CN102154417A - 一种杠柳次苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备杠柳次苷的方法。具体地说，本发明第一方面涉及一种制备杠柳次苷的方法，其包括以下步骤：(1)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；(2)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；(3)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到杠柳次苷。本发明还提供了一种包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分数计包含80％以上的杠柳次苷。本发明还提供了以及包含杠柳次苷的组合物。本发明制备的杠柳次苷纯度高，制备方法低毒、简便、可靠、和/或适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种杠柳次苷的制备方法，还涉及一种包含杠柳次苷的提取物及其组合物。
背景技术
中药香加皮(Cortex Periplocae)又名北五加皮，是萝藦科植物杠柳(Periploca sepium Punge)的干燥根皮，因其含有强心苷成分，近年来常用于治疗急、慢性充血性心力衰竭。目前对于香加皮强心苷类的研究，由于杠柳毒苷(Periplocin，C36H56O13)在香加皮药材中含量较高，制备单体化合物相对容易，故关注杠柳毒苷较多，而对杠柳次苷关注较少。
杠柳毒苷结构为杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)-(D-葡萄糖)。杠柳次苷(periplocymarin，C30H46O8)结构为杠柳苷元-(D-加拿大麻糖)，是由杠柳毒苷脱去一分子葡萄糖而生成的次生甲型强心苷。通常甲型强心苷及其苷元的活性/毒性存在如下规律：苷元＜单糖苷＞二糖苷＞三糖苷[肖崇厚.中药化学.上海：上海科学技术出版社.1997：341]。杠柳次苷为单糖苷，其活性/毒性之所以大于杠柳苷元，是由于其对心肌细胞膜上类脂质的亲和力大于苷元；而杠柳毒苷(二糖苷)的活性/毒性之所以小于杠柳次苷，是由于随着这些分子中糖基数目的增加，水溶性增大，亲脂性降低，与心肌细胞膜上类脂质的亲和力减弱，强心作用减小。文献报道[李章文.杠柳皮(北五加皮)的强心作用.中华医学杂志.1956，7：651]杠柳次苷具有比杠柳毒苷强心作用更快、持续时间更短、蓄积作用更小等特点。另外，研究发现杠柳毒苷与大鼠、人体的肠菌温孵，会迅速代谢生成杠柳次苷[任晓亮，谢跃生，潘桂湘，等.香加皮强心成分杠柳毒苷肠菌代谢研究.天津中医药，2007，24(6)：515.]；大鼠口服杠柳毒苷，粪便中也主要以杠柳次苷的形式排泄[王强，任晓亮，王焱，等.杠柳毒苷在大鼠体内排泄的初步研究.天津中医药大学学报，2008，27(1)：29]。因此，杠柳次苷也应是香加皮起强心作用的主要成分之一。对杠柳次苷进行制备，有利于明确中药香加皮强心物质基础的研究，以及利于该中药的进一步开发。
默克索引(14版，第1239页)提到过杠柳次苷的酶解制备方法：用70％乙醇提取希腊杠柳，然后用源自Strophanthus courmonti Saclcux，Apocynaceae种子的毒毛旋花子双糖酶(enzyme strophanthobiase)处理，然而其中并未提及杠柳毒苷酶解的具体工艺以及工艺效果例如杠柳次苷的收率、纯度等。
因此提供一种稳定、可靠、低毒、和/或可用于工业化生产的制备杠柳次苷的方法，获得高纯度的杠柳次苷，以供新药研发或科学研究，仍是本领域技术人员急于解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有制备杠柳次苷技术中存在的不足，提供一种稳定、可靠、低毒、和/或可用于工业化生产的、制备高纯度杠柳次苷的方法。本发明令人意外地发现，通过将含有杠柳毒苷的底物用蜗牛酶进行酶解，接着进行柱层析和重结晶，可以以高的纯度和/或产率获得杠柳次苷。本发明基于以上发现而得以完成。
发明概述：
为此，本发明第一方面提供了一种制备杠柳次苷的方法，其包括以下步骤：
(1)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；
(2)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；
(3)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到杠柳次苷。
本发明第二方面提供了一种包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分数计包含80％以上(或者优选85％以上，优选90％以上)的杠柳次苷。
本发明第三方面提供了一种组合物，包含杠柳次苷或者本发明第二方面任一项所述的提取物，并且其中基本上不合杠柳毒苷。
发明详述：
本发明第一方面提供了一种制备杠柳次苷的方法，其包括以下步骤：
(1)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；
(2)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；
(3)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到杠柳次苷。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述底物可以是杠柳毒苷单体、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮药材、或其组合。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶的重量比为(1～10)∶1，优选为(2～10)∶1，优选为(5～10)∶1。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中进行的，优选的pH为4～6。在一个实施方案中，所述缓冲液包括但不限于乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲溶液、及其组合。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应是在20℃～55℃下进行的，优选的酶解反应温度是30℃～40℃。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中、在20℃～55℃下温孵4h～48h来进行的，优选的酶解反应时间为10h～40h，更优选15h～30h。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应是通过加入酶解终止剂来终止的。在一个实施方案中，其中所述酶解终止剂选自：甲醇、乙醇、含有甲醇和/或乙醇的丙酮、或其组合。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应在被终止之后，还任选包括用有机溶剂进行萃取的步骤。在一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯或三氯甲烷。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述酶解反应在被终止之后，还包括用有机溶剂进行萃取，然后将有机层浓缩和/或干燥的步骤。在一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯或三氯甲烷。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述色谱层析是选自以下的色谱层析方法：硅胶柱层析法、大孔树脂柱层析法、反相C18柱色谱分离法、高速逆流色谱法、及其组合。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述色谱层析是使用硅胶柱层析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液。在一个实施方案中，所述洗脱液是乙酸乙酯∶石油醚为(0.5～5)∶1(v/v)的等度或梯度洗脱液。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述色谱层析是使用大孔树脂柱层析法，并且用85～98％乙醇作为洗脱液。在一个实施方案中，所述大孔树脂柱层析法是先用水和20～40％乙醇预洗除杂，然后用85～98％乙醇洗脱，优选用90～98％乙醇洗脱，更优选用约95％乙醇洗脱。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述色谱层析是使用反相C18柱色谱分离法，并且用(50～70)∶(50～30)的甲醇∶水或者用(25～50)∶(75～50)的乙腈∶水作为流动相。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述色谱层析是使用高速逆流色谱法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4∶3∶2～5∶4∶3震荡溶解进样，在温度30～40℃下进行高速逆流色谱。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，其中所述步骤(3)的重结晶过程是使步骤(2)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入适量水而进行的。在一个实施方案中，其中所述步骤(3)的重结晶过程是使步骤(2)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入适量水使达到约50％甲醇的溶剂体系而进行的。在一个实施方案中，其中所述步骤(3)的重结晶过程是使步骤(2)的精制提取物溶解于甲醇中，加入适量水，静置，析出白色针状结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥而进行的。
根据本发明第一方面所述方法，其包括以下步骤：
(1)酶解：将含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶(1∶1～10∶1w/w)混合，加入pH 3～7的缓冲液，22℃～54℃下温孵，4h～48h后加入试剂终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层浓缩干燥，得酶解粗提物；
(2)柱层析：将酶解粗提物进行硅胶柱层析，以薄层色谱法监测流份，合并含有杠柳次苷的流份，浓缩干燥，得精制提取物；
(3)重结晶：将精制提取物，用甲醇溶解后加入适量水，静置，析出白色针状结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得杠柳次苷。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述含杠柳毒苷的底物可以是杠柳毒苷单体或香加皮提取物或香加皮药材。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶的混合比例优选为5∶1～10∶1w/w。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述缓冲液pH优选为4～6。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述温孵温度优选为30℃～40℃。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述温孵时间优选为15h～30h。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(1)所述终止酶反应的试剂为含醇水溶性有机溶剂(例如：甲醇或乙醇或含有甲醇/乙醇的丙酮)。
根据本发明第一方面所述方法，其总体收率可达80％以上，优选85％以上，优选90％以上。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(3)所得产物中含有80％(w/w)以上(或者优选85％以上，优选90％以上)的杠柳次苷。
在本发明第一方面所述方法的一个实施方案中，步骤(3)所得产物中基本上不含杠柳毒苷。
本发明第二方面提供了一种包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分数计包含80％以上(或者优选85％以上，优选90％以上)的杠柳次苷。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中基本上不含杠柳毒苷。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，所述提取物是通过包括以下步骤的制备方法得到的：
(i)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；
(ii)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；
(iii)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到包含杠柳次苷的提取物。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述底物可以是杠柳毒苷单体、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮药材、或其组合。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶的重量比为(1～10)∶1，优选为(2～10)∶1，优选为(5～10)∶1。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中进行的，优选的pH为4～6。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应是在20℃～55℃下进行的，优选的酶解反应温度是30℃～40℃。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中、在20℃～55℃下温孵4h～48h来进行的，优选的酶解反应时间为10h～40h，更优选15h～30h。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应是通过加入酶解终止剂来终止的。在一个实施方案中，其中所述酶解终止剂选自：甲醇、乙醇、含有甲醇和/或乙醇的丙酮、或其组合。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应在被终止之后，还任选包括用有机溶剂进行萃取的步骤。在一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯或三氯甲烷。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述酶解反应在被终止之后，还包括用有机溶剂进行萃取，然后将有机层浓缩和/或干燥的步骤。在一个实施方案中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯或三氯甲烷。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述色谱层析是选自以下的色谱层析方法：硅胶柱层析法、大孔树脂柱层析法、反相C18柱色谱分离法、高速逆流色谱法、及其组合。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述色谱层析是使用硅胶柱层析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液。在一个实施方案中，所述洗脱液是乙酸乙酯∶石油醚为(0.5～5)∶1(v/v)的等度或梯度洗脱液。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述色谱层析是使用大孔树脂柱层析法，并且用85～98％乙醇作为洗脱液。在一个实施方案中，所述大孔树脂柱层析法是先用水和20～40％乙醇预洗除杂，然后用85～98％乙醇洗脱，优选用90～98％乙醇洗脱，更优选用约95％乙醇洗脱。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述色谱层析是使用反相C18柱色谱分离法，并且用(50～70)∶(50～30)的甲醇∶水或者用(25～50)∶(75～50)的乙腈∶水作为流动相。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述色谱层析是使用高速逆流色谱法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4∶3∶2～5∶4∶3震荡溶解进样，在温度30～40℃下进行高速逆流色谱。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述制备方法中，所述步骤(iii)的重结晶过程是使步骤(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入适量水而进行的。在一个实施方案中，其中所述步骤(iii)的重结晶过程是使步骤(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入适量水使达到约50％甲醇的溶剂体系而进行的。在一个实施方案中，其中所述步骤(iii)的重结晶过程是使步骤(ii)的精制提取物溶解于甲醇中，加入适量水，静置，析出白色针状结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥而进行的。
在本发明第二方面所述提取物的一个实施方案中，其中所述提取物是通过包括以下步骤的制备方法得到的：
(i)酶解：将含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶(1∶1～10∶1w/w)混合，加入pH 3～7的缓冲液，22℃～54℃下温孵，4h～48h后加入试剂终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层浓缩干燥，得酶解粗提物；
(ii)柱层析：将酶解粗提物进行硅胶柱层析，以薄层色谱法监测流份，合并含有杠柳次苷的流份，浓缩干燥，得精制提取物；
(iii)重结晶：将精制提取物，用甲醇溶解后加入适量水，静置，析出白色针状结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得杠柳次苷。
本发明第三方面提供了一种组合物，包含杠柳次苷或者本发明第二方面任一项所述的提取物，并且其中基本上不含杠柳毒苷。
根据本发明第三方面的组合物，其中还包含生理学上可接受的载体或赋形剂。
本发明第一方面的各个实施方案可以与该方面的一个或多个其它实施方案进行任意组合，只要这种组合不会出现矛盾。当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。对于本发明的其它方面的各个实施方案亦可以类似地进行任意组合。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
如本文所用的，术语“底物”是指可用蜗牛酶进行酶解的并且含有杠柳毒苷的任何物质，包括，但不限于，杠柳毒苷单体、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮药材、或其组合。
如本发明第二方面所述的，短语“包含杠柳次苷的提取物”，由于其中杠柳次苷的含量非常高，因此其亦可称为“杠柳次苷”或者“杠柳次苷单体”。
本发明人发现，杠柳次苷在香加皮药材中含量甚微，如果从药材中直接分离纯化杠柳次苷，难度较大；相对而言，药材中杠柳毒苷含量较大，以杠柳毒苷为原料，令其糖苷键断裂后，分离、纯化制得杠柳次苷，不失为一种有效的方法。原生苷类化合物转化成次生苷或苷元有以下三种方法：化学降解法、物理降解法和酶解法。化学降解法包括酸水解、碱水解、氧化降解。物理降解法包括紫外线降解、超声波降解、热降解等。本发明人经实验室摸索，发现杠柳次苷的制备采用酶解法效果较好。
默克索引中虽然提到杠柳毒苷酶解制备杠柳次苷，但没有提供杠柳毒苷酶解的具体工艺参数以及其方法所产生的效果。因此本发明人对酶解的工艺进行了详尽的考察，包括酶种的选择、酶解温度、缓冲盐的pH、酶解时间与酶和底物的比例关系、酶解终止剂的选择、杠柳次苷的硅胶柱层析洗脱剂、重结晶所用溶剂等。
本发明人在实验室筛选了包括蜗牛酶以及R.P(1)，R.C(2)，R.S(3)，F.800(4)，Dx(5)，P.xxL(6)，P.x(7)，P5.8(8).，P5(9)，PL150(10)，UXL(11)，UL(12)，188(13)，S02(14)在内的共15种酶和植物乳杆菌(1.555)1种菌，对杠柳毒苷C-3位葡萄糖基的水解能力进行考察，本发明人获得的结果表明，蜗牛酶效率高、成本低，因此本发明选取蜗牛酶。
本发明人发现，在酶解反应中，温度不仅影响反应速度，而且影响酶的活性。当温度过高或过低均会使酶活性降低，从而降低反应速度。因此，酶反应存在一个最适温度。另外，大部分酶的活性受环境pH的影响：pH的改变可以破坏酶空间构象，引起酶活性的丧失；还会影响酶活性中心催化基团的解离，使底物转变成产物的过程受影响；同时pH的改变还影响酶活性中心结合基团和底物的解离状态，使底物不能与其结合，或结合后不能生成产物。因此确定将含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶(1∶1～10∶1w/w)混合，加入pH 3～7的缓冲液，在22℃～54℃下温孵。
本发明人发现，一定浓度的底物与酶结合需要一定的时间，时间过短酶与底物不能充分结合，达不到最佳酶解效果；时间过长酶与底物早已结合充分，再延长时间可能因酶解产物在溶液中不稳定而造成含量的降低。因此确定温孵4h～48h后加入试剂终止酶促反应。
本发明人发现，酶解反应需适宜的终止剂。参照文献[J SunW J，Sha ZF，GaoH.Determination of arctiin and arctigeninin Fructus Arctii byreverse-phase HPLC.Acta Phannaceutica Sinica，1992，27(7)：549.]方法，考察了在酶解后的水液中加二氯甲烷或氯仿提取杠柳次苷，但本发明人发现，酶的存在易产生严重乳化，难以分层。因此，本发明人先用甲醇沉淀蜗牛酶终止反应，并且溶出杠柳次苷，避免在下一步萃取中出现乳化现象。本发明人通过进一步试验确定，适宜酶解终止剂是含醇水溶性有机溶剂(甲醇或乙醇，或用含有甲醇或乙醇的丙酮)，这样不仅避免了使用毒性较大的溶剂二氯甲烷或氯仿，而且还适合直接用高效液相色谱法进行含量和酶解得率的测定。
根据本发明，杠柳毒苷酶解得到的酶解粗提物可用硅胶柱层析得到精制提取物。将酶解粗提物上样后，用体积比为0.5∶1～5∶1的乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，收集合并经TLC检测呈较深紫红色斑点的流份(展开剂为氯仿-甲醇-水65∶35∶10，显色剂3，5-二硝基苯甲酸试液)，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物。此精制提取物也可用类似的方法得到：例如大孔树脂柱层析、反相C18色谱分离、高速逆流色谱分离中的一种或几种方法的组合。采用大孔树脂吸附分离时，酶解粗提物经大孔树脂吸附，用水和20～40％乙醇预洗除杂，95％乙醇洗脱，收集95％洗脱部位，收集合并含有强心苷的部位。采用反相C18色谱分离时，以体积比为(50～70)∶(50～30)的甲醇∶水，或(25～50)∶(75～50)的乙腈∶水为流动相，同步采用紫外检测器于217～220nm监视流出曲线以指导产品收集。采用高速逆流色谱分离时，酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4∶3∶2～5∶4∶3震荡溶解进样，于温度30～40℃进行高速逆流色谱，流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站记录，根据色谱图手动收集各色谱峰组分。以上收集部位经浓缩干燥后得到精制提取物。
本发明人发现，对于杠柳次苷重结晶的溶剂，比较了乙酸乙酯和甲醇。结果发现杠柳次苷粗提物在乙酸乙酯溶液中加热不稳定，大部分会转化成杠柳苷元；在50％甲醇中则会析出白色晶体，这就避免了重结晶过程中加热处理造成成分的变化和损失。经3次50％甲醇结晶和重结晶操作后，杠柳次苷纯度可达94％以上。
本发明确定了使用蜗牛酶从杠柳毒苷制备杠柳次苷的方法。与酸水解等化学方法相比，酶催化水解产物单纯，条件温和，经硅胶柱层析纯化，3次重结晶，可得纯度达90％以上的杠柳次苷。采用本发明所制备的杠柳次苷经UV、IR、13C-NMR、H-NMR、MS分析确认为杠柳次苷，经TLC、HPLC(PDA检测器)监测本品纯度达90％以上。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的杠柳次苷的UV图谱。
图2为本发明实施例1制备的杠柳次苷的IR图谱。
图3为本发明实施例1制备的杠柳次苷的13C-NMR图谱。
图4为本发明实施例1制备的杠柳次苷的一级MS图谱。
图5为本发明实施例1制备的杠柳次苷的二级MS图谱。
图6为本发明实施例1制备的杠柳次苷的TLC图谱。
图7为本发明实施例1制备的杠柳次苷的HPLC(PDA检测器)图谱。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例1
(1)酶解：取香加皮提取物(含10％杠柳毒苷)6.5g，底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶10∶1(w/w)混合，加入pH5.5的醋酸盐缓冲液25mL，38℃下温孵，12h后加甲醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，每次90mL，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物2.3g。
(2)柱层析：称酶解粗提物2.1g，加无水乙醇溶解样品，按粗提物：硅胶1∶2(w/w)的比例加硅胶拌样，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚(2∶1)为洗脱剂，每20mL为一份，收集经TLC检测呈较深紫红色斑点的流份(展开剂为氯仿-甲醇-水65∶35∶10，显色剂3，5-二硝基苯甲酸试液)，合并30～80份，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物0.8g。
(3)重结晶：取精制提取物0.8g，加甲醇使溶解，加水适量，于4℃静置12h以上，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶0.4g。三个步骤的总收率约92.3％。
(4)结构与纯度检测：
对步骤(3)所得白色结晶进行结构确认：
A.紫外UV扫描：在218nm处有最大吸收峰，具有Δα，β五元内酯环的强心苷特征吸收。见图1。
B.红外IR分析：在3600～3200cm-1处有典型的羟基吸收峰，在1782，1741和1631的吸收显示为β-取代-Δα，β-γ-内酯的吸收峰。见图2。
C.核磁NMR分析：NMR δH：0.883H(s)，0.933H(s)，3.303H(s)，4.151H(m)，4.902H(s)，5.901H(s)，说明母核为杠柳苷元。NMR δH：4.82dd，2.20ddd，3.61q，3.2dd，3.44dq，1.22dd，NMR δC：96.79，34.44，77.72，72.94，70.12，17.22，56.73说明有加拿大麻糖的存在。见图3、表1。
D.质谱MS分析：m/z：535.3[M+H]+，552.4[M+NH4]+，391.2[M-C6H8O4]+，373.3[M-C6H8O4-H2O]+，355.3[M-C6H8O4-2H2O]+，337.3[M-C6H8O4-3H2O]+，推算该化合物的分子式为C30H46O8。见图4和5。
经分析确认为杠柳次苷。
(5)对步骤(3)所得白色结晶进行纯度分析：
A.TLC：在高效硅胶板上点样2μg～100μg，氯仿∶甲醇∶水＝13∶3∶2下层展开，用3，5-二硝基苯甲酸/5％NaOH醇液或10％硫酸乙醇显色，只见单一紫红色/黑色斑点。见图6。
B.HPLC(PDA检测器)：用二极管阵列检测器进行60min色谱及200nm～400nm光谱图采集，除溶剂峰外仅见一单峰，用光谱进行该峰峰纯度检查，提示为单一化合物。见图7。
经检测制备的杠柳次苷纯度为98％，并且未检测到杠柳毒苷。
表1所制备杠柳次苷的13C-NMR数据
| 次苷碳数 | 测得值 | 次苷碳数 | 测得值 |
| 1 | 25.15 | 18 | 14.91 |
| 2 | 25.36 | 19 | 15.82 |
| 3 | 75.75 | 20 | 176.92 |
| 4 | 34.39 | 21 | 73.92 |
| 5 | 74.34 | 22 | 116.44 |
| 6 | 34.11 | 23 | 175.80 |
| 7 | 23.35 | cym-1 | 96.79 |
| 8 | 40.42 | cym-2 | 34.44 |
| 9 | 39.49 | cym-3 | 77.72 |
| 10 | 40.26 | cym-4 | 72.94 |
| 11 | 21.29 | cym-5 | 70.12 |
| 12 | 38.78 | cym-6 | 17.22 |
| 13 | 49.48 | OMe | 56.73 |
| 14 | 84.88 | ||
| 15 | 31.95 | ||
| 16 | 26.59 | ||
| 17 | 50.54 |
实施例2
基本上参考实施例1的方法进行制备杠柳次苷，具体地说：
(1)酶解：取杠柳毒苷单体，按底物与蜗牛酶1∶1(w/w)混合，加入pH3的醋酸盐缓冲液，22℃下温孵，4h后加甲醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物。
(2)高速逆流色谱分离：将酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4∶3∶2震荡溶解进样，于温度30℃进行高速逆流色谱，流出物于220nm经紫外检测器检测并由色谱工作站记录，根据色谱图手动收集各色谱峰组分，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物。
(3)重结晶：将精制提取物，加甲醇使溶解，加水适量，静置，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶，经检测纯度含杠柳次苷为94％，并且未检测到杠柳毒苷。三个步骤的总收率约88％。
实施例3
基本上参考实施例1的方法进行制备杠柳次苷，具体地说：
(1)酶解：取香加皮药材(含0.2％杠柳毒苷)，粉碎过80目晒，底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶5∶1(w/w)混合，加入pH4的醋酸盐缓冲液，40℃下温孵，12h后加乙醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物。
(2)反相C18色谱分离：将酶解粗提物，加甲醇超声溶解，再加2倍量水稀释，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪泵入，上样于反相C18色谱柱，先以4倍量的30％甲醇洗脱，弃去30％甲醇洗脱液，后用10倍量的60％甲醇洗脱，215nm紫外检测器监视流出曲线以指导产品收集，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物。
(3)重结晶：将精制提取物，加甲醇使溶解，加水适量，静置，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶，经检测纯度含杠柳次苷为92％，并且未检测到杠柳毒苷。三个步骤的总收率约85％。
实施例4
基本上参考实施例1的方法进行制备杠柳次苷，具体地说：
(1)酶解：取香加皮提取物(含10％杠柳毒苷)，底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶2∶1(w/w)混合，加入pH5的缓冲液，54℃下温孵，48h后加甲醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物。
(2)柱层析：将酶解粗提物，加无水乙醇溶解样品，按粗提物∶硅胶1∶2(w/w)的比例加硅胶拌样，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚(3∶1)为洗脱剂，收集合并经TLC检测呈较深紫红色斑点的流份(展开剂为氯仿-甲醇-水65∶35∶10，显色剂3，5-二硝基苯甲酸试液)，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物。
(3)重结晶：将精制提取物，加甲醇使溶解，加水适量，静置，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶，经检测纯度含杠柳次苷为96％，并且未检测到杠柳毒苷。三个步骤的总收率约90％。
实施例5
基本上参考实施例1的方法进行制备杠柳次苷，具体地说：
(1)酶解：取香加皮提取物(含10％杠柳毒苷)，底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶8∶1(w/w)混合，加入pH7的缓冲液，30℃下温孵，24h后加甲醇终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，浓缩干燥，得酶解粗提物。
(2)柱层析：将酶解粗提物，加无水乙醇溶解样品，按粗提物∶硅胶1∶2(w/w)的比例加硅胶拌样，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚(5∶1)为洗脱剂，收集合并经TLC检测呈较深紫红色斑点的流份(展开剂为氯仿-甲醇-水65∶35∶10，显色剂3，5-二硝基苯甲酸试液)，回收溶剂，减压真空干燥，得精制提取物。
(3)重结晶：将精制提取物，加甲醇使溶解，加水适量，静置，析出白色结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得白色结晶，经检测纯度含杠柳次苷为95％，并且未检测到杠柳毒苷。三个步骤的总收率约88.5％。
Claims (10)
1.一种制备杠柳次苷的方法，其包括以下步骤：
(1)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；
(2)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；
(3)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到杠柳次苷。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于以下(a)至(h)中的任一项或多项：
(a)所述底物可以是杠柳毒苷单体、含有杠柳毒苷的香加皮提取物、含有杠柳毒苷的香加皮药材、或其组合；
(b)所述底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶的重量比为(1～10)∶1；
(c)所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中进行的；
(d)所述酶解反应是在20℃～55℃下进行的；
(e)所述酶解反应是在pH 3～7的缓冲液中、在20℃～55℃下温孵4h～48h来进行的；
(f)所述酶解反应是通过加入酶解终止剂来终止的；
(g)所述酶解反应在被终止之后，还任选包括用有机溶剂进行萃取的步骤；
(h)所述酶解反应在被终止之后，还包括用有机溶剂进行萃取，然后将有机层浓缩和/或干燥的步骤。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述色谱层析是选自以下的色谱层析方法：硅胶柱层析法、大孔树脂柱层析法、反相C18柱色谱分离法、高速逆流色谱法、及其组合。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于以下(a)至(e)中的任一项或多项：
(a)所述色谱层析是使用硅胶柱层析法，并且采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液；
(b)所述色谱层析是使用大孔树脂柱层析法，并且用85～98％乙醇作为洗脱液；
(c)所述色谱层析是使用反相C18柱色谱分离法，并且用(50～70)∶(50～30)的甲醇∶水或者用(25～50)∶(75～50)的乙腈∶水作为流动相；
(d)所述色谱层析是使用高速逆流色谱法，并且酶解粗提物用氯仿-甲醇-水4∶3∶2～5∶4∶3震荡溶解进样，在温度30～40℃下进行高速逆流色谱；
(e)所述步骤(3)的重结晶过程是使步骤(2)的精制提取物溶解于甲醇中，然后加入适量水而进行的。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其包括以下步骤：
(1)酶解：将含有杠柳毒苷的底物(按杠柳毒苷计)与蜗牛酶(1∶1～10∶1w/w)混合，加入pH 3～7的缓冲液，22℃～54℃下温孵，4h～48h后加入试剂终止酶促反应，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层浓缩干燥，得酶解粗提物；
(2)柱层析：将酶解粗提物进行硅胶柱层析，以薄层色谱法监测流份，合并含有杠柳次苷的流份，浓缩干燥，得精制提取物；
(3)重结晶：将精制提取物，用甲醇溶解后加入适量水，静置，析出白色针状结晶，以50％甲醇洗涤结晶，减压干燥，得杠柳次苷。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其特征在于：
步骤(3)所得产物中含有80％(w/w)以上的杠柳次苷，和/或
步骤(3)所得产物中基本上不含杠柳毒苷。
7.一种包含杠柳次苷的提取物，其中以重量百分数计包含80％以上(或者优选85％以上，优选90％以上)的杠柳次苷。
8.根据权利要求7的提取物，其中基本上不含杠柳毒苷。
9.根据权利要求7或8的提取物，其是通过包括以下步骤的制备方法得到的：
(i)使含有杠柳毒苷的底物与蜗牛酶混合，进行酶解反应，得到酶解粗提物；
(ii)使所述酶解粗提物进行色谱层析，得到精制提取物；
(iii)使所述精制提取物从甲醇和水的混合物中重结晶，得到包含杠柳次苷的提取物；进一步地，上述步骤(i)至(iii)各自独立地具有说明书第二方面任一个或多个实施方案所述的特征。
10.一种组合物，其包含杠柳次苷或者权利要求7-9任一项所述的提取物，并且其中基本上不含杠柳毒苷。
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