CN102199635B - 一种利用产油微生物制备生物柴油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物工程领域,具体涉及一种利用产油微生物制备生物柴油的方法。本发明所述方法包括:步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应,去除水相,得到油相;步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。本发明所述一种利用产油微生物制备生物柴油的方法直接采用含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液为原料,以水解、酯化两步反应制备生物柴油,降低了能耗,避免了一步转酯化反应中的可逆反应,提高了生物柴油的转化率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程领域,具体涉及一种利用产油微生物制备生物柴油的方法。
背景技术
随着石油资源的日益枯竭和人类环保意识的不断增强,发展清洁可再生能源显得尤为重要。生物柴油是以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂等为原料油,与醇类通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的燃料,是一种对环境友好的可再生能源。与石化柴油相比,生物柴油具有许多明显的优势,其含硫量低,可减少约30%的二氧化硫和硫化物的排放;其具有较好的润滑性能,可以降低喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损,延长其使用寿命;其具有良好的燃烧性能,而且在运输、储存、使用等方面的安全性均好与普通柴油。
目前,生物柴油所用原料来源主要有三个方面:首先是依靠种植油料植物,如棕榈树、麻风树、油菜等,但是油料植物的油脂产率不高,大力发展生物柴油必然要占用大量耕地,影响粮食生产;其次是依靠动物油脂,然而近两年来世界范围内的农产品价格上涨,导致以动物油脂为原料的生物柴油成本上升;最后是利用餐饮废油、酸化油、地沟油等废弃油脂,但是这些废油中含有许多醛、酮和聚合物等物质,以废油制备生物柴油必然影响其品质,达不到清洁能源的要求。
针对上述问题,人们致力于寻找一种新的原料,而产油微生物以种类繁多、分布广、繁殖快、成本低的特点成为生产生物柴油新的油脂资源。产油微生物指产生并储存的油脂占其生物总量的20%以上的酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物,它们能够直接利用阳光、CO2、氮、磷等简单营养物质快速生长并在胞内合成大量油脂(主要是甘油三酯),其脂肪酸组成与动植物来源的油脂相似,可以代替动植物油脂制备食用油和生物柴油。
现阶段用产油微生物制备生物柴油的方法主要包括碱催化、酸催化法、超临界法以及脂肪酶催化法。用碱催化法生产生物柴油,由于反应中有皂脚形生成,形成絮状沉淀,使得生物柴油产品不易分离,同时反应过程中生成的皂脚、甘油易与生物柴油、甲醇等乳化,此外反应中易排放废水,形成二次污染。酸催化法因采用大量的酸作为催化剂,使得生物柴油酸值较高,需用水洗涤,这样势必会产生大量废液,加大处理难度,增加环境压力。超临界法制备生物柴油条件苛刻,温度压强过高,对设备要求较高,另外,较高的醇油比造成分离甲醇等短链醇的成本增加。
与上述传统化学方法相比,脂肪酶催化法生产生物柴油工艺简单,反应条件温和、污染小,反应过程中无酸、碱物质不会发生皂化反应,反应时不需要过量的醇,分离、提取简单。如中国专利CN101445741A,公开了“一种微生物柴油的生物合成法”。但是,该方法中采用干燥菌体进行制备生物柴油,增加了能耗,不利于工业生产。同时,该方法的生物柴油转化率不高。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种利用产油微生物制备生物柴油的方法,使得该方法能够提高生物柴油转化率。
本发明所述一种利用产油微生物制备生物柴油的方法,包括:
步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应,然后去除水相,得到油相;
步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。
其中,所述产油微生物优选为小球藻、栅藻、螺旋藻或粘红酵母。本发明所述破壁可采用现有常规技术对产油微生物细胞壁破壁,优选为采用细胞壁降解酶破壁,所述细胞壁降解酶可以是一种或多种。其中,藻类微生物以纤维素酶为主,酵母类微生物以多糖水解酶或蛋白酶为主,细菌和霉菌以溶菌酶为主。
藻类微生物菌体发酵液的制备方法为取种子液对数期进行接种,接种量为20%,初始pH值为7.5,温度27℃,光照4000lx,通无菌空气培养8天则达到稳定期;粘红酵母菌体发酵液是在220rpm/min、30℃下培养种子液18h,然后转入液体培养基中培养5天获得。
在现阶段的生物柴油合成中,无论选择何种原料,许多工艺都采用一步转酯化反应来制备,有些工艺还在反应中加入了水。但是,油脂主要是甘油三酯,在一步转酯化的过程中,短链醇置换掉甘油三酯上的甘油(丙三醇),生成长链脂肪酸酯,即生物柴油,随着反应的进行,甘油越来越多,短链醇越来越少,部分甘油开始重新替换短链醇生成甘油三酯,出现可逆反应,使转酯化反应不彻底。在有些加水的工艺中,由于脂肪酶在含水较多的情况下会发生水解反应,也会出现可逆反应,进一步影响生物柴油的合成,使生物柴油转化率降低。
针对上述问题,本发明采用两步法来制备生物柴油。为避免过多的能耗,本发明直接采用微生物发酵液作为原料,由于在微生物油脂提取液中含有较多水分,而脂肪酶在水分较多的情况下会发生水解反应,所以本发明第一步反应是向微生物油脂提取液中加入脂肪酶进行水解反应,将甘油三酯水解为长链脂肪酸和甘油,然后去除水相获得油相(主要是长链脂肪酸)。因为甘油溶于水,所以甘油不会随油相进入到下步的酯化反应中,避免了由于甘油量过多而导致的可逆反应。在第二步的酯化反应中,本发明加入脂肪酶、短链醇将水解反应中得到的长链脂肪酸转化为生物柴油。由于在酯化反应中不存在水分,故脂肪酶不会起水解活性,而是催化短链醇与长链脂肪酸生成对应的长链脂肪酸酯,即生物柴油,从而避免了由于水分的存在引起的可逆反应,提高了生物柴油的转化率。
此外,脂肪酶能够在油-水界面下实施催化功能,适当的水分可以使脂肪酶分子的极性和柔性增加,并通过非共价力来维持其催化结构,从而使其活性上升;而过少的水分无法促使脂肪酶发挥其活性;过量的水会使脂肪酶的中心形成水簇,从而导致酶的失活。故本发明对发酵液的含水量进行调节,使发酵液含30-70%水分,优选为含50%水分。使得脂肪酶在进行水解反应时能够发挥最大活性。
其中,所述水分与步骤1所述脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.001-0.005g,优选为1ml∶0.003g;所述油相与步骤2所述脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.002-0.01g,优选为1ml∶0.006g;水解反应时间为10-12h,摇速为160-180rpm/min,温度为30-45℃;酯化反应时间为8-10h,摇速为180-220rpm/min,温度为30-45℃,所述油相与短链醇的体积比为1∶5-15,优选为1∶9。本发明所述脂肪酶均为市售,酶活为5000U/g。
在进行酯化反应时,为避免一次性加入短链醇对脂肪酶活性造成影响,本发明分三次加入短链醇,频率为每2h加一次,每次加入量为总体积的1/3,所述短链醇优选为甲醇或乙醇。目前国内外利用该反应生产生物柴油的研究很多,但多数研究都是围绕利用植物油和甲醇反应进行的,甲醇对脂肪酶具有很高的毒性,而且在生产中会对工作人员的安全造成很大的威胁。相比较而言,乙醇毒性较小且更加安全,生产出的脂肪酸乙酯不仅可以作为生物柴油,而且在其他领域也有很高的应用价值。长碳链脂肪酸乙酯具有优良的润滑性、柔软性、铺展性,广泛应用于化妆品、医药、塑料、纺织、皮革、机械切削加工等行业,长碳链脂肪酸乙酯的另一重要应用是用作脂肪酸衍生物中间体。因此,本发明更优选为乙醇。
由以上技术方案可知,本发明所述一种利用产油微生物制备生物柴油的方法直接采用含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液为原料,以水解、酯化两步反应制备生物柴油,降低了能耗,避免了一步转酯化反应中的可逆反应,提高了生物柴油的转化率。
附图说明
图1所示为本发明实施例1水解反应所得油相的气相色谱图;
其中,1所示为棕榈酸峰,2所示为9,12-二烯十八酸峰,3所示为油酸峰,4所示为硬脂酸峰,5所示为油酰氯峰;
图2所示为本发明实施例1所得生物柴油的气相色谱图;
其中,1所示为溶剂峰,2-5所示为生物柴油成分峰(依次为棕榈酸乙酯、9,12-二烯十八酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯),6所示为未完全水解的甘油三酯峰。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种利用产油微生物制备生物柴油的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种利用产油微生物制备生物柴油的方法,包括:
步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应,然后去除水相,得到油相;
步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油。
其中,所述发酵液为含30-70%水分的发酵液,优选为含50%水分的发酵液。所述水分与步骤1所述脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.001-0.005g,优选为1ml∶0.003g。所述油相与步骤2所述脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.002-0.01g,优选为1ml∶0.006g。所述脂肪酸与短链醇的摩尔比为1∶5-15,优选为1∶9。所述短链醇为甲醇或乙醇。所述产油微生物优选为小球藻、栅藻、螺旋藻或粘红酵母。
生物柴油产品的主要成分为C16和C18脂肪酸酯,具体是何种脂肪酸酯要根据加入的短链醇而定。作为普通柴油替代品的生物柴油应当拥有较长的碳直链,一般认为16-19个碳比较合适,过长则会使其熔点过高而导致流动性和低温性变差;双键的数目尽可能要少,最好只有一个双键,含有双键可以保证在常温保持液体状态,增加流动性,特别是低温流动性,保证了作为燃料使用的必要条件;含有一定量的O元素,分子结构尽可能没有或只有很少的碳支链,由于没有碳支链的存在可以使生物柴油易于氧化,保证燃烧充分,不会产生炭沉积而堵塞燃料的喷嘴;分子中不含有芳香烃结构,因为没有芳香烃的存在,可以保证充分燃烧,不会产生炭黑。
本发明在进行完水解反应时对得到的油相进行了气相色谱检测,结果显示水解后的油相大都是以C16和C18的长链脂肪酸为主,由此可以推断酯化后生成的脂肪酸酯也以C16和C18的脂肪酸酯为主,符合生物柴油标准。
本发明还对最终制备的生物柴油进行了气象色谱分析,结果显示,生物柴油的主要成分是C16和C18的脂肪酸酯,转化率在78-92%,表明本发明所述方法能够获得高转化率、高质量的生物柴油。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实施例1:利用小球藻制备生物柴油
取2L小球藻发酵液浓缩,使含水量为60%,70℃水浴2h,加入纤维素酶和中性蛋白酶共1.2g(纤维素酶和中性蛋白酶质量比为4∶3,纤维素酶酶活为1000U/g,中性蛋白酶酶活为60000U/g)破碎处理1h,将2.4g的脂肪酶加入到处理液中水解12h,摇速160rpm/min,温度30℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.004g,并加入乙醇,所述油相与乙醇的体积比为1∶7,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,220rpm/min,温度30℃,反应8h后获得生物柴油。
实施例2:本发明所制生物柴油的气相色谱分析
将实施例1中水解反应获得的油相和最终制备的生物柴油进行气相色谱分析,谱图参见图1和图2,结果参见表1和表2。
表1实施例1水解反应所得油相的气相色谱结果
峰 | 英文名 | 分子量 | 分子式 | 中文名 |
1 | Hexadecanoic acid | 256 | C16H32O2 | 十六(烷)酸/棕榈酸 |
2 | 9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z) | 280 | C18H32O2 | 9,12-二烯十八酸 |
3 | Oleic Acid | 282 | C18H34O2 | 油酸 |
4 | Octadecanoic acid | 284 | C18H32O2 | 硬脂酸 |
5 | Oleoyl chloride | 300 | C18H32O2 | 油酰氯 |
结合图1和表1可知,水解后的油相大都是以C16和C18的长链脂肪酸为主,由此可以推断酯化后生成的长链脂肪酸酯也以C16和C18的长链脂肪酸酯为主,符合生物柴油标准。
表2实施例1所得生物柴油气相色谱结果
峰 | 保留时间 | 面积 | 面积百分比 | 分离因子 | 中文名 |
1 | 1.099 | 718917049.6 | 99.8030 | 0.000 | 乙腈 |
2 | 4.891 | 166247.2 | 0.0231 | 0.000 | 棕榈酸乙酯 |
3 | 5.562 | 430775.5 | 0.0598 | 1.177 | 9,12-二烯十八酸乙酯 |
4 | 5.604 | 222816.9 | 0.0309 | 1.009 | 油酸乙酯 |
5 | 5.640 | 421451.9 | 0.0585 | 1.008 | 硬脂酸乙酯 |
6 | 16.704 | 177981.2 | 0.0247 | 3.436 | 甘油三酯 |
图2和表2显示,实施例1所制生物柴油成分主要是C16和C18长链脂肪酸乙酯,各方面均符合生物柴油标准。此外,除去溶剂峰面积,生物柴油成分峰总面积为1241291.5(2-5峰),所有峰总面积为14192727.7(2-6峰),两个峰面积相比的生物柴油转化率为87.46%,表明本发明所述方法能够获得高转化率和高质量的生物柴油。
实施例3:利用螺旋藻制备生物柴油
取2L螺旋藻发酵液浓缩,使含水量为40%,70℃水浴2h,加入纤维素酶和中性蛋白酶共1.2g(纤维素酶和中性蛋白酶质量比为4∶3,纤维素酶酶活为1000U/g,中性蛋白酶酶活为60000U/g)破碎处理1h,将0.8g的脂肪酶加入到处理液中水解10h,摇速160rpm/min,温度40℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.002g,并加入甲醇,所述油相与甲醇的体积比为1∶5,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为180rpm/min,温度40℃,反应10h后获得生物柴油。
依照与实施例2相同的色谱条件,将实施例3中水解反应获得的油相和最终制备的生物柴油进行气相色谱分析,结果显示生物柴油成分主要是C16和C18长链脂肪酸乙酯,各方面均符合生物柴油标准,生物柴油转化率为78.89%。
实施例4:利用粘红酵母制备生物柴油
取2L粘红酵母发酵液浓缩,使含水量为50%,70℃水浴2h,加入中性蛋白酶1.2g破碎处理1h(中性蛋白酶酶活为60000U/g),将3g的脂肪酶加入到处理液中水解10h,摇速160rpm/min,温度35℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.006g,并加入乙醇,所述油相与乙醇的体积比为1∶9,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为200rpm/min,温度35℃,反应12h后获得生物柴油。
依照与实施例2相同的色谱条件,将实施例4中水解反应获得的油相和最终制备的生物柴油进行气相色谱分析,结果显示生物柴油成分主要是C16和C18长链脂肪酸乙酯,各方面均符合生物柴油标准,生物柴油转化率为92.74%。
实施例5:利用栅藻制备生物柴油
取2L栅藻发酵液浓缩,使含水量为30%,70℃水浴2h,加入纤维素酶和中性蛋白酶共1.2g(纤维素酶和中性蛋白酶质量比为4∶3,纤维素酶酶活为1000U/g,中性蛋白酶酶活为60000U/g)破碎处理1h,将2.4g的脂肪酶加入到处理液中水解10h,摇速160rpm/min,温度37℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.008g,并加入乙醇,所述油相与乙醇的体积比为1∶12,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为200rpm/min,温度37℃,反应11h后获得生物柴油。
依照与实施例2相同的色谱条件,将实施例5中水解反应获得的油相和最终制备的生物柴油进行气相色谱分析,结果显示生物柴油成分主要是C16和C18长链脂肪酸乙酯,各方面均符合生物柴油标准,生物柴油转化率为89.22%。
实施例6:利用粘红酵母制备生物柴油
取2L粘红酵母发酵液浓缩,使含水量为70%,70℃水浴2h,加入中性蛋白酶1.2g破碎处理1h(中性蛋白酶酶活为60000U/g),将7g的脂肪酶加入到处理液中水解10h,摇速160rpm/min,温度35℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.01g,并加入乙醇,所述油相与乙醇的体积比为1∶15,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为200rpm/min,温度35℃,反应12h后获得生物柴油。
依照与实施例2相同的色谱条件,将实施例6中水解反应获得的油相和最终制备的生物柴油进行气相色谱分析,结果显示生物柴油成分主要是C16和C18长链脂肪酸乙酯,各方面均符合生物柴油标准,生物柴油转化率为86.73%。
实施例7:本发明所述方法与一步转酯化法的对比
本发明所述方法:取2L小球藻发酵液浓缩,使含水量为50%,70℃水浴2h,加入纤维素酶和中性蛋白酶共1.2g(纤维素酶和中性蛋白酶质量比为4∶3,纤维素酶酶活为1000U/g,中性蛋白酶酶活为60000U/g)破碎处理1h,将3g的脂肪酶加入到处理液中水解10h,摇速160rpm/min,温度37℃。静置后油水分离,去除水相,得到油相,将脂肪酶加入到油相中,所述油相与脂肪酶的体积质量比为1ml∶0.006g,并加入乙醇,所述油相与乙醇的体积比为1∶9,每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为200rpm/min,温度37℃,反应10h后获得生物柴油。
一步转酯化法:取2L小球藻发酵液浓缩,使含水量为50%,70℃水浴2h,加入纤维素酶和中性蛋白酶共1.2g(纤维素酶和中性蛋白酶质量比为4∶3,纤维素酶酶活为1000U/g,中性蛋白酶酶活为60000U/g)破碎处理1h,将脂肪酶(与上述方法中两次加入的脂肪酶量之和相同)、乙醇(与上述方法加入的乙醇量相同)加入到处理液中,乙醇每2h加一次,分3次加完,每次加入量为总体积的1/3,摇速为200rpm/min,温度37℃,反应10h后获得生物柴油。
按照上述两种方法,每个方法重复五次,取平均转化率。本发明所述方法的生物柴油平均转化率为88.5%,一步转酯化法的生物柴油平均转化率为72.9%,结果表明本发明能够避一步转酯化法中的可逆反应,提高生物柴油的转化率。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种利用产油微生物制备生物柴油的方法,其特征在于,包括:
步骤1、向含有已破壁的产油微生物菌体的发酵液中加入脂肪酶进行水解反应,然后去除水相,得到油相;
所述发酵液为含30-70%水分的发酵液,所述水分与步骤1所述脂肪酶的体积质量比为1ml:0.001-0.005g;
步骤2、向油相中加入脂肪酶和短链醇进行酯化反应得到生物柴油,所述短链醇分3次加入到油相中,频率为每2h加一次,每次加入量为总体积的1/3,所述油相与短链醇的体积比为1:5-15,所述油相与步骤2所述脂肪酶的体积质量比为1ml:0.002-0.01g,所述短链醇为甲醇或乙醇。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述发酵液为含50%水分的发酵液。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述水分与步骤1所述脂肪酶的体积质量比为1ml:0.003g。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述油相与短链醇的体积比为1:9。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述产油微生物为小球藻、栅藻、螺旋藻或粘红酵母。
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邓利等.脂肪酶催化合成生物柴油的研究.《生物工程学报》.2003,第19卷(第1期),97-101. |
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Publication number | Publication date |
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CN102199635A (zh) | 2011-09-28 |
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