CN102181395A - 基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法 - Google Patents

基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法 Download PDF

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张锡林
张建炜
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Abstract

本发明涉及寄生虫学研究领域，特别设计疟原虫子孢子的分离技术，具体为将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆,对匀浆液离心，收集上清液，获得含子孢子匀浆液，并用细胞计数器进行疟原虫子孢子计数；将所得子孢子匀浆液与缓冲液以体积比1:1-3的比例混合，获得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7mL/min，收集洗脱液，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子；建立一种纯化分离雌性按蚊体内疟原虫子孢子的技术；该技术的子孢子分离率达70～80%；并保持疟原虫子孢子感染活力和抗原性，可用于疟原虫的实验性研究。

Description

基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法
技术领域
本发明涉及寄生虫领域，特别涉及疟原虫子孢子的分离技术。
背景技术
疟原虫（plasmodium）寄生于人及多种哺乳动物，目前已知有130余种。人体疟原虫的生活史，需要人和雌性按蚊做宿主，疟原虫在人体内先后经在肝细胞和红细胞内发育。在肝细胞内为裂体增殖，称红细胞外期（红外期）；在红细胞内发育包括红细胞内裂体增殖期（红内期）和配子体形成的有性期开始。
蚊唾液腺内含有疟原虫子孢子的雌性按蚊刺吸人血时，感染性子孢子随蚊的唾液进入人体，经血液循环约30分钟孢子侵入肝细胞导致疟疾感染。虫体经红外期、红内期发育致疟疾发病。子孢子入侵肝细胞是由于子孢子表面有一种蛋白（环子孢子蛋白，CSP）能与肝细胞表面的疟原虫受体相结合，使两者接触。然后，子孢子释放由棒状体内贮存的分泌物，作用于接触的肝细胞膜，而主动侵入肝细胞。一个蚊唾液腺内可含有1000～10000个子孢子。疟原虫子孢子呈梭形，长约10～15μm，宽约1μm。在疟疾的实验研究中，,有时需大量有感染力的子孢子，但感染按蚊分离和纯化子孢子较困难。现有技术中已公开了一种锥形试管低速离心分离蚊虫体内子孢子的快速、简单方法，具体为：取一支0.5mL的锥形管，用热的20号皮下注射针在其底部穿一小孔，塞以小块的玻璃棉，放入另1支1.5ml的锥形试管中。将去头蚊体放入锥形试管中，离心2-3分钟，从蚊体组织和碎片中滤出的子孢子集中在锥形试管中形成一个球状物。该方法分离按蚊数量有限（约30－50蚊/管）；分离效率低（约20－30％）；含大量蚊的碎片，影响其后的实验结果等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种疟原虫子孢子的分离方法，该方法将专用层析柱分离法和梯度离心法相结合，其分离效果好，适用于大规模分离、纯化疟原虫子孢子。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
1、基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，具体包括以下步骤：
A、预处理
将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆液离心，收集上清液，并对疟原虫子孢子计数，得子孢子匀浆液;
B、纤维素柱（Diethylaminoethyl cellulose， DE 52）分离疟原虫子孢子
将步骤A所得子孢子匀浆液与缓冲液以体积比1:1－3的比例混合，得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7mL/分钟，收集洗脱液，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子。
2、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤B所述纤维素柱包括底部开孔4的中空柱体1，柱体内从下至上依次填充有玻璃纤维层2和DE 52纤维素层3。
3、根据2所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，所述纤维素柱的DE 52纤维素层包括缓冲液和经过缓冲液充分浸泡的DE 52纤维素。
4、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤A预处理具体为：将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆液经离心机中100rpm/3-4g离心30 秒，700-800rpm/25g离心5分钟，在2000-2500rpm/700g离心20分钟后，再以1:1-3置于199或DMEM培养基中,内含有体积浓度为35%牛白蛋白液，用细胞计数器对疟原虫子孢子进行计数，使疟原虫子孢子浓度为1×105个/ml，即为获得的子孢子匀浆液。
5、根据1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，步骤B预处理具体为：将步骤A所得子孢子匀浆液置于冰上，孵育至少30分钟，然后置于室温，与缓冲液以体积比1:1的比例混合，得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7mL/分钟，收集洗脱液5，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子。
本发明的有益效果在于：建立一种纯化分离雌性按蚊体内疟原虫子孢子的技术;该技术的子孢子分离率达70～80%;并保持疟原虫子孢子感染活力和抗原性，可用于实验性研究。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为纤维素柱的结构示意图；
图2纯化的约氏疟原虫的唾液腺子孢子染色图，吉氏染色 100×；
图3相差显微镜观察纯化的约氏疟原虫的唾液腺子孢子，60×。
.具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1 蚊胸部疟原虫子孢子纯化、分离方法
一、收获约氏疟原虫子孢子
1）斯氏按蚊 (Anopheles stephensi Hor株)在羽化后3～5d的雌性成蚊，叮吸感染约氏疟原虫的小鼠血；
2）约氏疟原虫感染小鼠要求：经子孢子感染后，红内期转种四代内（y0－y4），红内期配子体密度为2-3/每个视野内（40×）；或虫体密度为15-20% ；
3）吸血感染后置于24℃, 相对湿度70%～80%的恒温室内继续饲养。在7d-8d时，检查蚊胃的卵囊；在14d－16d时，检查蚊的唾液腺。计算该批蚊的疟原虫感染率达60～70％、感染度为蚊胃的卵囊数达20～30个左右；
4）在感染后14～15d时，取腺感染60～70％以上的雌性斯氏按蚊：将120～150只感染约氏疟原虫的斯氏按蚊全蚊；或剪去蚊头、腹部以及足和翅，仅留按蚊的胸部，将120～150左右蚊胸部，加3～4mL的199培养基或DMEM培养基，在玻璃匀浆器内匀浆。以上操作应在冰上进行。匀浆液经100rpm/3g（100rpm/3-4g均可实现）， 离心30秒，沉淀蚊的大颗粒脆片，然后上清液经700rpm/25g（700-800rpm/25g均可实现）离心5min，沉淀蚊组织，细胞计数器初步检测上清液中子孢子的数量为1－5×105个/mL；再经2000rpm/700g（2000-2500rpm/700g均可实现）离心20min，离心后以1:1－3，置于199或DMEM培养基内含35%牛白蛋白(Bovine albumin)中，供实验用。
二、DEAE纤维素柱纯化、分离疟原虫子孢子
所述纤维素柱包括底部开孔的中空柱体，柱体内从下至上依次填充有玻璃纤维层和DE 52纤维素层。进一步，所述纤维素柱的DE 52纤维素层包括缓冲液和经过缓冲液充分浸泡的DE 52纤维素，详见图1。所述纤维素柱长度和直径：柱长为80mm，管长为95mm；直径为16mm。
（一）DEAE纤维素的预制备：DE 52预溶胀，贮存于10×buffer（内含葡萄糖或NaCl）, 4℃。
纤维素柱：小片状的玻璃毛置于10ml注射器的底部。将DE 52纤维素注入（注入30mm，沉淀后为20mm），静置。
（二）试剂的制备
1. 1×buffer：HCl调pH至8.2。不同体积Buffer的配方如下表：
Figure 161001DEST_PATH_IMAGE001
2. Buffer(每升):  pH：8.2+/-0.05，离子强度：0.121；
8.8g Tris(羟甲基)氨基甲烷；
5g NaH2PO4.H2O；
5g NaCl；
18g 葡萄糖。
（三）纤维素柱的制备和子孢子分离过程：
1. 纤维素柱的制备
⑴在预先溶胀的微粒DEAE纤维素(DE 52)和buffer平衡后，用10mL塑料注射器（内径16mm，长95mm）来准备柱子；
⑵将一个16mm圆型的完好尼龙网剪好和一个钻孔软木一起装在注射器的末端，并将平衡好的DE 52移液入柱形成25mm柱；
⑶进一步用至少100mL buffer冲洗（5-7 mL/min），buffer装在一个不超过60cm高的贮存器中，DE 52总高度不超过20mm。在子孢子准备过柱之前，buffer刚刚流至与柱高平齐。
注意事项：
⑴Buffer在每次实验都需要新鲜准备，因为它的缓冲效力在贮存于4℃后几天就将降解了．而装好平衡后DE52的柱子则可事先准备好并贮存在-30℃中，纤维素柱使用一次后便丢弃；
⑵每个柱子用少于150－200个感染蚊胸部，在6mL medium 199中用全玻璃的匀浆器匀浆．这一步骤和以下各步都需在低温中进行；
2. 经纤维素柱分离子孢子
⑴蚊胸部的匀浆液经离心机中离心100rpm/3g(100rpm/3-4g均可实现) 30秒离心,再700rpm/25g（700-800rpm/25g均可实现）离心5分钟。用血细胞计数仪来检测悬液中子孢子的浓度为1－5×105个/mL。在2000rpm（2000-2500rpm/700g均可实现），20分钟离心后，再以1:1置于199或DMEM培养基︰35%BSA或牛白蛋白(Bovine albumin)中，总体积<600μL，其对子孢子在蛋白中的预培养极大增加了子孢子的产量）；
⑵将此液置于冰上。孵育30min。然后置于室温，以1:1与buffer混合；
⑶以重力作用过纤维素柱，在室温条件下，子孢子过柱，分馏物收集于冰上，加600μL buffer，重复一次。收集洗脱液的前30mL（流速为5－7ml/秒）．再经2000rpm/700g（2000-2500rpm/700g均可实现）离心20分钟后悬浮于199或DMEM培养基中。产量：洗脱液／柱中子孢子数量。子孢子量达4×105-2×106。
实施例2 蚊唾液腺疟原虫子孢子纯化、分离方法
一、收获疟原虫子孢子
1.斯氏按蚊 (Anopheles stephensiHor株)在羽化后3～5d的雌性成蚊，叮吸感染约氏疟原虫的小鼠血；
2.约氏疟原虫感染小鼠要求：经子孢子感染后，红内期转种四代内（y0－y4），红内期配子体密度为2-3/每个视野内（40×）；或虫体密度为15-20% ；
3.吸血感染后置于24℃, 相对湿度70%～80%的恒温室内继续饲养。在7d-8d时，检查蚊胃的卵囊，计算该批蚊的疟原虫感染率达60～70％、感染度为蚊胃的卵囊数达20～30个左右；
4.在感染后14～15d时，取腺感染70％以上的雌性斯氏按蚊：
a.一部分蚊解剖出蚊胃，供蚊胃壁成熟卵囊的检测和进一步实验用；
b.一部分蚊可解剖出唾液腺分离子孢子，将蚊唾液腺置于少量无血清199或MDEM培养液中，常规研磨，500 rpm离心3分钟，2次。去除大块蚊组织碎片，收集上清液中子孢子，进行计数，用于实验感染的子孢子浓度约为1-5×105/mL。
二、DEAE纤维素柱纯化、分离疟原虫子孢子
纯化、分离步骤详见实施例1。
1.疟原虫子孢子分离和纯化效果：根据10次实验结果统计，子孢子分离率达70～80%之间，在显微镜下观察可见：在DEAE纤维素柱分离前子孢子悬液中含大量的蚊组织碎片和脂肪颗粒，子孢子密度低。经DEAE纤维素柱分离后子孢子悬液纯净度明显提高，基本不含有蚊组织碎片和脂肪颗粒，子孢子密度增加2－4倍，详见图2和图3。计算洗脱液／柱中子孢子数量，子孢子数量可达4×105-2×106；
2.经DEAE纤维素柱分离前、后疟原虫子孢子活力的比较：以昆明株小鼠实验为例，每鼠接种5000以上子孢子时，无论DEAE纤维素柱分离前、后子孢子均可使100％小鼠出现原虫学症；而每鼠接种1000个子孢子时，根据5次实验结果，DEAE纤维素柱分离前子孢子平均感染率为50％，纤维素柱分离后子孢子平均感染率为70.65％，但二者间差异无显著性意义。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (5)

1.基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
A、预处理
将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆，对匀浆液离心，去除蚊组织碎片，收集上清液，获得含子孢子匀浆液，并用细胞计数器进行疟原虫子孢子计数;
B、纤维素柱纯化分离疟原虫子孢子
将步骤A所得子孢子匀浆液与缓冲液以体积比1:1-3的比例混合，获得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱，流速为5-7 mL/min，收集洗脱液，所述洗脱液中含有疟原虫子孢子。
2.根据权利要求1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，其特征在于：步骤B所述纤维素柱包括底部开孔（4）的中空柱体（1），柱体内从下至上依次填充有玻璃纤维层（2）和DE 52纤维素层（3）。
3.根据权利要求2所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，其特征在于：所述纤维素柱的DE 52纤维素层包括缓冲液和经过缓冲液充分浸泡的DE 52纤维素。
4.根据权利要求1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，其特征在于，步骤A预处理具体为：将含有疟原虫子孢子的按蚊匀浆液经离心机离心,100rpm/3-4g离心30 秒，700-800rpm/25g离心5分钟，在2000-2500rpm/700g离心20分钟后，再以1:1-3置于199或DMEM培养基中,内含有体积浓度为35%牛白蛋白液，用细胞计数器对疟原虫子孢子进行计数，使疟原虫子孢子浓度为1×105个/ml，即为获得的子孢子匀浆液。
5.根据权利要求1所述的基于纤维素柱的疟原虫子孢子分离方法，其特征在于，将步骤A所得子孢子匀浆液置于冰上，孵育至少30分钟，然后置于室温，与缓冲液以体积比1:1－3的比例混合，获得子孢子匀浆稀释液，将所述子孢子匀浆稀释液在重力作用下过纤维素柱进行纯化分离，在柱长80mm和直径16mm的纤维素柱, 流速为5-7ml/分钟，收集前段的洗脱液约30ml，所述洗脱液中含有纯化分离的疟原虫子孢子。
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