CN102154105A - 一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，属絮凝剂产生菌技术领域。采用一种选择性的培养方法，即液体培养基不经任何灭菌过程，将絮凝剂产生菌的自然界样品在以无机氮为唯一氮源的选择性液体培养基中富集培养，在温度28～32℃下，经过生物摇床曝气，采用分离培养基对有明显絮凝效果的富集培养液进行分离、纯化，再检验各菌种产絮凝剂能力，得到能够产絮凝剂的菌种。有益效果是，由于是在培养基中仅加入无机的(NH4)2SO4氮，无需高温灭菌，可以通过继代培养，淘汰杂菌，保留有明显絮凝效果的菌群，工作量较少，筛选效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种不经任何灭菌过程，筛选絮凝剂产生菌的方法。具体是一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法。属絮凝剂产生菌技术领域。
背景技术
絮凝剂是一种可以作用于水溶液中的胶体或悬浮颗粒，使之脱稳并产生絮状沉淀物的药剂。絮凝剂被广泛应用于污水处理中，是污水处理中的最重要步骤之一，是必不可少的一部分。例如可以使用絮凝方法来除浊除藻，去除水中各种悬浮物、去除致病微生物、去除重金属等。
絮凝剂按成分主要可分为无机絮凝剂、有机高分子絮凝剂和天然生物高分子絮凝剂，简称生物絮凝剂。微生物絮凝剂(Microbial Flocculants，MBF)即是由微生物产生，可使水体中的胶体或悬浮颗粒脱稳，发生絮凝现象并沉淀的一类物质。
目前已经发现的絮凝剂最多见的成分是多糖和蛋白质。近来还有发现一些糖蛋白、RNA也有絮凝活性等。通常由细菌、真菌、酵母菌等进行发酵培养，然后从发酵液中提取得到。
微生物絮凝剂属第三代生物有机高分子絮凝剂，主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA 等。具有特超强的絮凝性能，可使一些难处理的高浓度废水得到絮凝，且其无二次污染。优良的生产菌种是获得高活性的微生物絮凝剂的前提。优良的生产菌种通常是从不同的环境样品分离、纯化微生物，进一步筛选后获得的。
国外很多学者早就开始对微生物絮凝剂的研究，取得了很多研究成果。最早在1935年，美国的Butterfield就从活性污泥中筛选到了具有明显絮凝活性的微生物。1976年，Nakamura等广泛地从自然界选取了214种菌株中并成功筛选出能够产絮凝剂的菌种19种。1985年，Hiroaki和Kiyoshi从拟青霉属(Paecilomyces sp.)筛选出了能产生具有絮凝活性物质的真菌。1986年，Hejzlar、Chudoba对微生物絮凝剂成分进行了分析，证明糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素及核酸等代谢物均有絮凝活性。2000年，Fujita等从柠檬酸杆菌属(Citrobacter)中筛选得到了一株具有絮凝活性的细菌。
我国的李培睿等从活性污泥中筛选得到14株具有絮凝活性的菌株，并发现混合菌培养液对高岭土悬浊液的絮凝效果更好。湛雪辉，湛含辉从泥土中得到一株絮凝剂产生菌，并证明其产生的絮凝剂是一种含羟基、羧基、甲氧基等基团的生物多糖。李旭筛选得到一种产絮凝剂的细菌，其对一些有毒物质如苯酚等有很强的耐受性。姜彬慧从霉菌中筛选得到了两株絮凝性较强的曲霉，分别是寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和酱油曲霉(Aspergillus sojae)，并证明有很高的热稳定性。盛艳玲通过zeta电位的测定证明了agrobacterium radiobacter菌产生的絮凝剂是以吸附架桥为基础的。邓述波对微生物絮凝剂MBFA9从分子结构上进行了分析，发现其分子量大，含较多羧基，是使其有好絮凝活性的原因。
目前微生物絮凝剂产生菌的筛选常规的方法是先从土壤、活性污泥中分离菌种，得到若干菌种，再进行纯种培养，检验各个菌种的产絮凝剂能力，从中挑选有明显絮凝效果的。由于土壤或活性污泥中菌种非常复杂，通常需要很繁琐的培养筛选过程，并且纯种培养需要培养基的高温灭菌又会消耗很多能量，如果因为各种原因造成染菌，还会导致实验的失败和培养基的浪费，因此需要一种简化并有利于产絮凝剂微生物生长的筛选方法。
发明内容
本发明提供一种筛选产生絮凝剂的微生物的方法，这种方法能够克服筛选培养基需高温灭菌的缺点，可以通过继代培养，淘汰杂菌，保留有明显絮凝效果的菌群，该方法过程简便，目的明确，工作量较少，筛选效率高。
本发明是以如下技术方案实现的：一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，采用一种选择性的培养方法，即液体培养基不经任何灭菌过程，将絮凝剂产生菌的自然界样品在以无机氮为唯一氮源的选择性液体培养基中富集培养，在温度28～32℃下，经过生物摇床曝气，采用分离培养基对有明显絮凝效果的富集培养液进行分离、纯化，再检验各菌种产絮凝剂能力，得到能够产絮凝剂的菌种。
所述的无机氮为(NH4)2SO4。
所述的液体培养基用下述材料和方法配制：将葡萄糖 5~30克、K2HPO4 2~6克、MgSO4·7H2O 0.1~0.3克、NaCl 0.05~0.15克和(NH4)2SO4 0.1~0.3克放入1000ml蒸馏水中，调节pH 7.5~9.0。
所述生物摇床的转速为140～160r/min。
所述的分离培养基用下述材料和方法配制：将葡萄糖 5~30克、K2HPO4 2~6克、MgSO4·7H2O 0.1~0.3克、NaCl 0.05~0.15克、(NH4)2SO4 0.1~0.3克、酵母膏0.2~0.3克和琼脂粉17~18克放入1000ml蒸馏水中，加热煮沸待琼脂粉溶化后，调节pH 7.5~9.0。
所述琼脂粉为纯化琼脂粉，其英文名称：Agar-Agar Powder。
所述能够产絮凝剂的菌种主要包括细菌、酵母菌。
本发明的有益效果是，由于是在培养基中仅加入无机的(NH4)2SO4氮，无需高温灭菌，可以通过继代培养，淘汰杂菌，保留有明显絮凝效果的菌群，工作量较少，筛选效率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行说明，但本发明的权限不受这些实施例所局限。
实施例1：絮凝活性共生菌的筛选
将10mL污水处理厂的活性污泥，加入到装有100ml 液体培养基的三角瓶中，30℃，150rpm摇床培养72h后，按照10％（V/V）接种量转接到相同的新鲜培养基中，继续在相同条件下培养，培养液经离心后测定絮凝率。所用的液体培养基是由葡萄糖 20.0克、K2HPO4 5.0克、MgSO4·7H2O 0.15克、NaCl 0.10克和(NH4)2SO4 0.15克放入1000ml蒸馏水中，调节pH 8.0得到。
得到的絮凝率最高的培养液用无菌水依次制成10-5~10-8稀释菌液，取0.2mL各稀释菌液滴加到凝固好的相同成分的固体培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀，30℃静止培养，选择较大的菌落，重复此过程一次。挑取单个菌落进行划线分离，30℃静置培养48h后，挑取单菌落再次划线分离，连续两次，然后挑取单菌落，“之”字形划入斜面，30℃培养24h后，放入冰箱中4℃冷藏。结果得到多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 和白色球拟酵母(Torulopsis candida)共生产絮凝剂的菌群。
实施例2：絮凝活性芽孢杆菌的筛选
将1g的菜地土壤，加入到装有100ml 液体培养基的三角瓶中，30℃，160rpm摇床培养96h后，按照10ml接种量转接到相同的新鲜培养基中，继续在相同条件下培养，培养液经离心后测定絮凝率。所用的液体培养基是由葡萄糖 25.0克、K2HPO4 4.5克、MgSO4·7H2O 0.20克、NaCl 0.08克和(NH4)2SO4 0.20克放入1000ml蒸馏水中，调节pH 7.5得到。
得到的絮凝率最高的培养液用无菌水依次制成10-5~10-8稀释菌液，取0.2mL各稀释菌液滴加到凝固好的相同成分的固体培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀，30℃静止培养，选择较大的菌落，重复此过程一次。挑取单个菌落进行划线分离，30℃静置培养72h后，挑取单菌落再次划线分离，连续两次，然后挑取单菌落，“之”字形划入斜面，30℃培养48h后，放入冰箱中4℃冷藏。结果得到产絮凝剂细菌，胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。
Claims (7)
1.一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于：采用一种选择性的培养方法，即液体培养基不经任何灭菌过程，将絮凝剂产生菌的自然界样品在以无机氮为唯一氮源的选择性液体培养基中富集培养，在温度28～32℃下，经过生物摇床曝气，采用分离培养基对有明显絮凝效果的富集培养液进行分离、纯化，再检验各菌种产絮凝剂能力，得到能够产絮凝剂的菌种。
2.根据权利要求1所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于所述的无机氮为(NH4)2SO4。
3.根据权利要求1所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于所述的液体培养基用下述材料和方法配制：将葡萄糖 5~30克、K2HPO4 2~6克、MgSO4·7H2O 0.1~0.3克、NaCl 0.05~0.15克和(NH4)2SO4 0.1~0.3克放入1000ml蒸馏水中，调节pH 7.5~9.0。
4.根据权利要求1所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于所述生物摇床的转速为140～160r/min。
5.根据权利要求1所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于所述的分离培养基用下述材料和方法配制：将葡萄糖 5~30克、K2HPO4 2~6克、MgSO4·7H2O 0.1~0.3克、NaCl 0.05~0.15克、(NH4)2SO4 0.1~0.3克、酵母膏0.2~0.3克和琼脂粉17~18克放入1000ml蒸馏水中，加热煮沸待琼脂粉溶化后，调节pH 7.5~9.0。
6.根据权利要求5所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于所述琼脂粉为纯化琼脂粉，其英文名称：Agar-Agar Powder。
7.根据权利要求1所述的一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于能够产絮凝剂的菌种主要包括细菌、酵母菌。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN107043718A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-08-15 | 沃邦环保有限公司 | 一种用于河道治理的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
| CN110182966A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-30 | 王志伟 | 一种生物絮凝剂及其制备方法 |
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