CN102170790B - 制备蛋白质微粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在稀有机酸溶液中且在无醇(如乙醇)的情况下制备蛋白质微粒的方法。通过搅拌作用使谷物的谷醇溶蛋白溶于浓有机酸溶液中并随后用水溶液稀释该溶液而形成微粒。由此形成具有空泡的蛋白质微粒。该蛋白质微粒可用于形成粉末、膜、涂层、基质、支架等。可由本发明的蛋白质微粒形成完整的膜。

Description

制备蛋白质微粒的方法
技术领域
本发明提供制备蛋白质微粒的方法，该蛋白质微粒可用于微囊包封(micro-encapsulation)、基质或支架结构或者形成膜或涂层。
背景技术
为了各种应用如食品涂层、施药和杀虫剂的缓释、肥料和环境清洁剂而由蛋白质制备微球或微粒的许多方法是公知的。然而，通常使用非酸性有机溶剂如乙醇或丙酮以溶解该蛋白质。这些溶剂通常与食品不相容且难以从食品中去除，因此食品和制药工业已不愿使用蛋白质膜或微粒体系。此外，使用非酸性有机溶剂导致蒸汽的散发、其引发的火灾及其可在食品或药物中留下可能的残渣的安全问题。许多方法还要求使用高温。
美国专利No.5,736,178教导了可由谷蛋白衍生的蛋白质的稀酸水溶液通过使该蛋白质作为微粒沉淀而制备形成膜的胶体分散体。然而，该蛋白质不得不首先溶解于醇如乙醇中，这导致以上所列的缺点。
因此申请人已确定需要在无非酸性有机溶剂(如乙醇)的情况下制备蛋白质微粒的方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供制备蛋白质微粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过搅拌作用且在无醇情况下使谷物的谷醇溶蛋白溶于有机酸中；和
(b)用水溶液稀释包含蛋白质的溶液，从而形成具有空泡的蛋白质微粒。
蛋白质可为任意谷物的谷醇溶蛋白，如小麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。
有机酸可为丙酸、乳酸或乙酸，或者任意其它适合的酸。
可向步骤(a)或者(b)的任一步骤中加入添加剂，例如增塑剂、着色剂、调味剂、防腐剂、微量矿物质、营养素、酶、激素、保健品(nutraceutical)益生菌、益生素(prebiotic)、药物或其任意结合。
在步骤(a)中，蛋白质溶液优选地为饱和的或高浓度的。
在步骤(a)中，通过搅拌作用进行溶解，以确保所形成的蛋白质微粒具有空泡。可通过搅拌、摇晃、均化、穿过溶液起泡气体等提供搅拌作用。
在步骤(b)中，优选地将包含蛋白质的溶液用水稀释至2重量份的蛋白质比2至30重量份的有机酸比96至68重量份的水的最终浓度，从而形成蛋白质微粒。
该方法可在约20℃至40℃的温度下进行，更特别地，在室温下进行。
可在溶解前或溶解后改性(物理、化学或者酶法)蛋白质，以提高或改变微粒或产品(例如由其形成的膜)的功能性质。例如，可将该蛋白质用鞣酸或酶交联和/或加热。
如此制备的蛋白质微粒可用于制备膜、涂层或基质，如下所述。
根据本发明的第二方面，提供由如上所述制成的蛋白质微粒制备完整的膜或涂层的方法，包括以下步骤：
(i)制备蛋白质微粒在有机酸的水溶液中的悬浮液，达到2重量份的蛋白质比2至60重量份的有机酸比96至38重量份的水的最终浓度；和
(ii)干燥该悬浮液以形成膜或涂层。
该膜或涂层可为清洁的或混浊的，透明的或半透明的。
根据本发明的第三方面，提供由蛋白质微粒制备基质的方法，包括以下步骤：
(i)制备蛋白质微粒在有机酸的水溶液中的悬浮液，达到2重量份的蛋白质比2至60重量份的有机酸比96至38重量份的水的最终浓度；
(ii)洗去有机酸；和
(iii)干燥悬浮液以形成基质。
形成本发明的第二和第三方面的方法优选地在无任意非酸性有机溶剂(特别是醇如乙醇)的情况下进行。
有机酸可为丙酸或乙酸以制备膜或涂层，或为丙酸、乳酸或乙酸以制备基质，或者任意其它适合的酸。
悬浮液的最终浓度可为2重量份的蛋白质比10至60重量份的有机酸比88至38重量份的水。
当所使用的有机酸为乙酸时，最终浓度优选地为2重量份的蛋白质比20至60重量份的乙酸比78至38重量份的水，更优选地为2重量份的蛋白质比20至30重量份的乙酸比78至68重量份的水，最优选地为2重量份的蛋白质比21.6重量份的乙酸比76.4重量份的水
然而，当有机酸为乙酸且蛋白质是在已从酒糟(brewers spent grain)或由谷物制备醇的其它联产品萃取的溶液中时，则蛋白质比酸比水的比例优选地为2份蛋白质比2份乙酸比96份水。
当所使用的有机酸为丙酸或乳酸时，最终浓度优选地为2重量份的蛋白质比10至30重量份的丙酸或乳酸比88至68重量份的水，更优选地为2重量份的蛋白质比10至15重量份的丙酸或乳酸比88至83重量份的水，最优选地为2重量份的蛋白质比10.8重量份的丙酸或乳酸比87.2重量份的水。
在本发明第二和第三方面的方法中，在步骤(ii)之前，优选允许将步骤(i)中制备的悬浮液静置8至24小时。
进一步地，在步骤(ii)之前，优选地以0.2至0.6重量份的增塑剂比1重量份的蛋白质，更优选约0.4重量份的增塑剂比1重量份的蛋白质的量向悬浮液加入增塑剂。
增塑剂的例子包括单独或结合使用的甘油、聚乙二醇、聚丙二醇和乳酸、酒石酸二丁酯、单酸甘油酯(如油酸、棕榈酸或硬脂酸)、三亚乙基甘油和山梨糖醇或任意其它适合的增塑剂或其结合。
优选的增塑剂是1∶1∶1(重量/重量)的甘油∶聚乙二醇(400)∶乳酸的混合物。
在步骤(ii)或(iii)之前，可加入其它添加剂如着色剂、调味剂、防腐剂、微量矿物质、营养素、酶、激素、保健品、药物、益生菌、益生素、药品及结合。
为制备膜，步骤(i)的悬浮液可直接在流延表面(casting surface)上流延。其后通过干燥去除液相，其中应用或者不应用加热，以提供完整的膜。该膜可为清洁的或混浊的，透明的或半透明的。
为在底物上制备涂层，步骤(i)的悬浮液可用于覆盖底物的表面。其后通过干燥去除液相，其中应用或不应用加热，以提供底物上的完整涂层。该涂层可为清洁的或混浊的，透明的或半透明的。
为制备结合化合物或物质的基质，已向步骤(i)的悬浮液加入该化合物或物质。其后通过干燥去除液相，其中应用或不应用加热，以提供包封或结合该化合物或物质的不透明基质。
根据本发明的第四方面，可根据本发明第一方面的方法形成蛋白质微粒，以结合或包封化合物，如营养素、维生素、酶、激素、药物、增塑剂、防腐剂、着色剂、调味剂、微量矿物质、保健品、益生菌或益生素或其结合。该化合物可以其浓酸溶液或者水溶液在微粒形成之前加入。
可选地，可将包含蛋白质微粒的溶液或分散体干燥以形成粉末。
在此情况下，根据本发明的第五方面，提供由经干燥的蛋白质微粒在底物上制备涂层的方法，包括以下步骤：
(i)将经干燥的蛋白质微粒与待涂覆的干燥底物混合；
(ii)向步骤(i)的混合物加入一定量的浓有机酸，以使蛋白质微粒涂覆底物；和
(iii)去除有机酸以使蛋白质微粒熔融(fuse)于底物以形成涂层。
有机酸可通过蒸发去除，任选地借助于加热。
根据本发明的第六方面，提供将化合物结合入由蛋白质微粒形成的基质的方法，包括以下步骤：
(i)将经干燥的蛋白质微粒与待结合的化合物的溶液混合，该经干燥的蛋白质微粒基本上不溶于该溶液；和
(ii)去除溶剂，留下结合入基质的化合物。
溶剂可通过蒸发去除，优选地借助于加热。
根据本发明的第七方面，提供由上述第一方法形成的蛋白质微粒。该微粒必须具有空泡，因而具有大的内表面积，并可比使用非酸性有机溶剂(如乙醇)形成的微粒更柔软。
根据本发明的第八方面，提供通过上述第一方法制备的微粒的水溶液或分散体。
根据本发明的第九方面，提供通过上述第一方法制备的蛋白质微粒的干燥粉末。
根据本发明的第十方面，提供由通过上述第二方法制备的微粒分散体流延的膜。
根据本发明的第十一方面，提供具有通过上述第二或第五方法制备的微粒涂层的底物。
底物可选自食品、水果、蔬菜、经最低限度处理的和经处理的水果和蔬菜、种子、坚果、动物饲料产品、着色剂、调味剂、微量矿物质、营养素、酶、激素、药物保健品、益生菌、益生素、药品和其它药物产品、医学装置等或其结合。
起始蛋白质可为可市购得到的蛋白质，例如商业玉米醇溶蛋白。
可选地，可用有机酸如冰醋酸、乳酸或丙酸从所有谷物(高粱、玉米、小麦、大麦等或其混合物)或联产品(例如面粉、糠、麦糟(spentgrain)、干酒糟及其残液(distiller’s dry grain with solubles)或其它由谷物制备醇的联产品)萃取蛋白质并去除残余固体材料而提供蛋白质。蛋白质的混合物(例如在酒糟、干酒糟及其残液或其它由谷物制备醇的联产品中得到的那些)也可用于萃取，其可为例如以各种比例的高粱和玉米或大麦和玉米的混合物(但不排除其它谷物的结合)。
该蛋白质溶液可随后在本发明第一方面的方法的步骤(b)中直接使用。
附图说明
图1显示通过Parris、Cook和Hicks(2005)J Agric Food Chem 53：4788-4792中的现有技术方法制备的高粱醇溶蛋白微粒的扫描电子显微照片，其中在微粒形成之前使用乙醇水溶液(aqueous ethanol)以溶解高粱醇溶蛋白。
图2显示根据本发明的方法在不同的酸浓度下制备的高粱醇溶蛋白微粒的显微照片：a-c为分别在5.4％、21.6％和40％的乙酸下的光学显微照片；d-f为分别在5.4％、21.6％和40％的乙酸下的扫描电子显微照片；g-i为分别在5.4％、21.6％和40％的乙酸下的透射电子显微照片；j-l为分别在5.4％、21.6％和40％的乙酸下的较高放大倍数的透射电子显微照片。
图3显示根据本发明的方法制备的经冷冻干燥的高粱醇溶蛋白微粒的扫描电子显微照片。
图4显示：(a)：由21.6％乙酸流延的2％高粱醇溶蛋白微粒膜，该具有光滑表面的膜约为15微米厚、柔韧、无色、清洁且透明；和(b)：由冰醋酸流延的2％高粱醇溶蛋白膜，该具有粗糙表面的膜约为30微米厚、柔韧、几乎无色、清洁、不完全透明。
图5显示用不同的有机酸以逐渐增多的酸浓度制备的高粱醇溶蛋白微粒对膜的形成的影响，分别是a-c为乙酸(5.4％、10.8％、21.6％)，d-f为丙酸(5.4％、10.8％、21.6％)。a和b分别显示，完整、清洁的膜不能在5.4％或10.8％的乙酸下形成。该膜为不透明、碎片状的且表面粗糙。与之相比，在21.6％的乙酸下形成了完整、无色、清洁、透明并且光滑的膜(c)。d显示用5.4％的丙酸不可形成完整的膜。该具有粗糙表面的膜为不透明且碎片状的，但与分别使用5.4％和10.8％乙酸的a和b中的膜相比程度较轻。e和f显示分别在10.8％和21.6％的丙酸下形成了完整、无色、清洁、透明且光滑的膜。
图6显示由高粱啤酒渣的萃取物直接制备的微粒制成的膜和涂层。A为20％乙酸、B为10％乙酸、C为2％乙酸、D为1％乙酸；1为2％高粱醇溶蛋白，2为1％高粱醇溶蛋白，3为0.5％高粱醇溶蛋白。注意所有的膜都是完整的。
图7显示在4℃下贮藏5天的经最低限度处理的鳄梨。A：未涂覆的鳄梨，B：用根据本发明的高粱醇溶蛋白微粒涂层制剂涂覆的鳄梨。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及在稀有机酸溶液中制备蛋白质微粒分散体的方法。通过将蛋白质溶于浓有机酸溶液中并随后用水相稀释该溶液而形成该微粒。
微粒的形成取决于蛋白质在有机酸溶液中的相对溶解度。由于有机酸浓度通过加入水相而降低，蛋白质不再可溶并因此从溶液析出形成微粒。在微粒的形成之前可向溶液加入化合物以使其结合入微粒或被微粒包封。在稀有机酸中的该微粒的分散体在无微生物污染的环境贮藏条件下是稳定且均质的。可将该微粒从稀有机酸中分离，洗涤并干燥以形成粉末，或者可用于形成连续的膜或涂覆底物。
如本文中使用的，浓酸通常被视作具有80％或更高浓度的酸，而稀酸通常被视作具有小于80％浓度的酸。
本方法不使用醇如乙醇，并且所有组分可为食品相容的，使得该微粒适于被人类或动物消费。不同于形成微粒的公知方法，本方法不需要高温，并可在20℃至40℃的温度(如室温)下进行。也不需要有毒的化学品。
颗粒尺寸和定义
如本文所用，“微”指具有纳米至微米直径的颗粒。微球通常被视作球形颗粒，而微粒通常稍大且在形状上是不规则或非球形的。在本发明中，微粒可为球形或者不规则形状，但两者都将被称作微粒。因此术语“微粒”意指包括微球。
微粒的尺寸可从纳米尺度(纳米)至微米，但对于球形颗粒更特别地为1-10微米，而对于不规则形状的颗粒或者微粒聚集体可略大，其可至数毫米。然而，取决于制备方法(例如改变稀释的速率或在制备过程中应用剪切)，可控制该尺寸以制备较大或较小的颗粒。
具有一定尺寸范围的微粒的形成允许多种应用。这包括食品用途如用于食品包装的膜的形成、用于延长食品产品的保质期的可食用涂层以及包封例如食品、动物饲料产品、食品成分、酶、激素、着色剂、调味剂、微量矿物质、营养素、药物、保健品、益生菌和益生素。其它非食品用途可包括施药、其它医学用途(如组织工程、组织基质或者用于心血管的支架和涂层以及其它生物医学装置)、生物半导体以及杀虫剂和肥料的缓释。
如通过扫描电子显微镜(外表面)和透射电子显微镜(内表面)所示(图2)，通过本发明的方法制备的微粒具有粗糙多孔的表面和大量内部孔洞或空泡。因此本制备方法造成具有非常大表面积的微粒的形成。
通过本发明制备的微粒具有粗糙的具洼点(pitted)的外表面，显得柔软但可通过交联而硬化，并将形成连续的膜，而通过现有技术使用乙醇水溶液制备的微粒具有几乎光滑的外表面，显得较坚硬且不形成连续的膜。
形成微粒的蛋白质
蛋白质为谷物的谷醇溶蛋白，且更特别地(但不排他地)为高粱醇溶蛋白、谷蛋白、大麦醇溶蛋白或玉米醇溶蛋白或其混合物。通常，该蛋白质为高粱醇溶蛋白。使用蛋白质制备微粒是因为它们是天然的，具有不同的性质，其可被改性并可在体外和体内降解为氨基酸和小肽。因此它们适于人类和动物消费以及药品的给药。疏水蛋白质在水中具有有限的溶解度，但在有机溶剂、有机溶剂的水混合物、二元溶剂和具有极端pH的溶剂(如酸和碱)中是可溶的。高粱醇溶蛋白是优选的谷醇溶蛋白，因为它比其它谷醇溶蛋白如小麦醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白更疏水，并且比玉米醇溶蛋白更交联，造成更好的功能性质。
蛋白质可为蛋白质离析物，或可从联产品材料如酒糟、干酒糟及其残液或其它由谷物制备醇的联产品萃取。
用于制备微粒的酸
将蛋白质溶于适合的有机酸。如果在环境温度(20-25℃)下0.5％(重量/体积)的蛋白质溶于溶剂形成澄清溶液，该蛋白质通常被视作可溶的(Shukla，R.和Cheryan，M.(2001)Zein：The Industrial ProteinFrom Corn，Industrial Crops and Products 13：171-192)。可用于溶解蛋白质的有机酸的例子为乙酸、乳酸和丙酸。这些酸的使用为微粒赋予食品相容性的优点。另外，以该方式形成的微粒是微生物稳定的，且不需要额外的防腐剂。在本发明的方法中优选的酸为乙酸。
粉末形成
可将微粒从形成微粒的稀有机酸溶液中分离并用水溶液清洗。随后去除水溶液并将微粒干燥成粉末。分离方法可为例如过滤或离心过滤。干燥方法可包括冷冻干燥、急骤干燥、喷雾干燥、流化床干燥或任意其它适合的干燥方法。分离和干燥的方法通常将取决于所使用的蛋白质。可将该粉末贮藏并无须冷冻或其它特别的处理技术而处理。可将粉末通过足以使颗粒再悬浮的搅拌作用加入稀有机酸溶液而实现再水合(re-hydration)。用于再生的稀有机酸溶液的量取决于所需要的最终产品的浓度以及所需要的用途。
已干燥的微粒保持其结构。它们在形状上是球形或不规则的，具有粗糙的具洼点的表面，如通过扫描电子显微镜所示(图3)。
膜和涂层的形成
当蛋白质微粒用于形成自立式(free-standing)膜时，该微粒的稀有机酸悬浮液可直接在流延表面上流延。随后通过干燥去除液相，其中应用或者不应用加热。取决于用于制备微粒的蛋白质的浓度，制备了厚度可变的完整的(而不是碎片状的、破碎的或有孔的)膜(图4a)。该膜通常具有10-30微米的厚度。该膜可用作包装材料，例如用于食品、食品成分和为了兽医或人类用途的药物。该膜还可用作隔离(interleaving)材料，例如用于分离同一食品产品的一部分，例如匹萨饼，或用于同一食品产品中的不同组分之间，例如在馅饼中的水果馅和馅饼皮之间以阻止水分传递。该膜可为清洁的或浑浊的。
当底物上需要涂层时，该微粒的水分散体用于覆盖底物的表面，随后允许水相蒸发，在底物表面上形成涂层。该底物可为可食用的食品或食品成分的底物，其对氧化或失水敏感，例如水果、坚果、调味品或蔬菜(完整的或经最低限度处理的或经处理的)或者动物或鱼类饲料产品。其它适合的产品也可被涂覆，例如花、药物化合物、酶、激素、片剂组合物或其它药物、生物或医学产品、营养素、保健品、益生菌、益生素等或其结合。
关于本发明的第二和第三方法，如所述地将蛋白质微粒的分散体稀释是重要的，以制备完整的膜和涂层。这使该膜和涂层区别于通过使用乙醇或者不同的蛋白质∶溶剂∶水的比例的现有技术方法制备的那些(可为不完整的)。根据本发明制备的膜也可为清洁的或浑浊的、透明的或半透明的。
蛋白质微粒的分散体可与各种添加剂(例如增塑剂，其改进由微粒分散体制备的膜和涂层的功能性质)共调配。由蛋白质微粒制备的膜是完整的并可比其它膜制备得更薄，如10微米至30微米，且优选地约15微米。该膜还可具有一些比用蛋白质的乙醇溶液制备的膜更好的功能性质，例如水阻挡性能及其为清洁的、透明的或半透明的(其它流延膜通常为碎片状且不透明)。
在基质内包封
当待形成的蛋白质微粒用于包封化合物时，在该微粒形成之前，该化合物可结合入水溶液、有机酸或蛋白质溶液或其结合中。当通过搅拌作用混合所得溶液时，形成包含待包封的化合物的微粒。
实现将化合物包封至微粒中的另一方式是通过将预先干燥的本发明的微粒在该微粒不溶的溶液或悬浮液中与物质混合。当该溶剂蒸发时，该化合物保持包封在该微粒中。
微粒改性
微粒的性质可为特定应用而改性，例如在形成微粒之前或在形成微粒的过程中，或在形成微粒、基质之后，或在由微粒形成膜或涂层之后或在形成膜或涂层的过程中，通过使用化学、酶法或物理方法以改变初始蛋白质。此改性可制备具有改进性质的微粒、基质、支架、膜或涂层，如改变的热稳定性、剪切稳定性或耐蛋白酶性。通过此改性制备的膜或涂层还将具有改进的功能性质，包括改变的拉伸和阻挡性能，改进的耐蛋白酶性和延迟的生物降解。蛋白质改性的特别的例子为用鞣酸交联、使用反式谷氨酰胺酶以及加热。
本发明通过以下实施例进一步描述。然而，这些实施例将不视作以任何方式限制本发明的实质或者范围。
实施例
实施例1：形成高粱醇溶蛋白微粒
通过混合以下各项制备根据本发明的一个具体实施方案的组合物(所有百分比按重量基准给出)：增塑剂(10％)、冰醋酸(66％)和高粱醇溶蛋白(24％)，并将高粱醇溶蛋白溶于酸中。随后加入蒸馏水并搅拌，形成微粒。蛋白质的浓度为2％，增塑剂相对于蛋白质含量为40％，而酸浓度为5.4％。
通过在125毫升锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中称重高粱醇溶蛋白(1.8克-88.63％蛋白质)而制备微粒。在加入高粱醇溶蛋白之前，通过温和的搅拌使增塑剂(0.66克1∶1∶1的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相对于蛋白质为40％)与冰醋酸(4.34克)混合。将温度缓慢升高至30℃以确保完全溶解。随后将该蛋白质溶液在室温下静置一夜(16小时)以松弛蛋白质。在此期限之后，在5分钟的期限内缓慢加入蒸馏水并搅拌至总重量为80克。微粒在加入水时形成，呈稳定、白色的胶体悬浮液。该颗粒尺寸为1至10微米，其中大多数微粒经测量为3-4微米。在8℃下贮藏6个月的期限后，颗粒尺寸无显著增加。在此期间，不加入任何抗微生物剂而无微生物生长。当用扫描电子显微镜观察时，微粒呈具有大量洼点表面的球体(图2)。用透射电子显微镜确定的内部结构显示不同尺寸的具有光滑壁的内部空泡。这些结果显示，根据本发明的方法制备的微粒具有非常大的内表面积。
实施例2：使用乙酸、乳酸或者丙酸形成玉米醇溶蛋白微粒
通过混合以下各项制备组合物(所有百分比以重量基准给出)：增塑剂(9.5％)、冰醋酸(62％)(或乳酸或丙酸)和商业玉米醇溶蛋白(ZPP Gold，Zein Protein Products，Marina，CA)(29.6％)，并将玉米醇溶蛋白溶于酸中。随后加入蒸馏水并搅拌，形成微粒。蛋白质的浓度为10％，增塑剂相对于蛋白质含量为40％，酸浓度为21.6％。为了进一步使蛋白质含量降低至2％，加入21.6％的乙酸。
通过在125毫升锥形烧瓶中称重玉米醇溶蛋白(4克-100％蛋白质)而制备微粒。在加入玉米醇溶蛋白之前，通过温和搅拌使增塑剂(1.32克1∶1∶1的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相对于蛋白质为40％)与冰醋酸(8.64克)混合。将温度缓慢升高至30℃以确保完全溶解。随后将该蛋白质溶液在室温下静置一夜(16小时)以松弛蛋白质。在此期限之后，在5分钟的期限内缓慢加入蒸馏水并搅拌至总重量为40克、玉米醇溶蛋白为10％、乙酸为21.6％。微粒在加入水时形成，呈稳定、白色的胶体悬浮液。为了进一步降低蛋白质浓度，使用21.6％乙酸以稀释。
实施例3：形成用高粱醇溶蛋白微粒制备并通过加热交联的涂层，以便在复胃动物的瘤胃中的条件下保护被涂覆的材料，例如甲硫氨酸(一种限定的氨基酸)
将本发明的微粒用于制备干燥的粉末。如本节中前述地制备此粉末，将“粉末形成物(powder formation)”与干底物混合，在本例中，氨基酸、甲硫氨酸以1∶1的比例。为了使微粒在底物(如甲硫氨酸)周围相互熔融并形成连续涂层的目的，随后将该粉末混合物与冰醋酸(1∶2)混合以形成糊。随后将该糊直接在平坦表面上干燥或者首先经过不曝露于加热或超压下的简单挤出过程。随后将该被涂覆的材料在强制通风炉中在60-70℃下加热处理一夜。被微粒涂覆的甲硫氨酸制剂随后经溶解和模拟胃蛋白酶消化检定以确定甲硫氨酸释放特征。
溶解试验的诱导(incubation)条件以39℃下约5.5的pH模拟牛的瘤胃中的条件。被高粱醇溶蛋白微粒涂覆的甲硫氨酸无脉冲释放。与未涂覆的甲硫氨酸在这些条件下在1小时以内完全溶解相比，约80％的甲硫氨酸而是在8小时后从被冰醋酸熔融的微粒涂层释放。甲硫氨酸显得是通过穿过该高粱醇溶蛋白微粒涂层中的孔的扩散而释放的。
因此，通过用微粒涂层涂覆甲硫氨酸或任意其它适合的化合物，实现了该化合物的缓释。这允许该化合物避开瘤胃而按要求地在该动物的肠内吸收。
实施例4：形成用高粱醇溶蛋白微粒制备的自立式膜
在另一具体实施方案中，将本发明的微粒用于制备自立式膜。将如以上实施例1中所述制备的微粒悬浮液(每张膜4克-2％蛋白质、5.4％乙酸)在塑料离心管中称重。该悬浮液在4000克下离心5分钟。滗析出上层清液，并用相等重量的21.6％乙酸替换。随后将该蛋白质悬浮液在室温下静置一夜。将增塑剂(每张膜32毫克，1∶1∶1混合的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相对于蛋白质为40％)加入蛋白质悬浮液。随后将该悬浮液在清洁、干燥的平坦塑料容器中流延。将该容器置于50℃下的炉(非强制通风)中的水平表面上，并干燥4小时。轻轻地从流延容器剥下膜。随后确定该自立式膜的拉伸和防水性能。
与使用常规的膜流延技术用相同百分比的高粱醇溶蛋白制成的膜相比，由通过本文描述的方法制备的高粱醇溶蛋白微粒制成的自立式膜具有显著更低的水蒸气渗透性。高粱醇溶蛋白微粒膜的拉伸性能与使用常规膜流延技术流延的那些相似。
与使用常规膜流延技术流延的相同蛋白质浓度的高粱醇溶蛋白膜(30微米)(图4b)相比，高粱醇溶蛋白微粒膜薄得多(约15微米)(图4a)。应注意到，可改变自立式微粒膜的厚度以得到不同的性质。类似地，可改变膜的精确组成，以赋予所得的膜以不同的性质。
另外，该膜是清洁、无色且透明的。
实施例5：形成用高粱醇溶蛋白微粒、酸-丙酸制备的自立式膜
将本发明的微粒用于使用可选的有机酸(如丙酸)制备自立式膜。将如以上实施例1中所述制备的微粒悬浮液(每张膜4克-2％蛋白质、5.4％丙酸)在塑料离心管中称重。该悬浮液在4000克下离心5分钟。滗析出上层清液，并同等重的10.8％丙酸替换。随后将该蛋白质悬浮液在室温下静置一夜。将增塑剂(每张膜32毫克，1∶1∶1混合的乳酸、聚乙二醇(400)、甘油-相对于蛋白质为40％)加入蛋白质悬浮液。随后将该悬浮液在清洁、干燥的平坦塑料容器中流延。将该容器置于50℃下的炉(非强制通风)中的水平表面上，并干燥4小时。轻轻地从流延容器剥下膜(图5e)。随后确定该自立式膜的拉伸、防水性能和蛋白质的可消化性(表1)。
由丙酸流延的高粱醇溶蛋白微粒膜在厚度(约15微米)(图5e)和外观(清洁、无色且透明)上与由乙酸流延的高粱醇溶蛋白微粒膜(图5c)相似，且与使用常规膜流延技术流延的相同蛋白质浓度的高粱醇溶蛋白膜(30微米)(图4b)相比更薄。
表1：自立式高粱醇溶蛋白膜的功能性质
Figure BPA00001346364200131
*括号内的数字指标准偏差
实施例6：在高粱醇溶蛋白微粒中包封用于单胃动物(包括人类)的饮食(dietary)抗氧化剂
将本发明的微粒用于制备干燥粉末。如本节中前述地制备该粉末，将“粉末形成物”与化合物在溶液中混合，在本例中，多酚抗氧化剂儿茶素或高粱浓缩鞣酸溶于70％的丙酮(一种该微粒不溶的溶剂)中。当该溶剂蒸发时，该化合物保持包封在该微粒中。包封水平为相对于蛋白质的20％的多酚。所用的实施例不排除其它物质或用于那些物质的其它溶剂的使用。该被微粒包封的抗氧化剂随后经溶解和模拟消化以确定被包封的抗氧化剂的释放曲线。诱导条件模拟人类消化系统的那些条件，即在37℃下在pH 2.0下用胃蛋白酶2小时，继以在相同温度下在pH 7.6下用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶另外的2小时诱导。
在初始的小脉冲释放后，在此后的4小时期限内，被高粱醇溶蛋白微粒包封的儿茶素和浓缩鞣酸实质上未显示蛋白质的消化，而是分别释放了其总抗氧化活性的约70％和50％。这证明多酚抗氧化剂在高粱醇溶蛋白微粒中的包封将允许被包封化合物在人类的胃和胃肠道中的受控释放。应注意，可改变活性化合物的负载以得到不同的剂量水平。类似地，具有被包封化合物的高粱醇溶蛋白微粒可经进一步处理(例如通过加热)以修改被包封化合物的释放曲线。
实施例7：从高粱酒糟(联产品)萃取高粱醇溶蛋白并直接制备高粱醇溶蛋白微粒
将高粱酒糟(水分含量75％)以1∶5的固体比溶剂比例在0.5％的偏亚硫酸氢钠水溶液中预浸16小时。去除偏亚硫酸氢钠，并以1∶5的固体比溶剂比例用冰醋酸在环境温度下萃取该酒糟48小时。随后将萃取物(蛋白质溶液)从固体材料分离。用另外的等量冰醋酸洗涤固体材料，并将两份萃取物结合。随后通过向冰醋酸萃取物(蛋白质溶液)缓慢地加入水并持续搅拌而制备微粒。萃取物(蛋白质溶液)比加入的水的比例为1∶3(取决于酒糟的原蛋白质含量，蛋白质比酸比水的比例约为2份蛋白质、25份乙酸和73份水)。随后将所得的微粒从液体分离，并在干燥前用水洗涤以去除任意残余的酸。通过此方法制备的经干燥的微粒具有95％的高粱醇溶蛋白纯度，并可随后用于本文件中所述的任意应用。
实施例8：由高粱酒糟的萃取物直接制备高粱醇溶蛋白微粒膜或涂层
将如实施例7所述的由高粱酒糟制备的微粒用于制备自立式膜或涂层。微粒的悬浮液可直接取得并干燥成膜或涂层，而不是将微粒洗涤并干燥。另外，如果需要，可如实施例4所述地控制酸或蛋白质浓度以制备不同厚度并具有不同功能性质的膜或涂层(图6)。以此方式制备的膜略厚于由经离析的高粱醇溶蛋白制备的那些，在使用2％的高粱醇溶蛋白时约为25微米，而在使用1％的高粱醇溶蛋白时为15微米。较低的蛋白质浓度造成涂层不可从流延表面分离。
由此制备的膜和其它联产品通常为略微混浊的但仍为完整的。此混浊很可能是由于与高粱醇溶蛋白共萃取的杂质。若由纯的高粱醇溶蛋白制备微粒并随后使用这些微粒制备膜，我们得到清洁、透明的完整膜。
实施例9：使用高粱醇溶蛋白微粒涂层制剂以延长经最低限度处理的鳄梨的保质期
将如实施例7所述的由高粱酒糟制备的微粒用于制备涂层制剂，该制剂用于食用成熟(eat-ripe)的鳄梨的切半部分(cut halves)以延长该水果的保质期。1级出口鳄梨(Persea americana Mill)品种“Hass”被用于实验。在开始实验之前，将鳄梨在4℃下贮藏5天。随后将鳄梨在22℃下熟化直至食用成熟。在涂覆制剂溶液中浸渍之前，将其手工削皮并等分。该涂覆制剂溶液由2％(体积/体积)乙酸中的2％高粱醇溶蛋白与1∶1∶1的丙二醇、乳酸和甘油的增塑剂(相对于蛋白质为40重量/重量％)组成。将未涂覆的鳄梨半部分用作对照。在涂层已干燥后，该水果的各半部分在用塑料盖封闭的塑料盆中包装，并在4℃下贮藏5天。在5天的期限之后，被微粒涂覆的鳄梨未显示变棕色的迹象，而对照鳄梨显示大面积地变棕色(图7)。
虽然本发明已就其特定具体实施方案作了详细描述，本领域技术人员应注意，可对本发明作各种改变、修改及其它变化而不脱离其实质和范围。

Claims (25)

1.一种制备蛋白质微粒的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过搅拌作用且在无醇情况下使谷物的谷醇溶蛋白溶于有机酸中；和
(b)用水溶液稀释包含该蛋白质的溶液，从而形成具有空泡的蛋白质微粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述谷物的谷醇溶蛋白选自谷蛋白、大麦醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白或高粱醇溶蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机酸选自丙酸、乳酸或乙酸。
4.根据权利要求1所述的方法，该方法在无乙醇的情况下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述蛋白质溶液为饱和的或高度浓缩的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中通过搅拌、摇晃、均化或穿过所述溶液起泡气体而提供所述搅拌作用。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前或之后，将所述蛋白质用鞣酸或酶交联和/或加热处理。
8.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括从所述经稀释的溶液去除有机酸的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括干燥步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括由所述经稀释的溶液形成粉末、膜、涂层、基质或支架的步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中允许将步骤(a)中的所述溶液静置8至24小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，将包含所述蛋白质的所述溶液用水稀释至2重量份的所述蛋白质比2至30重量份的所述有机酸比96至68重量份的水的最终浓度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中将选自增塑剂、着色剂、调味剂、防腐剂、微量矿物质、营养素、酶、激素、保健品、益生菌、益生素或药物或其任意结合的所述添加剂加入步骤(a)或(b)的溶液，并使该添加剂结合入蛋白质微粒或被蛋白质微粒包封。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述添加剂为选自甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、乳酸、酒石酸二丁酯、单酸甘油酯、棕榈酸、硬脂酸、三亚乙基甘油或山梨糖醇或其结合的增塑剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述增塑剂的存在量相对于1重量份的蛋白质为0.2至0.6重量份。
16.一种根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的蛋白质微粒。
17.根据权利要求16所述的蛋白质微粒，该蛋白质微粒具有空泡。
18.一种包含根据权利要求17所述的蛋白质微粒的粉末。
19.一种包含根据权利要求17所述的蛋白质微粒的水悬浮液。
20.一种由根据权利要求17所述的蛋白质微粒形成的膜。
21.根据权利要求20所述的膜，该膜是完整的。
22.一种由根据权利要求17所述的蛋白质微粒形成的涂层。
23.一种由根据权利要求17所述的蛋白质微粒形成的基质。
24.一种由根据权利要求17所述的蛋白质微粒形成的支架。
25.一种包含根据权利要求22所述的涂层的底物。
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