CN102162907B - 一种多波长显微照明装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多波长显微照明装置。本发明提供的装置可以提供从近紫外到中红外的宽广波带范围内的激光波长，而且可以达到1nJ/nm以上的光谱能量密度，可以适用于绝大多数荧光和拉曼样品的激发，而且多个波长来自于同一激光光源，不存在同步时间失调问题，使用一台脉冲激光器还可以极大地降低设备的成本。

Description

一种多波长显微照明装置
技术领域
本发明涉及一种多波长显微照明装置，属于光学显微成像领域。
背景技术
光学显微成像以其非侵入式三维成像能力，在生命科学成像研究中仍然占据大约80％的份额(Stefan W.Hell，et al.，Science，316，25(2007))。随着光学显微成像技术的发展，出现了多色激发荧光显微镜(Amit Agrawal，et al.，PNAS，105，9，3298-3303(2008))、受激辐射耗尽超分辨显微镜(Thomas A.Klar，et.al.，Physical review E.，64，066613(2001)；Marcus Dyba，et.al.，Phys.Rev.Lett.，88(16)，163901(2002))、以及相干反斯托克斯拉曼散射显微镜(Andreas Zumbusch，et.al.，Phys.Rev.Lett.，82，20，4142-4145(1999))等，所有这些显微成像技术都需要多波长激发。传统的显微镜多波长激发光源是卤素灯或者氙灯，但是这种光源的光谱能量密度很低，需要高表达的样品和高灵敏度探测器，限制了在低表达样品和弱信号探测中的应用。激光光源可以提供非常高的能量密度，适用于对低表达样品的弱信号显微成像。使用多台脉冲激光器可以提供多个激发波长，但是在显微成像中往往要求几列激光脉冲同时到达或者具有固定的延迟时间，不同激光器之间的脉冲同步时间漂移会导致显微成像质量的降低甚至成像失败，而且脉冲激光器往往只有几个固定的输出波长，只能提供为数不多的样品所需要的激发波长，多台脉冲激光光源也会导致高昂的设备成本。连续输出激光器可以提供很多激光波长，而且不存在同步失调问题，但是连续输出激光难以达到较高的能量密度，而且连续激发样品会导致样品的变性甚至损坏。
发明内容
本发明的目的是提供一种多波长显微照明装置；所述装置中，由同一台脉冲激光器同时提供多个激发波长，克服了非激光光源能量密度低下的缺点，克服了多台脉冲激光器同步失调和波长数有限的缺点，克服了连续输出激光器能量密度低下和连续激发样品导致的样品变性甚至损坏的缺点。
本发明提供的一种多波长显微照明装置，皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器输出的激光脉冲入射到非线性光子晶体光纤上得到宽带激光光源；所述宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器上得到重复频率的激光脉冲光束；所述激光脉冲光束的光路上设有光束分离器和若干个反射镜，将所述激光光束分离为n束平行的输出光束，n为≥2的自然数；每束所述输出光束的光路上均依次设有色散棱镜或散射光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b；(n-1)束所述输出光束经过所述色散棱镜或散射光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b后再分别经过直角棱镜，得到不同延迟时间的n束平行的输出光束。
上述的照明装置中，应用所述非线性光子晶体光纤的超连续产生可以提供高亮度超宽带光谱，由同一台宽带脉冲激光器同时提供多个激发波长；利用所述激光光束的光路上设有光束分离器获得需要的n束激光脉冲。
荧光分子光漂白的主要原因之一是由于荧光分子跃迁到三重态所致，由于三重态为亚稳态，平均寿命大约在微秒量级，不能及时跃迁到分子的基态，导致荧光分子漂白。适当调节选择激发光脉冲重复频率，使得处于三重态的分子有充分的时间跃迁到基态，就可以有效地降低光漂白效应。另外，在用显微系统进行的分子动力学行为研究中，也需要控制激发脉冲的重复频率，以观察单分子动力学行为，本发明通过声光调制器实现上述激光脉冲重复频率调节功能。
上述的照明装置中，所述n束输出光路上依次设置的色散棱镜或者色散光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b(组成波长选择器)，可以根据显微系统照明波长的需要，选择一束或几束不同波长的脉冲激光。
上述的照明装置中，n束所述合适波长的输出激光脉冲光束分别经过单模光纤耦合器，输出高质量的单模光束。
上述的照明装置中，所述直角棱镜可由两个垂直放置的反射镜组成。
对于不同的显微成像方式，对照明脉冲之间的同步延迟时间有不同的要求，比如超分辨受激辐射耗尽显微镜要求耗尽光脉冲比激发光脉冲延迟几个皮秒，而相干反斯托克斯拉曼散射显微镜要求泵浦脉冲和斯托克斯脉冲严格同步，在分子动力学的泵浦探针试验中，泵浦脉冲和探针脉冲之间的同步延迟时间需要根据实验要求而定。本发明中设置的光学延迟线(放置在一维微位移台上的直角棱镜或者两只垂直放置的反射镜)实现上述要求；在所述输出光束的光路中加入所述直角棱镜，通过调节不同波长脉冲的光程实现不同时间延迟。
本发明具有以下优点：(1)由所述激光光源提供照明，克服了非激光光源能量密度低下的缺点；可以提供从近紫外到中红外的宽广波带范围内的激光波长，而且可以达到1nJ/nm以上的光谱能量密度，可以适用于绝大多数荧光和拉曼样品的激发；(2)由同一台所述脉冲激光器同时提供具有多个激发波长的激光光源，克服了多台脉冲激光器同步失调和波长数有限的缺点，同时降低了设备的成本；(3)由同一台所述脉冲激光器输出的所述激光光源提供照明，一定程度上克服了连续输出激光器连续激发样品导致的样品变性甚至损坏的缺点。
附图说明
图1为本发明实施例1的显微照明装置的结构示意图。
图2为使用实施例1的显微照明装置对荧光标记的纳米微球的共聚焦和STED显微图像。
图中各标记如下：1皮秒脉冲激光器、2非线性光子晶体光纤、3声光调制器、4，6，7，13，15反射镜、5光束分离器、8色散棱镜、9透镜a、10空间光调制器、11透镜b、12单模光纤耦合器、14直角棱镜。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1、显微照明装置
本发明提供的显微照明装置，在皮秒脉冲激光器1输出的激光光源入射到非线性光子晶体光纤2上，得到了宽带激光光源；该宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器3上，通过控制声光调制器3的射频脉冲重复频率即可控制输出激光脉冲的重复频率，得到了合适的重复频率的激光脉冲光束；该激光光束通过反射镜4耦合进入光束分离器5，得到两束平行的输出光束；每路输出光束经过反射镜7耦合进入波长选择器，波长选择器由色散棱镜8、透镜a9、空间光调制器10、透镜b11组成，波长选择器用于获得合适波长的输出激光脉冲，透镜a9和透镜b11组成4f系统保证了不同波长选择时不致出现明显的光路偏离，波长选择后的输出激光脉冲经过单模光纤耦合器12输出高质量的单模激光脉冲；其中一路激光脉冲再依次经反射镜13、直角棱镜14和反射镜15后平行输出，通过移动直角棱镜14调节该激光脉冲的光程以实现两激光脉冲之间的不同时间延迟。
上述的显微照明装置中，激光光源还可为飞秒激光器；色散棱镜还可以为散射光栅；直角棱镜可由两只垂直放置的反射镜组成；输出光束的条数可以根据需要进行设置；输出光束的波长也可以根据需要进行选择。
使用上述显微照明装置对荧光标记的直径为40纳米的纳米微球进行了共聚焦和受激辐射耗尽显微(STED)成像试验，通过波长选择器(色散棱镜8、透镜a9、空间光调制器10、透镜b11)选择合适的激发和受激辐射耗尽波长，通过光学延迟线(直角棱镜14)调节合适的同步延迟时间，获得了图2右图所示受激辐射耗尽显微图像(7.6umX7.0um，256像素X236像素)。其中左图为其对应的共聚焦显微图像，可以看到在受激辐射耗尽显微图像中两个纳米微球可以清晰分辨，小球亮度的半高全宽为110纳米，而对应的共聚焦图像中亮斑的半高全宽为580纳米，实现了光学超分辨成像。
上述显微照明装置还适用于相干反斯托克斯拉曼散射显微成像、多色荧光成像、多色非线性光学成像等。

Claims (4)

1.一种多波长显微照明装置，其特征在于：皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器输出的激光脉冲入射到非线性光子晶体光纤上得到宽带激光光源；所述宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器上得到重复频率的激光脉冲光束；所述激光脉冲光束的光路上设有光束分离器和若干个反射镜，将所述激光脉冲光束分离为n束平行的输出光束，n为≥2的自然数；每束所述输出光束的光路上均依次设有色散棱镜或散射光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b；(n-1)束所述输出光束经过所述色散棱镜或散射光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b后再分别经过直角棱镜，得到不同延迟时间的n束平行的输出光束。
2.根据权利要求1所述的照明装置，其特征在于：n束所述输出光束依次经过所述色散棱镜或散射光栅、透镜a、空间光调制器和透镜b后再分别经过光纤耦合器。
3.根据权利要求2所述的照明装置，其特征在于：所述光纤耦合器为单模光纤耦合器。
4.根据权利要求1-3中任一所述的照明装置，其特征在于：所述直角棱镜由两只垂直放置的反射镜组成。
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