CN102168049A - 一种生产破胶酶的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产破胶酶的菌株及其应用，生产破胶酶的Bacilluslichenformis M1-4菌株，其保藏编号为CGMCC NO.4511。M1-4菌株用于破胶酶的生产和制备菌液制剂。本发明获得的菌株产酶效率高，工业发酵条件下酶产量大于240U/ml；且本发明的所采用的回收方法酶收率较高；所生产的压裂液破胶酶在较宽的温度范围内活性高，用量小，且使用方便；具有快速均匀的降粘能力，能够将胍豆胶完全降解，残渣少，破胶后压裂液粘度低于5.0mPa.s。根据清洁压裂液破胶酶的这些特点，本发明的菌株不仅可以用于常规的压裂破胶施工作业，还能应用于压裂作业失败的补救措施。
Description
技术领域
本发明属于油田水力压裂破胶技术领域，具体涉及一种生产破胶酶的菌株及其应用。
背景技术
水力压裂是油气井增产、注水井增注的一项重要技术措施，其过程是用压裂泵组将压裂液以高压力压开地层，形成裂缝；并用支撑剂支撑裂缝，从而增加导流能力、减小流动阻力。全国压裂措施工艺每年应用达到上万井次，年增油近千万吨。水力压裂方法中压裂液的破胶能力是影响压裂施工成败的关键因素，压裂液的破胶效果直接影响压裂液的反排和增产效果，破胶失败或者不理想会造成严重的地层伤害。根据低渗透储层的特点，利用核磁共振技术及岩心流动试验进行的压裂液伤害机理研究表明：压裂液粘滞力和大分子基团滞留是造成伤害的主要因素。因而提高破胶效果，降低压裂液的粘滞阻力，是解决压裂液地层伤害的一个重要办法。
压裂作业中常用氧化破胶剂压裂液为过硫酸钾、过硫酸铵等，其优点是价格低；使用方便；破胶迅速；破胶液粘度10mPa.s以下。但在实际应用中，氧化破胶剂存在着一些缺陷，这些缺陷包括：1、反应时间及其活性主要依赖于温度；(温度低于50℃，反应很慢；必需添加激活剂；当高于93℃时又分解的很快，反应不易控制，反应迅速，使压裂液提前降解而失去输送支撑剂的能力，甚至导致压裂施工失败；2、它属于非特殊性反应物，能和遇到的任何反应物如管材、地层基质和烃类等发生反应，生成与地层不配伍的污染物，造成地层伤害；3、破胶持续时间短，氧化破胶剂很可能在到达目的裂缝前消耗殆尽，因而达不到有效破胶的目的(尤其是滤失部分)；4、氧化破胶具有随机性，造成稠化剂胍豆胶链不能完全降解，约20％的分子量大于2.0×106聚合物基本上未降解。因此，需要提供一种效果更好，容易操作的压裂液破胶剂。
破胶酶是具有高催化能力和很好的活性的生物蛋白，它在催化反应时自身的形态和结构不发生改变，因此可再催化另一个反应，从而达到更好的破胶效果。研究表明，生物破胶酶体系为多糖聚合物糖甙键特异性水解酶(LSE)，它们只分解多糖聚合物结构中特定的糖甙键，可将聚合物降解为非还原性的单糖和二糖。这些特异性破胶酶主要有beta-1，4甘露聚糖酶、beta-甘露糖苷酶和alpha-半乳糖苷酶。实验发现，常规破胶方法破胶液的分子量为1.0～3.0×105，而生物酶破胶方法获得的胶液分子量为2000～4000，其破胶性能明显高于氧化型破胶 剂。但目前破胶酶的生产菌株存在着生产效率低下的问题，急需筛选出具有高效发酵生产破胶酶的微生物菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产破胶酶的菌株及其应用，即将筛选出的Bacillus lichenformis M1-4菌株用于压裂液破胶酶的制备，从而高效的生产压裂液破胶酶，以弥补现有技术的不足。
本发明筛选的Bacillus lichenformis M1-4地衣芽孢杆菌Bacilluslichenformis菌株，已于2010年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，100101)保藏号为CGMCC NO.4511。
上述的Bacillus lichenformis M1-4菌株用于生产破胶酶，包括发酵和提取步骤。破胶酶的发酵过程中采取三级发酵，种子液培养基为液体LB培养基，M1-4菌株首先由种子培养基进行二级扩培，发酵条件为20℃～50℃下200rpm发酵12小时，获得种子液。发酵培养基组成为(g/L)：胍豆胶10，酵母膏5，K2HPO45，MgSO4 0.5、NaCl 10，pH＝7.2。将二级扩培后获得的种子液以5.0％的接种量接种于发酵培养基中，具体发酵条件为20℃～50℃下100rpm～250rpm培养3～5天。
破胶酶的提取步骤如下：发酵结束后，将发酵液离心去除菌体，再将获得的发酵上清液经层析柱洗脱：层析柱以pH 7.3的Tris-HCl缓冲液平衡后以0.5mol～1.5mol的NaCl溶液进行洗脱，洗脱速率为5～15ml/h，收集酶液并用饱和硫酸铵溶液沉淀得到破胶酶。获得的粗酶液由缓冲液稀释至200U/ml～400U/ml后低温保存。
为了减少菌体的影响，将离心后的发酵上清液用0.22μm滤膜过滤除去残余菌体和不溶物，上述的层析柱为20×250mm的琼脂糖层析柱，洗脱速率为5～15ml/h。
本发明的菌株可用来制成菌液制剂，其特征在于菌液中Bacillus lichenformisM1-4菌的浓度为107～109CFU/mL。
本发明获得的菌株产酶效率高，工业发酵条件下酶产量大于240U/ml；本发明的所采用的回收方法酶收率较高(90％以上)；所生产的压裂液破胶酶在较宽的温度范围内(20℃～65℃)活性高，用量小(50ppm～150ppm)，且使用方便；具有快速均匀的降粘能力，能够将胍豆胶完全降解，残渣少(破胶后压裂液粘度低于5.0mPa.s)。根据清洁压裂液破胶酶的这些特点，本产品不仅可以用于常规的压裂破胶施工作业，还能应用于压裂作业失败的补救措施。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明实施过程作详尽描述。
一、本发明筛选到的微生物菌株
本发明是用肥沃环境中的土样来筛选压裂液破胶酶的生产菌株，将环境土样接种于富集培养基中进行富集，富集后的培养物于琼脂平板上划线培养，挑取单菌落，并接于刚果红琼脂平板上培养，挑取降解圈较大的菌株用于压裂液破胶酶的发酵生产，菌种经鉴定后冷冻保存于甘油管中。具体步骤如下：
1.产酶菌株的筛选
将环境土样接种于富集培养基中，置于20℃～50℃摇床中，100rpm～250rpm下培养1～7天，富集后的培养物划线于LB琼脂培养基平板上挑取单菌落，20℃～50℃中静置培养1～7天，将获得的单菌落接于刚果红的琼脂培养基平板上，20℃～50℃中静置培养1～7天，选取具有明显降解圈的菌株。所获得的发酵菌株经16s rDNA序列分析和生理生化实验鉴定为Bacillus sp.，命名为Bacilluslichenformis M1-4，已于2010年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，100101)保藏号为CGMCC NO.4511。
富集培养基组成为(g/L)：胍豆胶10，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH＝7.2。酵母粉LB琼脂培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH＝7.2，配置后添加2.0％琼脂粉。刚果红琼脂培养基组成为(g/L)：胍豆胶10，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH＝7.2，配置后添加2.0％琼脂粉和0.05刚果红。
2、Bacillus lichenformis M1-4的形态特征
该菌株在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。
3、Bacillus lichenformis M1-4的理化特征
该菌株为革兰氏阳性杆菌，接触酶阳性，淀粉酶阳性，兼性厌氧生长，菌体大小0.8μm×(1.5～3.5)μm，细胞排列呈杆状，细胞内无聚-β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。
二、Bacillus lichenformis M1-4菌株用于破胶酶的发酵
实施例1：
1、微生物发酵
将筛选得到的菌株进行发酵，在发酵过程中首先进行发酵条件和培养基成分的优化，首先对发酵培养基的最佳碳源、氮源、磷源、硫源、微量元素液和 pH其次对发酵方式、周期(1～10天)、温度(20℃～50℃)和接种量(1.0％～10.0％)等因素进行优化，通过酶活力测定和破胶率情况对以上因素进行优化，最终确定压裂液破胶酶生产培养基和发酵条件，优化后的发酵所获得的破胶酶产量为240U/ml～270U/ml。
破胶酶的发酵过程中采取三级发酵，种子液培养基确定为液体LB培养基，菌株首先由种子培养基进行二级扩培，发酵条件为30℃下200rpm发酵12小时，获得种子液；然后配置的发酵培养基组成为(g/L)：胍豆胶10，酵母膏5，K2HPO45，MgSO4 0.5，NaCl 10，pH＝7.2。将二级发酵后获得的种子液以5.0％的接种量接种于发酵培养基中，具体的发酵条件为：①30℃下100rpm～250rpm培养3～5天；②20L发酵罐30℃下溶氧量(DO＝40～80)下，培养3～5天。
本发明的菌在20～50℃都能够生长，但最适合的生长温度为37℃。
2、破胶酶的提取和保存
发酵结束后，将发酵液5000rpm～10000rpm离心30min去除菌体，并用0.22μm滤除去残余菌体和不溶物质，将获得的粗酶液经琼脂糖层析柱(20×250mm)洗脱：层析柱以pH 7.3的Tris-HCl缓冲液平衡后以0.5mol～1.5mol的NaCl溶液进行洗脱，洗脱速率为5～15ml/h，收集酶液并用饱和硫酸铵溶液沉淀得到破胶酶的粗酶，与发酵液原始酶活力(＞240U/ml)比较发现，本发明所述回收方法其回收率达90％以上，将获得的粗酶由缓冲液稀释至200U/ml～400U/ml后得到破胶酶溶液，低温保存。酶活力的测定方法为(DNS法)：50℃下，将一定酶液放入0.6％浓度的胍豆胶底物中，测定单位时间内释放的还原糖的量。一个酶活力定义为(1U)：每分钟释放1.0μmol还原糖所需要的酶量。压裂液破胶酶保存用缓冲液组成为：0.1M浓度pH 7.2的磷酸缓冲液，杀菌剂50ppm，甘油50％。
三、本发明菌株发酵生产的破胶酶的应用
当压裂液返排时，由于破胶不彻底往往留下很多残渣(固体不溶物)，降低裂缝的导流能力。在室内应用物理模拟实验，制作填砂模型(20×2.5cm)模拟水力压裂形成的填砂裂缝，50℃恒温箱中，驱替人工配制的模拟地层水并计算填砂模型的渗透率；将模型饱和含有20U/L破胶酶的压裂液液，关闭驱替系统，并在恒温箱中进行破胶反应12h；反应结束后，以模拟地层水进行反向驱替，计算返排后的模型渗透率(驱替至压力恒定)，并以未添加破胶酶的实验组作为对照对照模拟地层伤害实验，并计算岩芯伤害率。
表1.返排效率和岩芯伤害实验
从表1的结果不难看出，相比空白对照，生物破胶酶的加入可以有效实现压裂液破胶降粘，由于生物酶的破胶作用彻底，实验岩芯并未观察到显著的地层伤害(伤害率仅为0.53％)，体现了生物酶破胶剂在中低温油藏压裂施工作业中的良好的应用前景。
四、Bacillus lichenformis M1-4菌株用于制成菌液制品
本发明的Bacillus lichenformis M1-4菌株可以制成菌液产品，制作方法就是将M1-4菌株接种到普通LB培养基或其他培养基中后，进行扩大培养在37℃，150rpm～200rpm对细菌进行扩大培养，至OD600的值为0.5～1.0时停止培养，制得种子液，将种子液离心浓缩后，再加入甘油，即制得含有Bacillus lichenformisM1-4菌株的菌液。菌液中Bacillus lichenformis M1-4菌的浓度为107～109CFU/mL。
制得的菌液制品可以作为种子液来生产破胶酶。
Claims (10)
1.一种生产破胶酶的Bacillus lichenformis M1-4菌株，其保藏编号为CGMCC4511。
2.权利要求1所述的M1-4菌株用于破胶酶的生产。
3.如权利要求2所述的破胶酶的生产，包括破胶酶发酵和提取步骤。
4.如权利要求2所述的破胶酶的生产，其特征在于上述的破胶酶发酵步骤如下：首先将M1-4菌株接种到LB培养基，在20℃～50℃下发酵12小时获得种子液；再将种子液以5.0％的接种量接种于发酵培养基中，在20℃～50℃下100rpm～250rpm培养3～5天完成发酵获得发酵液，其中发酵培养基的配方是：胍豆胶10g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.2。
5.如权利要求4所述的破胶酶的生产，其特征在于上述的发酵温度为37℃。
6.如权利要求2所述的破胶酶的生产，其特征在于上述的破胶酶提取步骤如下：将发酵液离心去除菌体，再将获得的发酵上清液流经层析柱；层析柱以pH 7.3的Tris-HCl缓冲液平衡后以0.5mol～1.5mol的NaCl溶液进行洗脱，洗脱速率为5～15ml/h，收集酶液并用饱和硫酸铵溶液沉淀得到破胶酶。
7.如权利要求6所述的破胶酶的生产，其特征在于上述的发酵上清液用0.22μm滤膜过滤后再经层析柱洗脱。
8.如权利要求6或7所述的破胶酶的生产，其特征在于上述的层析柱为20×250mm的琼脂糖层析柱。
9.权利要求1所述的M1-4菌株用于制成菌液制剂。
10.如权利要求9所述的菌液制剂，其特征在于上述制剂中Bacilluslichenformis M1-4菌的浓度为107～109CFU/mL。
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