用途的量将取决于被治疗的疾病以及由主治医生根据例如疾病、病症或紊乱的严重度、患者的年龄、体重和一般状况等的因素判断。

一般来讲，将通过给予发挥类似功效的药物的任何公认方式给予治疗有效量的本发明组合物。此类化合物的毒性和治疗效果可通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序确定，例如确定LD₅₀(使50％种群致死的剂量)和ED₅₀(在50％种群中治疗有效的剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，可用比率LD₅₀/ED₅₀表示。优选表现大治疗指数的化合物。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED₅₀且很小或无毒性的循环浓度范围内。剂量可根据所用剂型和所用给药途径在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物和/或组合物，最初可用细胞培养测定估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养中确定的IC₅₀(达到最大抑制活性一半的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更精确地确定在人的有用剂量。可以例如通过高效液相层析测量在血浆中的水平。

在B16黑素瘤荷瘤小鼠中¹²³I-化合物B的肿瘤摄取和保留(％ID/g)显示于表B。用公开于Eisenhut et al.，J.Med.Chem.2000，43(21)，3913-22的方法进行那些研究。

表B：¹²³I-化合物B的摄取和保留

1h	5h	48h
			14.8	22.7	16.6

实施例

通过参考以下实施例进一步理解本发明，实施例预期只用于本发明的举例。本发明的范围不限于举例的实施方案，实施方案预期只作为本发明单一方面的举例说明。在功能上等同的任何方法都在本发明范围内。本领域技术人员从上述说明和附图中将清楚除了本文所述之外本发明的各种修饰。此类修饰落在附属权利要求范围内。

除非另外说明否则所有温度都是摄氏度(℃)。而且，在这些实施例和其它地方，缩写具有以下含义：

实施例1：在碘化过程中化合物B的不稳定性

目的：测试描述于本领域的化合物B碘化方法的重现性；进一步评估中间体形成和碘化的培养时间。

实施例1-A：用小规模Na¹³¹I(～1mCi)碘化化合物B

表1-1：实验条件

结果：在～2mCi放射性剂量水平在Tl(TFA)₃/TFA碘化化学作用中成功地进行化合物B标记。标记获得RCP＞90％和游离¹³¹I＜1％。

实施例1-B：中间体形成的培养时间(2，5，10，20和30min)对化合物B标记产率的作用

表1-2：实验条件

结果：在室温下培养2分钟内可完成中间体的形成；延长培养将增加降解产物，因为Tl(TFA)₃的强氧化剂特征。数据在表1-3列出。

表1-3：在室温下铊化的培养时间对化合物B产率的作用

实施例1-C：碘化的培养时间(1，2，5和10min不同)对化合物B产率的作用

表1-4：实验条件

结果：在室温下可在1分钟内完成化合物B的碘化；延长培养时间将不会明显影响RCY。数据在表1-5列出。

表1-5：在室温下碘化时间对化合物B标记产率的作用

	1min	2min	5min	10min
					RCP(％)	83.7	83.5	83.6	85.1
杂质(％)	10.4	11.4	10.4	9.7

实施例1-D：降解随用于化合物B标记的放射性剂量而增加

表1-6：实验条件

结果：降解杂质百分数的数据随用于化合物B标记的¹³¹I放射性剂量而增加。用2.2或23mCi Na¹³¹I标记化合物B的降解产物的比较在表1-7列出。

表1-7：降解副产物随用于化合物B标记的放射性剂量而增加

	2.2mCi	23mCi
			RCP(％)	89.5	54.8
降解杂质(％)	5.8	42.8

降解杂质经鉴定为前体(化合物B-p)和终产物(化合物B)二氧杂环戊烷部份变成二羟基形式的降解产物，如在实施例2中讨论。

根据以上实验，化合物B可通过Tl(TFA)₃/TFA化学作用形成。在室温下培养5分钟内可完成Tl(TFA)₂-化合物B复合物的中间体，增加培养时间将增加药品的降解，因为Tl(TFA)₃的氧化性质。在化合物B标记时可在室温下培养5分钟内用Tl(TFA)₂完成¹³¹I的亲核取代。证明化合物B的化学稳定性差，降解的水平随用于化合物B标记的放射性剂量而明显增加。

实施例2：通过LC/MS鉴定化合物B的降解副产物

这些实施例的目的是通过LC/MS鉴定化合物B的实测主要降解副产物。

表2-1：实验条件

结果：已通过LC/MS鉴定降解杂质，数据在表2-2列出。结果证明前体(化合物B-p)和终产物(化合物B)都发生二氧杂环戊烷部份变成二羟基形式的降解。

表2-2：通过LC/MS鉴定化合物B-p和化合物B的降解杂质

实施例3：提高化合物B稳定性的尝试

本实施例的目的是研究在化合物B放射性碘化中使用备选碘化方法以减少降解从而提高RCY的可能性。

实施例3-A：在KIO₃碘化方法中碘化的¹²⁷I-化合物B

表3-1：实验条件

实施例3-B：在Tl(TFA)₃/BF₃.Et₂.O碘化方法中碘化的¹²⁷I-化合物B

表3-2：实验条件

结果：RCY低，总RCY为约10％。而且，在这种碘化方法中观察到新的杂质形式。

实施例3-C：通过使用化合物B的Tin-前体标记化合物B

表3-3：实验条件

结果：在室温下培养10分钟内可完成反应。但是，在这种描述的分析HPLC条件下有杂质峰(13.9％)，保留时间为6.9分钟。与Tl(TFA)₃/TFA方法相比，没有一种待测备选碘化方法显示在化合物B放射性碘化中使用的显著益处。

实施例4：使用保护剂减少化合物B降解的尝试

目的：将保护剂二氧杂环戊烷和三氧杂环己烷加入Tl(TFA)₃/TFA碘化溶液中以通过减少降解副产物的形成提高化合物B的产率。

实施例4-A：二氧杂环戊烷对化合物B形成的保护作用

表4-1：实验条件

结果：与对照(不加入二氧杂环戊烷)相比，将二氧杂环戊烷加入反应溶液内可明显减少化合物B的降解。数据在表4-2列出。该结果间接证实化合物B的降解是由于药品的二氧杂环戊烷部份氧化为二羟基，因为Tl(TFA)₃的氧化剂性质。

表4-2：加入二氧杂环戊烷以明显改善用2.2或23mCi Na¹³¹I标记化合物B的产率

实施例4-B：三氧杂环己烷对化合物B形成的保护作用

表4-3：实验条件

结果：将三氧杂环己烷加入Tl(TFA)₃/TFA碘化反应溶液内也可增加化合物B的产率和减少降解。将二氧杂环戊烷或三氧杂环己烷加入Tl(TFA)₃/TFA碘化反应溶液内都可明显减少化合物B的降解，从而提高RCY。该结果间接证实化合物B的降解是由于药品的二氧杂环戊烷部份氧化成二羟基，因为Tl(TFA)₃的氧化剂性质。保护功效可能不够高至用于治疗剂量化合物B放射性碘化，但在23mCi化合物B标记时加入20μL二氧杂环戊烷可将降解从42.8％减少至11.6％。

实施例5：比较用不同批次前体(化合物B-p)碘化的化合物B的稳定性

目的：通过使用由不同供应商(Cambridge major和University of Heidelberg，目录号分别为140-0124和140-0114)制造的两批不同的化合物B-p证实在化合物B碘化过程中降解杂质的产生。

表5-1：实验条件

结果：在两批不同的化合物B前体中标记化合物B的RCY和鉴定降解杂质百分数没有显著差异。比较的数据在表5-2列出。

表5-2：在用两批不同的化合物B-p标记(用0.9mCi Na¹³¹I)的化合物B中观察到的降解杂质

	化合物B-p	化合物B-p
			RCP(％)	87.6	86.2
鉴定的杂质(％)	4.1	4.7

实施例6：比较化合物C、化合物D和化合物A在¹³¹I-标记中的稳定性

目的：(化合物C、化合物D和化合物A)与化合物B(加入或不加二氧杂环戊烷)一起并列比较¹³¹I-标记产率和稳定性。

实施例6-A：¹³¹I-标记化合物C、化合物D、化合物A和化合物B.

表6-1：实验条件

结果：Tl(TFA)₃/TFA碘化法可用于¹³¹I-化合物C、¹³¹I-化合物D和化合物A。与化合物B不同，在2.5mCi放射性剂量水平标记(¹³¹I-化合物C、¹³¹I-化合物D或化合物A)过程中几乎没有出现降解杂质。比较的数据在表6-2列出。

表6-2：在Tl(TFA)₃/TFA碘化化学作用中化合物C、化合物D和化合物A的¹³¹I-标记中未见降解

^*用10μL二氧杂环戊烷保护

实施例6-B：通过加入辐解保护缓冲剂标记和保护后的化合物A和化合物B之间的稳定性比较

表6-3：实验条件

^*保护溶液：10％抗坏血酸，5.6％龙胆酸钠，6％PEG400，pH＝3.4

结果：在标记和稀释在辐解保护溶液中后，在室温下贮存3天过程中化合物B与化合物A的稳定性之间没有显著差异。比较的数据在表6-4列出。

表6-4：在室温下贮存3天化合物B与化合物A之间的稳定性比较(在标记后将样品用辐解保护缓冲剂稀释，终放射性浓度为～11mCi/mL)

Tl(TFA)₃/TFA方法可用于化合物C、化合物D和化合物A的¹³¹I-标记。与化合物B不同，¹³¹I-化合物C、¹³¹I-化合物D和¹³¹I-化合物A稳定，在放射性碘化过程中几乎不出现降解。

在标记接着稀释在辐解保护溶液中后化合物B与化合物A之间没有稳定性差异(化合物B的降解只出现在氧化剂如Tl(TFA)₃的存在下放射性碘化过程中)。

实施例7：比较化合物C、化合物D和化合物A的溶解度

目的：在3mg/mL浓度下化合物C、化合物D和化合物A的溶解度测试。

实施例7-A：显示化合物C、化合物D和化合物A的水溶性的显著差异

首先使化合物溶于PEG400和乙醇中，然后稀释在基质中达到终浓度3mg/mL。溶液基质的组分包括3％龙胆酸钠(w/v)和6％抗坏血酸(w/v)(pH＝3.6)。将制备的样品溶液保持在室温，肉眼检查。结果在表7-1列出。

表7-1：在首先溶于PEG400/乙醇然后稀释在基质中的化合物A、化合物D与化合物C(3mg/mL)之间的溶解度比较

而且，在pH＝4.3溶解度比较也显示如上所述的类似结果。

实施例7-B：加入乙酸提高化合物C和化合物D的溶解度

首先使化合物溶于乙酸中，然后用PEG400/乙醇稀释；将溶液最后稀释在基质中达到终浓度3mg/mL。基质的组分包括3％龙胆酸钠(w/v)和6％抗坏血酸(w/v)(pH＝3.6)。将制备的样品溶液保持在室温，肉眼检查。结果在表7-2列出。

表7-2：在溶于乙酸、接着溶于PEG400/乙醇、最后稀释在基质中的化合物D与化合物C(3mg/mL)之间的溶解度比较

实施例7-C：在室温下贮存1周化合物A、化合物C与化合物D之间的溶解度比较

首先使化合物C和化合物D溶于乙酸中，然后用PEG400/乙醇稀释；将溶液最后稀释在基质中达到终浓度3mg/mL。基质包括3％龙胆酸钠(w/v)和6％抗坏血酸(w/v)(pH＝3.6)。将制备的样品溶液保持在室温，肉眼检查。用HPLC分析待测化合物在溶液或在上清液中的浓度。结果在表7-3列出。

表7-3：在室温下贮存1周化合物A、化合物D与化合物C(3mg/mL)之间的溶解度比较；用HPLC确认其浓度

^*未加入乙酸；^**制备后为澄清溶液，接着贮存后约2小时出现沉淀；^***在上清液中的浓度.

所有3种待测化合物(化合物C、化合物D和化合物A)都显示水溶性差，在溶液制备时需要共溶剂PEG400。

水溶性的顺序是化合物A＞化合物D＞＞化合物C。

实施例8：加入乙酸对¹²⁷I-化合物A碘化的作用

目的：增加体积和降低¹²⁷I-化合物A碘化的腐蚀水平。

表8-1：实验条件

结果：在Tl(TFA)₃/TFA反应溶液中加入乙酸对化合物A的碘化无明显影响，根据计算所用化合物A-p与Na¹²⁷I的摩尔比可完成反应。

实施例9：前体浓度对¹²⁷I-化合物A碘化产率的作用

目的：通过用固定量的前体和增量的TFA/乙酸(1∶2体积)评估前体浓度对¹²⁷I-化合物A碘化产率的作用。

表9-1：实验条件：

结果：化合物A-p的浓度是关键，当化合物A-p的浓度为0.08mg/mL时几乎没有标记。比较的数据在表9-2列出。

表9-2：化合物A-p浓度对化合物A药品产率的作用

实施例10：溶于0.1N NaOH中的Na¹²⁷I体积对¹²⁷I-化合物A碘化产率的作用

目的：评估水溶液(Na¹²⁷I在0.1N NaOH中)体积对¹²⁷I-化合物A碘化产率的作用。

表10-1：实验条件

结果：数据在表10-2列出，该数据证明化合物A优选在乙酸/TFA有机溶液中碘化，产率随所用水溶液(0.1N NaOH)的体积而降低。

表10-2：NaI溶液体积对化合物A药品产率的作用

实施例11：具有70和250mCi Na¹³¹I的化合物A制剂

目的：检查用增加剂量70或250mCi Na¹³¹I配制化合物A的可行性和稳定性。

实施例11-A：具有70mCi Na¹³¹I的化合物A制剂

表11-1：实验条件

实施例11-B：具有250mCi Na¹³¹I的化合物A制剂

表11-2：实验条件

结果：在本测试中初步评估剂量增加在优化化合物A碘化方法中的可能性。将摩尔比为1.2的Tl(TFA)₃和化合物A-p用于中间体反应中，在室温下培养10分钟，然后将其转移至放射源瓶内，混合和再培养5分钟。结果证实当大剂量250mCi用于化合物A制剂中时放射性杂质谱无显著改变，RCY＞95％(表11-3)。

表11-3：化合物A制剂的剂量增加的预实验总结

	70mCi	250mCi
				n＝3	n＝2
TFA/乙酸	0.2mL	0.2mL
			化合物A-p	55μg	196μg
Tl(TFA)₃	92μg	330μg
			Na¹³¹I	70mCi(20μL)	250mCi(30μL)
RCY(％)	97.6；98.0；94.4	96.2；96.5
			游离¹³¹I(％)	0.6；1.2；0.3	0.5；0.5

实施例12：确定用于化合物A制剂的赋形剂组分

目的：评估和最终确定用于化合物A制剂以维持药品的溶解度和稳定性的赋形剂组分。

实施例12-A：pH对化合物A溶解度的作用

急性毒性试验的暂行计划要求3mg/mL浓度的化合物A溶液。制备样品溶液，首先使化合物A药物溶于PEG400中，然后稀释在pH范围4.05-4.95的基质中，得到终PEG400浓度为30％(w/v)。基质的组分包括3％龙胆酸钠(w/v)和6％抗坏血酸(w/v)。抗坏血酸盐的pKa是4.17，通过混合不同部份的抗坏血酸钠和抗坏血酸调节基质溶液的pH，得到6％的总抗坏血酸(钠盐形式加游离酸形式)。在室温下保持制备样品溶液的溶解度并通过肉眼检查。结果在表12-1列出。

表12-1：溶于PEG400然后稀释在不同pH基质中的化合物A药物(3mg/mL)的溶解度.

实施例12-B：化合物A在PEG400中的溶解度

在0.8mg/mL或16μg/mL浓度进行化合物A的长期溶解度试验。首先使化合物A药物溶于PEG400内，然后稀释在基质中，在终溶液中产生不同％的PEG400。基质的组分包括3％龙胆酸钠(w/v)、2％乙醇(v/v)和6％抗坏血酸(w/v)(3.7％抗坏血酸钠和2.7％抗坏血酸)在SWFI中，终pH为4.3。肉眼检查制备样品溶液的溶解度，通过HPLC分析确认。结果在表12-2列出。

表12-2：加入PEG400以增加化合物A药物的溶解度.

结果：根据观察，用于化合物A药品制剂的赋形剂的最终组分如下：

6％PEG400(w∶w)

2％乙醇(v/v)

3％龙胆酸钠(w/v)

6％抗坏血酸(w/v)(3.7％抗坏血酸钠和2.7％抗坏血酸)

pH 4.4±0.3

实施例13：选择注射器式滤器使化合物A药品的回收率最大化

目的：评估、比较和选择无菌注射器式滤器使放射性回收率最大化。

制备用于本试验的化合物A混合物溶液，方法是将0.5mL(～1.2mCi)和30mL赋形剂(6％PEG400，3％龙胆酸钠和6％抗坏血酸，pH＝4.3)混合。每次滤器试验应用4mL等份样品溶液，用10mL真空瓶洗脱溶液。测量残留在滤器上的放射性并回收在收集溶液中；计算滑擦(slicked)在膜上的放射性百分数。结果在表13-1中列出。

表13-1：评估和选择用于化合物A药品无菌过滤的注射器式滤器.

^*阻力太高，样品溶液不容易通过膜过滤.

^**这种产品没有无菌形式可市售获得.

^***通过将膜预湿和/或用增加浓度的化合物A可明显减少粘附.

实施例14：化合物A药品(1.25mCi/mL)在不同温度，RT与-80℃的稳定性

目的：评估和比较化合物A(1.25mCi/mL)药品在不同温度下贮存的稳定性。

检测和比较在不同温度下贮存后化合物A药品在赋形剂[6％PEG400(w/v)，3％龙胆酸钠(w/v)，2％乙醇(v/v)，3.7％抗坏血酸钠(w/v)，和2.7％抗坏血酸(w/v)在SWFI中，终pH为4.3]中的稳定性。

将大约42mCi化合物A粗反应溶液注入HPLC内，收集33.6mCi化合物A药品。通过在70℃将瓶加热60分钟除去药品收集液中的挥发性有机物。将化合物A药品稀释在赋形剂中，在TOC达到1.25mCi/mL终放射性浓度，然后分配入2-mL瓶内。将样品贮存在室温下或在冰箱(-80℃)中。在预定时间点检测RCP，结果在表14-1列出。

表14-1：经过在室温或-80℃贮存7天化合物A药品(1.25mCi/mL，每瓶2mL)的稳定性.

^*在加热过程中不保护在HPLC收集溶液中的药品.

结果：在冰箱(-80℃)中贮存1周化合物A药品是稳定的；而在室温下分别贮存后0和7天游离¹³¹I从9.3％增加至18.5％。

实施例15：在室温与-80℃贮存的化合物A药品(10mCi/mL)的稳定性比较

目的：评估和比较放射性浓度为10mCi/mL的化合物A药品在不同温度：室温与-80℃的稳定性.

将大约60mCi化合物A粗反应溶液注入HPLC内，收集43.8mCi化合物A药品。通过在70℃将瓶加热60分钟除去药品收集液中的挥发性有机物。将化合物A稀释在赋形剂中达到10mCi/mL终放射性浓度，然后分配入2-mL瓶内。将样品贮存在室温下或在冰箱(-80℃)中。在预定时间点检测RCP，结果在表15-1列出。

表15-1：在室温或-80℃贮存8天化合物A药品(10mCi/mL)的稳定性.

^*在加热过程中用赋形剂保护化合物A HPLC收集液.

结果：在冰箱(-80℃)中贮存8天化合物A药品的游离¹³¹I＜5％；而在室温下分别贮存后0和8天游离¹³¹I从1.5％增加至15.0％。

实施例16：¹³¹I-Cmpd A、¹³¹I-Cmpd B、¹³¹I-Cmpd C和¹³¹I-Cmpd D在小鼠中的器官分布和肿瘤蓄积

在B16F10荷瘤小鼠中进行器官分布和肿瘤蓄积实验。在静脉内给予药物后的指定时间(1小时和24小时)，将动物处死，切除器官和肿瘤，任选擦干，称重，用相应的同位素标准品在校准器中测量放射性含量。将结果用注射剂量/组织gm的％表示。图4表示¹³¹I-Cmpd A、¹³¹I-Cmpd B、¹³¹I-Cmpd C和¹³¹I-Cmpd D在B16F10荷瘤小鼠中的生物分布。图表提示在所有4种待测化合物中观察到理想的分布特性。

实施例17：¹³¹I-Cmpd A对小鼠中SK-MEL-3肿瘤生长的作用

在小鼠中研究¹³¹I-Cmpd A(68mCi/m²)对SK-MEL-3肿瘤生长的作用。盐水和达卡巴嗪作为参考物用于研究。在本实验中，每天1次、每天2次和每天3次将68mCi/m²剂量的¹³¹I-Cmpd A给予不同批次小鼠。治疗持续125天。如果肿瘤体积大于1500mm³则使小鼠安乐死。密切监测受治疗的小鼠，如果出现接近死亡的任何体征则将其处死。每隔几天监测肿瘤变化(肿瘤的长度和宽度)。定量测量肿瘤变化，图6显示的结果表明¹³¹I-Cmpd A减少肿瘤生长的功效。而且，图7显示的结果表明¹³¹I-Cmpd A增加小鼠存活率的功效。

实施例18：合成N-(2-二乙基氨基-乙基)-4-(4-氟代-苯甲酰基氨基)-5-碘代-2-甲氧基-苯甲酰胺(化合物A)

标题化合物可用本领域已知的方法合成，所述方法类似于在WO2005/089815中例举的合成法，其通过引用完全结合到本文中。

实施例19：合成苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酸[4-(2-二乙基氨基-乙基氨基甲酰基)-2-碘代-5-甲氧基苯基]酰胺(化合物B)

实施例20：合成4-(4-氯代-苯甲酰基氨基)-N-(2-二乙基氨基-乙基)-5-碘代-2-甲氧基-苯甲酰胺(化合物C)

实施例21：合成N-(2-二乙基氨基-乙基)-5-碘代-2-甲氧基-4-(4-甲氧基(methyoxy)-苯甲酰基氨基)-苯甲酰胺(化合物D)

其它实施方案

本领域技术人员将明白其它实施方案。应理解提供上述详细说明只是为了清楚起见，仅用于举例说明。本发明的主题和范围不限于上述实施例，而是包括在以下权利要求中。本文引用的所有文献内容通过引用完全结合到本文中。

Claims

1.一种药用组合物，所述药用组合物包含：

式I化合物：

至少一种增溶剂；和

至少一种防腐剂；

其中所述组合物具有约4.0-约4.8的pH。

2.权利要求1的组合物，包含约1.25mCi/毫升式I化合物。

3.权利要求1的组合物，包含：

约6％聚乙二醇(w/v)；

约2％乙醇(v/v)；

约3％龙胆酸钠(w/v)；和

约6％抗坏血酸(w/v)。

4.权利要求1的组合物，其中抗坏血酸是约3.7％抗坏血酸钠和2.7％抗坏血酸。

5.权利要求1的组合物，还包含N-(2-(二乙基氨基)乙基)-4-(4-氟代苯甲酰氨基)-5-碘代-2-甲氧基苯甲酰胺。

6.一种制备式III化合物：

的方法，其中R是氟、氯或甲氧基，所述方法包括在反应条件下使式II化合物：

7.一种制备式I化合物：

的方法，其中R是氟、氯或甲氧基，包括在第一反应条件下使式II化合物：

接触溶液，所述溶液包含至少约1当量三(2，2，2-三氟乙酰基)铊和1∶1体积比的三氟乙酸和乙酸，以得到式III化合物：

在第二反应条件下使式III化合物接触包含至少约0.5-约0.7当量¹³¹碘化钠的溶液，以得到式I化合物。

8.权利要求6或7的方法，其中式II化合物存在于包含乙酸的溶液中。

9.权利要求6或7的方法，其中三(2，2，2-三氟乙酰基)铊存在于包含三氟乙酸的溶液中。

10.权利要求6或7的方法，其中¹³¹碘化钠处于包含氢氧化钠和硫酸钠的溶液中。

11.权利要求6的方法，其中反应条件包括在约25摄氏度约15分钟反应时间。

12.权利要求7的方法，其中第一反应条件包括在约25摄氏度约10分钟反应时间。

13.权利要求7的方法，其中第二反应条件包括在约25摄氏度约5分钟反应时间。

14.权利要求7的方法，还包括分离式I化合物。

15.权利要求14的方法，其中分离包括高效液相层析。

16.一种通过给予药学有效量的权利要求1的药用组合物治疗患有黑素瘤的患者的方法。