CN102156160B - 二维蛋白质电泳提升测量精度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种二维蛋白质电泳的等电聚焦法提升实验精度的方法，尤指一种借由测量蛋白质待测物的导电度，以计算其中盐类及蛋白质聚焦所需要的电能，其特点在于以一组公式，根据盐类的不同导电度、蛋白质重量、pH梯度胶体长度与pH值范围的环境下，分别计算出蛋白质聚焦时与盐类泳动所需的电能，可以于等电聚焦法中，提供个别蛋白质待测物实验适当的电能，以呈现最佳蛋白质聚焦结果，避免因电能不足或过大时，影响胶体上的蛋白质聚焦。

Description

二维蛋白质电泳提升测量精度的方法

技术领域

本发明提供一种二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，尤指一种借由测量蛋白质待测物的导电度以评估盐类含量，并以计算公式推导盐类泳动及蛋白质聚焦所需要的电能。

背景技术

自80年代以来，生物工程成为科学技术的重要标志，许多重要研究都要依赖电泳分离技术，此技术已成为化学、分子生物学以及相关工业不可或缺的实验方法；因其蛋白质分子上的净电荷，取决于环境pH的高低，电泳分离技术需要一介质作为其场所，现今多使用半固态的胶体，主要以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦法、二维电泳分析法和蛋白质转印法等技术；

二维电泳分析法，即电泳的方向分为两个，第一个分离方向为等电聚焦法(isoelectric focusing，IEF)，第二个分离方向为依据分子量进行分离的SDS电泳法；等电聚焦法的原理是样品蛋白质在含有两性电解质的胶体中电泳时，通电后两性电解质会在胶体中形成一pH梯度，当样本中的蛋白质依电场泳动至相当于其等电点(pI)的pH位置时，其净电荷会变为零(pH＝pI)，因而聚焦于该处而静止，达到分离的目的；聚丙烯酰胺胶体(SDS PAGE)于胶体中加入SDS，SDS为一种界面活性剂，会破坏分子构形，并在分子表面均匀涂布一层SDS负电分子，蛋白质分子不论原来带正或负电，均可往正极跑，泳动率与分子量成反比；因此SDS-PAGE可用来测定蛋白质的分子量在凝胶上以两个维度展开的方式分离；

实验的生物样品，在胶体中除了蛋白质分子外，还包括多种盐类，因盐类也具有电解质的特性，故在电泳时有一部份的电压电能消耗于驱动会使用于电解盐类泳动，由于样品中盐类含量与实验及生物特性有关，无法准确预估；因此操作二维电泳分析法的等电聚焦法时，一般无法评估盐类消耗的电能，也无法准确地测出计算样品中蛋白质分子于泳动时所需的电能；而在等电聚焦电泳中，若所提给的蛋白质分子的电能不足的话，等电聚焦法则无法于试片等电聚焦胶体上产生良好的蛋白质聚焦作用，形成聚焦不足(under-focusing)；若提供的电能过太大时，将会使试片上的蛋白质分子泳离胶体，而形成聚焦过度(over-focusing)；故多数实验室为透过蛋白质沉淀及大量冲洗以除去其蛋白质样本中的盐类，但同时可能也有许多重要的蛋白质因此流失；甚至有些特定的蛋白质样本，无法在过程中有效地沉淀。

因此，上述问题，是在本领域技术人员所要解决的困难所在。

发明内容

至目前为止，没有测量等电聚焦法效能以提供二维蛋白质电泳实验精度的方法，其主要原因在于：二维蛋白质电泳分析的蛋白质待测物体积较小，且其中盐类组成复杂，使得盐类含量不易测量；另一原因在于：尚无对等电聚焦法实验中蛋白质与盐类消耗电能的量化计算方法，使得操作者无适当逻辑可以事先评估计算，以获得较佳的蛋白质聚焦实验结果；然而，水溶液的导电度与其中盐类含量呈线性关系，因此在二维电泳蛋白质待测物的盐类含量，也应与其导电度相关；借由测量蛋白质待测物的导电度应可作为评估盐类含量的方法。

因此，本发明有鉴于现有技术所述的不足，提出一种二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，主要步骤包括有：

(a)测量蛋白质待测物的重量M_exp；

(b)测量蛋白质待测物中盐类导电度S_exp；

(c)代入如下公式以计算出提供该蛋白质待测物最佳总蛋白质聚焦电能，其公式包含：

${\mathrm{Vh}}_{\mathrm{protein}\_\exp }={\mathrm{Vh}}_{\mathrm{protein}\_\mathrm{ref}}\×\frac{M_{\exp }}{M_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\exp }}{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\mathrm{ref}}}{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\exp }}---\left(c1\right)$

${\mathrm{Vh}}_{\mathrm{salt}\_\exp }={\mathrm{Vh}}_{\mathrm{salt}\_\mathrm{ref}}\×\frac{S_{\exp }-S_{\mathrm{blank}}}{S_{\mathrm{ref}}-S_{\mathrm{blank}}}\×\frac{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\exp }}{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\mathrm{ref}}}{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\exp }}---\left(c2\right)$

Vh_{total_exp}＝Vh_{salt_exp}+Vh_{protein_exp}                (c3)

其中Vh_{salt_ref}、Vh_{protein_ref}分别为经由实验结果参考所建立的标准盐类泳动电能与标准蛋白质聚焦电能；Vh_{salt_exp}、Vh_{protein_exp}分别为借由公式计算得到的未知盐类泳动电能与蛋白质聚焦电能；M_ref、M_exp分别为标准蛋白质重量与蛋白质待测物重量；S_blank、S_ref、S_exp分别为不含蛋白质的胶体溶液导电度、标准盐类导电度与未知测量盐类导电度；strip length_ref、strip length_exp分别为标准pH梯度胶体长度与实际pH梯度胶体长度；pH range_ref、pH range_exp分别为标准pH范围与实际pH范围。

(d)将蛋白质待测物中盐类的导电度、蛋白质重量、pH梯度胶体长度与pH值范围的参数代入步骤(c)所述公式，计算出最佳总蛋白质聚焦电能，可呈现最佳蛋白质聚焦结果。

其中，最佳总蛋白质聚焦电能，为经公式计算得到蛋白质待测物中未知盐类泳动电能与蛋白质聚焦电能的总和。

其中，最佳总蛋白质聚焦电能，与所述蛋白质待测物重量成正相关。

其中，最佳总蛋白质聚焦电能，与蛋白质待测物中未知测量盐类导电度成正相关。

其中，所述pH梯度胶体长度愈长需要提供愈大的能量，以使蛋白质和盐类移动至目的地。

其中，所述pH值的范围，愈窄的pH范围需要提供愈大的能量，以使蛋白质和盐类泳动至目的地。

其中，实际pH梯度胶体长度较标准PH梯度胶体长度少1cm。

本发明能够达到以下的技术效果：

1、借由测量二维电泳蛋白质待测物的导电度，以推得其中盐类含量，来计算待测物盐类于等电聚焦法中所需的电能；

2、提供一组等电聚焦法电能计算公式，参数包括样品中盐类含量(以导电度呈现)、样品中蛋白质含量(以重量表示)、pH梯度胶体长度与pH值范围；使用上述公式将分别计算出待测物中蛋白质聚焦、与盐类泳动所需的个别电能，经加总后可精确地推算出待测物于等电聚焦法所需的总电能，进而提高二维蛋白质电泳实验的精度，也避免因电能不足或过度时，等电聚焦法实验产生不佳的蛋白质聚焦作用。

附图说明

图1是本发明的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法的流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

图1为本发明的流程图，提供一种二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，尤指一种借由测量蛋白质待测物的导电度，以计算出盐类及蛋白质聚焦所需要的电能，其步骤包括有：

S1、测量蛋白质待测物的导电度S_exp

以一手持式导电度计OAKTON ECTester11+(Oakton instruments，VernonHills，IL，USA)于温度4℃时取出250μL蛋白质待测物，置于感应装置的读取端中，以测量其蛋白质待测物的导电度(单位为μS/cm，S：siemens)；并取三次量测的平均值为最后的结果；

S2、测量蛋白质待测物的重量M_exp；

S3、计算蛋白质待测物等电焦集聚焦法所需的电能，将系统数值代入公式当中；若125μL在水合胶体溶液中的盐类导电度为31μS，不含蛋白质的胶体溶液导电度为25μS，标准蛋白质重量M_ref为50μg；该pH梯度胶体长度为7cm，标准pH范围为3-10；经由实验结果参考所建立的标准盐类泳动电能Vh_{salt_ref}为200Vh与标准蛋白质焦集聚焦电能Vh_{protein_ref}为1050Vh；若蛋白质待测物重量为50μg，使用pH梯度胶体长度为13cm，实际pH范围为4-7，则根据公式计算结果，总共蛋白质焦集聚焦电能为5833Vh；

${\mathrm{Vh}}_{\mathrm{protein}\_\exp }={\mathrm{Vh}}_{\mathrm{protein}\_\mathrm{ref}}\×\frac{M_{\exp }}{M_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\exp }}{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\mathrm{ref}}}{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\exp }}---\left(c1\right)$

$=1050\mathrm{Vh}\×(50\mathrm{\μg}/50\mathrm{\μg})\×(12\mathrm{cm}/6\mathrm{cm})\×(10-3/7-4)\text{=4900Vh}$

${\mathrm{Vh}}_{\mathrm{salt}\_\exp }={\mathrm{Vh}}_{\mathrm{salt}\_\mathrm{ref}}\×\frac{S_{\exp }-S_{\mathrm{blank}}}{S_{\mathrm{ref}}-S_{\mathrm{blank}}}\×\frac{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\exp }}{\mathrm{strip}{\mathrm{length}}_{\mathrm{ref}}}\×\frac{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\mathrm{ref}}}{\mathrm{pH}{\mathrm{range}}_{\exp }}---\left(c2\right)$

$=200\mathrm{Vh}\×(31\mathrm{\μS}-25\mathrm{\μS}/31\mathrm{\μS}-25\mathrm{\μS})\×(132\mathrm{cm}/6\mathrm{cm})\×(10-3/7-4)$

$=933\mathrm{Vh}$

Vh_{total_exp}＝Vh_{salt_exp}+Vh_{protein_exp}            (c3)

＝4900Vh+933Vh＝5833Vh；

S4、等电聚焦法

蛋白质颗粒洗涤后，溶解于再水合缓冲液，其中包括尿素8M、丙磺酸2％、梯度缓冲液0.5％及二硫苏糖醇18mM；蛋白质待测物，被置于20℃在电泳仪系统内(IPGphor II system，GE Healthcare BioSciences)18至24小时内，溶于不同长度和pH值范围的pH梯度胶体(GE Healthcare BioSciences，Piscataway，NJ，USA)上；其最大聚焦电流为100Ma/strip；

S5、SDS电泳法

pH梯度胶体于SDS缓冲液平衡(75mM三羟甲基氨基甲烷、尿素6M、丙三醇30％、SDS 2％及溴酚蓝0.01％于，其pH值8.8)，再加入二硫苏糖醇1％或碘乙酰胺2.5％使蛋白质变性；平衡后，SDS电泳法借由12.5％SDS-PAGE呈现于SE-260、SE-600或Daltsix电泳系统中(GE Healthcare BioSciencse)；

S6、蛋白质胶体染色法

咪唑锌反向斑点的呈现可借由一试剂盒，VisPro 5 Min protein stainkit(Visual Protein，Taipei，Taiwan)，电泳后，快速地以蒸馏水清洗胶体，并加入一感应溶剂，置于一震荡器上五分钟后成型，以蒸馏水冲洗后胶体加入培养液，接着将其浸于大量蒸馏水中以中止其发展；改良后的胶体有白色的背景上使蛋白质斑点呈不透明，以达储存于蒸馏水中的目的；

S7、影像显示与分析

所有改良后的胶体，皆借由光学平板扫描器的透明单元以TIFF格式进行扫描，其解析度为200dpi；其胶体上的染色斑点以反方向记载，以得到较好的影像；于胶体影像分析时，使用ImageMaster 2D Platinum software version5.0(GE Healthcare BioSciences)以侦测其蛋白质斑点数目。

综合上述，以上为本发明的一较佳实施例，非因此即局限本发明的保护范围，本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，主要步骤包括有：

（a）测量蛋白质待测物的重量M_exp；

（b）测量蛋白质待测物中盐类导电度S_exp；

（c）代入如下公式以计算出提供该蛋白质待测物最佳总蛋白质聚焦电能，其公式包含：

其中Vh_{salt_ref}、Vh_{protein_ref}分别为经由实验结果参考所建立的标准盐类泳动电能与标准蛋白质聚焦电能；Vh_{salt_exp}、Vh_{protein_exp}分别为借由公式计算得到的未知盐类泳动电能与蛋白质聚焦电能；M_ref、M_exp分别为标准蛋白质重量与蛋白质待测物重量；S_blank、S_ref、S_exp分别为不含蛋白质的胶体溶液导电度、标准盐类导电度与未知测量盐类导电度；strip length_ref、strip length_exp分别为标准pH梯度胶体长度与实际pH梯度胶体长度；pH range_ref、pH range_exp 分别为标准pH范围与实际pH范围；

（d）将蛋白质待测物中盐类的导电度、蛋白质重量、pH梯度胶体长度与pH值范围的参数代入步骤（c）所述公式，计算出最佳总蛋白质聚焦电能，可呈现最佳蛋白质聚焦结果。

2.根据权利要求1所述的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，最佳总蛋白质聚焦电能，为经公式计算得到蛋白质待测物中未知盐类泳动电能与蛋白质聚焦电能的总和。

3.根据权利要求1所述的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，最佳总蛋白质聚焦电能，与所述蛋白质待测物重量成正相关。

4.根据权利要求1所述的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，最佳总蛋白质聚焦电能，与蛋白质待测物中未知测量盐类导电度成正相关。

5.根据权利要求1所述的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，所述pH梯度胶体长度愈长需要提供较大的能量，以使蛋白质和盐类移动至目的地。

6.根据权利要求1所述的二维蛋白质电泳提升测量精度的方法，其特征在于，所述pH值的范围，愈窄的pH范围需要提供愈大的能量，以使蛋白质和盐类泳动至目的地。