CN102156161A

CN102156161A - 一种检测麻痹性贝毒的装置及检测方法

Info

Publication number: CN102156161A
Application number: CN2011100688658A
Authority: CN
Inventors: 梅振华; 张召香; 李雪梅; 任锐; 李晓琳; 葛安青; 张书圣
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明描述了一种测定麻痹性贝毒的新型毛细管电泳电化学免疫分析装置及相关检测方法。装置包括：切口毛细管；底物池，池体两侧水平开一贯穿孔；毛细管插设在该贯穿孔内，底物池两侧端各伸出一段毛细管，作为分离管和反应管；分离管入口端与缓冲液池相连；缓冲液池和底物池上方分别连接缓冲液压池和底物液压池；毛细管末端插入电化学检测池中；其检测方法为：贝类样品中的麻痹性贝毒与酶标麻痹性贝毒同有限抗体竞争反应后在毛细管内分离，分离后的酶标麻痹性贝毒和酶标麻痹性贝毒-抗体复合物分别在反应管内同底物反应后进入电化学检测池检测。

Description

一种检测麻痹性贝毒的装置及检测方法

技术领域

本发明涉及毛细管电泳技术，具体地说是一种检测麻痹性贝毒的毛细管电泳电化学免疫分析装置及检测方法。

背景技术

近年来，不断加剧的海洋环境污染导致有害赤潮爆发的数量和规模不断增加，由赤潮生物产生的大量赤潮毒素或贝毒不仅严重破坏海洋渔业资源和水产养殖、恶化海洋环境，而且可以通过食物链向上层积累，危害人体健康。麻痹性贝毒在全世界沿海都有分布，因赤潮生物种类及其地理分布不同，主要成分也不同。麻痹性贝毒能使鱼类大量死亡，可在滤食性贝类体内大量积累，中毒贝类被人食用后，出现四肢面部肌肉麻痹、头痛恶心，最终因窒息死亡。这类毒素主要作用于神经细胞和肌肉细胞的钠离子通道，阻断钠离子内流，妨碍动作电位的形成，因此表现出神经中毒的特征。目前，许多国家对麻痹性贝毒的含量有严格规定，如加拿大规定，食品中的麻痹性贝毒超过80μg/100g禁止食用。

麻痹性贝毒是一类具有四氢嘌呤结构的化合物，呈碱性，易溶于水，在弱酸和低温条件下比较稳定，碱性条件下发生氧化，其典型化学结构式如图1所示。现已发现此类化合物有20多种，根据R₄基团的不同可以分为四类，分别是氨基甲酸脂类毒素，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素和漆沟藻毒素；N-磺酰氨甲酰基类毒素；脱氨甲酰基类毒素；脱氧氨甲酰基类毒素。此外，还发现了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羟基衍生物。在这些化合物中，石房蛤毒素、新石房蛤毒素、漆沟藻毒素毒性最大。

麻痹性贝毒化合物种类繁多，化学性质和结构复杂，测定分析贝毒的种类和含量比较困难。目前国际上普遍使用的贝毒检测方法是生物小鼠法、高效液相色谱法和免疫学法。生物小鼠法，是用盐酸在高温下提取藻类或贝体中的麻痹性贝毒，然后对小鼠进行腹腔注射，根据小鼠的死亡时间判断毒性大小；但在提取过程中有可能导致贝毒化合物的结构转化而改变毒性，且具有误差大、重现性差、可比性低的缺点。高效液相色谱法是将贝类组织的萃取液经前处理后，麻痹性贝毒在碱性条件下氧化生成荧光物质，进行荧光检测；缺点是前处理麻烦，仪器及分析试剂昂贵，操作复杂，需要专门的分析技术人员。免疫学法是目前比较流行的简单快速检测麻痹性贝毒的方法，利用抗体对麻痹性贝毒的结合反应，按照酶联免疫分析方法制成检测试剂盒，用于麻痹性贝毒的分析检测，该方法简便快速，所用的仪器简单，易于应用于现场监测，且国内有售成品试剂盒，但检测灵敏度较低，试剂价格昂贵。

毛细管电泳是近几年发展起来的海洋生物毒素分离检测技术之一，以其快速、灵敏、消耗样品量少而在贝类毒素的分离分析中发挥重要作用。贝类样品基体中干扰物质多，常对麻痹性贝毒的分析造成干扰。通过毛细管电泳分离、电化学酶联免疫分析可排除干扰，有选择的针对目标毒素进行检测。但目前为止，基于毛细管电泳电化学酶联免疫分析的检测麻痹性贝毒的装置及检测方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测麻痹性贝毒的装置及检测方法，该方法简化了样品处理过程、操作程序简单、选择性好、灵敏快速，特别适用于贝类样品中麻痹性贝毒含量的快速检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测麻痹性贝毒的装置，包括：一毛细管，距末端总长度1/4处切一小口；一池体，内部盛放底物溶液、插设电极和塑料管，池体两侧中间位置水平开有一贯穿孔；上述毛细管插设在该贯穿孔内，使池体两侧端各伸出一段毛细管，分别作为分离毛细管和反应管；分离毛细管入口端与缓冲液池相连；缓冲液池上方放置缓冲液压池，两池体通过带有开关阀的塑料管相连；底物池上方放置底物液压池，两池体通过带有开关阀的塑料管相连；毛细管末端插入电化学检测池中。

所述的缓冲液压池和底物液压池处于同一高度；所述的缓冲液池和缓冲液压池内盛放分离缓冲液；底物池和底物液压池内盛放底物溶液。

应用所述装置检测贝类样品中的麻痹性贝毒时，贝类样品中的麻痹性贝毒与酶标麻痹性贝毒同有限抗体竞争反应后在毛细管内分离，分离过程中确保缓冲液压池和底物液压池处于同一高度，使分离毛细管两端保持压力平衡，整个分离过程只有电场驱动力，同时由于压力的作用也可以确保底物进入反应毛细管。

操作如下：

(1)贝类样品处理：将贝类去除贝壳，贝肉浸洗、匀浆后，用盐酸调pH，离心，倾出上层清液，过滤；

(2)在上述处理的贝类样品溶液中加入过量酶标麻痹性贝毒和一定量的抗体进行孵化反应；

(3)上述孵化反应混合液进样后在分离毛细管中分成不同的区带，顺次进入反应毛细管中，酶标麻痹性贝毒-抗体复合物和剩余酶标麻痹性贝毒上标记的酶催化缓冲液中的过氧化氢氧化底物，生成具有电化学活性的物质，进入电化学检测池进行检测。

所述缓冲液为BR缓冲液，由磷酸、醋酸、硼酸加过氧化氢配制而成。

所述底物为邻氨基酚；所述酶为辣根过氧化物酶。

本发明的优点：

1、本发明将毛细管电泳、电化学检测和免疫分析结合起来，既具有毛细管电泳的高分离效率、电化学分析的高灵敏度，又具有免疫分析的高选择性和专一性，用于贝类样品中麻痹性贝毒的检测，避免了贝类样品前处理中需要过离子交换柱的烦琐程序，简化了操作步骤。

2、将毛细管电泳电化学酶联免疫分析法应用于麻痹性贝毒的检测，检测时间由常规免疫分析1天以上缩短至几分钟，操作简便快速，试剂消耗量少。

3、麻痹性贝毒免疫混合物在分离过程中使用缓冲液压池和底物液压池确保分离毛细管两端压力平衡，整个分离过程只有电场驱动力，分离效率高，同时由于压力的作用也确保底物进入反应毛细管。

4、利用免疫反应的专一性，将不同结构的麻痹性贝毒免疫体系经毛细管电泳分离后，可实现毛细管电泳电化学酶联免疫分析法同时测定多种麻痹性贝毒化合物。

附图说明

图1为麻痹性贝毒的化学结构，R₁＝H、OH，R₂＝H、OSO₃ ^-，R₃＝H、OSO₃ ^-，R₄＝OCONH₂、OCONHSO₃ ^-、OH、H；

图2为本发明检测麻痹性贝毒的毛细管电泳电化学免疫分析装置示意图；

图3为本发明一个实施例中酶标麻痹性贝毒的毛细管电泳谱图；

图4为本发明一个实施例中过量酶标麻痹性贝毒与酶标麻痹性贝毒-抗体复合物的毛细管电泳谱图，峰1为过量酶标麻痹性贝毒催化底物形成的电泳峰，峰2为酶标麻痹性贝毒-抗体复合物催化底物形成的电泳峰；

图5为本发明一个实施例中贝类样品中的麻痹性贝毒与酶标麻痹性贝毒同一定量的抗体竞争反应后的毛细管电泳谱图。

具体实施方式

以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。

实施例一毛细管电泳电化学免疫分析装置的构建

一个具体的检测麻痹性贝毒的毛细管电泳电化学免疫分析装置如图2所示。在缓冲溶液池3(0.8cm直径，1.5cm高)和底物溶液池5(0.8cm直径，1.5cm高)之间安放毛细管柱(河北永年光导纤维厂，20cm长，50μm内径，375μm外径)，毛细管柱在距末端5cm处切一小口，与5中的底物溶液相通。池体5内部盛放底物溶液、插设电极和塑料管，池体两侧中间位置水平开有一贯穿孔，用于安放毛细管柱，使池体两侧端各伸出一段毛细管，两段分别作为分离毛细管1和反应管2。分离毛细管1入口端与缓冲液池3相连；缓冲液池3上方放置缓冲液压池4，两池体通过带有开关阀7的塑料管相连；底物池5上方放置底物液压池6，两池体通过带有开关阀7的塑料管相连；毛细管末端插入电化学检测池8中，样品信号通过三电极系统传输给电化学检测器9；缓冲液压池4和底物液压池6处于同一高度；缓冲液池3和缓冲液压池4内盛放分离缓冲液；底物池5和底物液压池6内盛放底物；缓冲液池、缓冲液压池、底物池和底物液压池的池壁材质为聚四氟乙烯。

实验条件：

MPI-A型毛细管电泳数控高压电源、MPI-A型毛细管电泳电化学分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)，三电极体系：铂盘工作电极、铂丝辅助电极和银/氯化银参比电极，PHS-3D型pH计(上海雷磁科学仪器公司)。邻氨基酚、磷酸、硼酸、醋酸、氢氧化钠、辣根过氧化物酶(上海雪满生物科技有限公司)，麻痹性贝毒诊断试剂盒(美国，Abraxis公司)，其他试剂为分析纯，所有缓冲液及样品溶液在使用前均需用0.22μm微孔滤膜滤过，且在临用前进行超声脱气处理。

实施例二使用毛细管电泳电化学免疫分析方法检测贝类样品中的麻痹性贝毒

将贝类(扇贝或牡蛎)样品去除贝壳，贝肉用蒸馏水浸洗3次，匀浆10min，用6mol/L盐酸调制pH 3.5～4.0，冰水浴15min，超声10min，放置4℃下冷藏10min，趁凉离心10min，倾出上层清液用0.2μm的滤膜过滤；

在上述处理的贝类样品溶液中加入过量酶标麻痹性贝毒和一定量的抗体，在37℃孵化反应30分钟，贝类样品中的麻痹性贝毒和酶标抗原竞争一定量的抗体：

麻痹性贝毒+酶标麻痹性贝毒(过量)+抗体(一定量)＝麻痹性贝毒-抗体复合物+酶标麻痹性贝毒-抗体复合物+剩余酶标麻痹性贝毒；

将上述孵化反应混合液置于毛细管入口端，在分离毛细管两端加14kV电压，电动进样5s秒后，混合液中的麻痹性贝毒-抗体复合物、酶标麻痹性贝毒-抗体复合物和剩余酶标麻痹性贝毒根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不同的区带并顺次进入反应毛细管中，在反应毛细管中，标记在麻痹性贝毒上的辣根过氧化物酶催化缓冲液中的过氧化氢氧化底物邻氨基酚，生成具有电化学活性的物质3-氨基吩噁嗪，进入电化学检测池进行检测；

酶标麻痹性贝毒-抗体复合物和剩余酶标麻痹性贝毒上的辣根过氧化物酶的浓度不同，催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物3-氨基吩噁嗪的浓度就不同，产生不同的电化学信号，由此可对酶标麻痹性贝毒-抗体复合物以及贝类体内的麻痹性贝毒进行定量分析。

其实验结果：

如图3所示，酶标麻痹性贝毒从毛细管入口端进样，在14kV高压电场下向阴极迁移，进入电化学检测池进行检测，电泳峰出现在135s附近。

如图4所示，过量的酶标麻痹性贝毒与抗体溶液在37℃孵化反应30min，形成酶标麻痹性贝毒-抗体复合物，将混合溶液14kV电动进样5s后进行电泳分离检测，峰1为过量酶标麻痹性贝毒催化底物形成的电泳峰，峰2为酶标麻痹性贝毒-抗体复合物催化底物形成的电泳峰，两个电泳峰峰形较好，可以达到基线分离。

如图5所示，在上述过量酶标麻痹性贝毒与抗体混合溶液中加入贝类样品，贝类样品中的麻痹性贝毒同酶标麻痹性贝毒竞争一定量的抗体，生成未标记的麻痹性贝毒-抗体复合物，使得孵化后混合溶液中酶标麻痹性贝毒-抗体复合物的浓度降低，过量酶标麻痹性贝毒浓度增大，因此，同图4相比，图5中酶标麻痹性贝毒的电泳峰(峰1)升高，酶标麻痹性贝毒-抗体复合物的电泳峰(峰2)降低，说明贝类样品中含有麻痹性贝毒。

Claims

1.一种检测麻痹性贝毒的毛细管电泳电化学免疫分析装置，其特征包括：

1)一毛细管，在距末端总长度1/4处切一小口；

2)一池体，内部盛放底物溶液、插设电极和塑料管，池体两侧中间位置水平开有一贯穿孔；

3)上述毛细管插设在该贯穿孔内，使池体两侧端各伸出一段毛细管，分别作为分离毛细管和反应管；

4)分离毛细管入口端与缓冲液池相连；

5)缓冲液池上方放置缓冲液压池，两池体通过带有开关阀的塑料管相连；

6)底物池上方放置底物液压池，两池体通过带有开关阀的塑料管相连；

7)毛细管末端插入电化学检测池中。

2.按照权利要求1所述检测麻痹性贝毒的装置，其特征在于：所述的缓冲液压池和底物液压池处于同一高度。

3.按照权利要求1所述检测麻痹性贝毒的装置，其特征在于：所述的缓冲液池和缓冲液压池内盛放分离缓冲液；底物池和底物液压池内盛放底物溶液。

4.一种应用权利要求1所述装置检测贝类样品中麻痹性贝毒的方法，其特征在于：

(1)贝类样品处理：将贝类样品去除贝壳，贝肉用蒸馏水浸洗，匀浆，用盐酸调至pH 2.0～5.0，离心，倾出上层清液，用滤膜过滤；

5.按照权利要求4所述检测贝类样品中麻痹性贝毒的方法，其特征在于：所述缓冲液为BR缓冲液，其配制方法为：取磷酸、醋酸、硼酸溶解稀释，用氢氧化钠调pH后，加入过氧化氢溶液定容。

6.按照权利要求4所述检测贝类样品中麻痹性贝毒的方法，其特征在于：所述底物为邻氨基酚。

7.按照权利要求4所述检测贝类样品中麻痹性贝毒的方法，其特征在于：所述酶为辣根过氧化物酶。