CN102140136A - 玉米脱水应答元件结合蛋白ZmDBP4及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。本发明的脱水应答元件结合蛋白是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。实验证明本发明的ZmDBP4在干旱、高盐、低温和ABA的诱导下表达，并且可以特异的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列：CCGAC)的基因的转录表达。本发明的ZmDBP4为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

玉米脱水应答元件结合蛋白ZmDBP4及其编码基因

技术领域

本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因，特别涉及一种脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。

背景技术

干旱、高盐及高温等逆境胁迫是影响玉米生长、发育的障碍因子。因此，了解玉米对逆境条件的应答与信号传导机制，提高玉米品种的抗逆性，成为玉米遗传研究及玉米品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和高温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有报道，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

DREB(脱水应答元件结合蛋白，DRE-binding protein)类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中 的一个成员。DREB和EREBP类转录因子它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸(Dubouzet JG，Sakuma Y，Ito Y，Kasuga M，Dubouzet EG，Miura S，SekiM，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K，2003)。在DREB相关蛋白中决定DNA结合的特异性方面，V14的作用明显要比E19重要(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet JG，Abe H，Shinozaki K and Yamaguchi-ShinozakiK，2002)；而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特异结合DRE/CRT顺式元件，ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α-螺旋，该α-螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。

目前，在许多植物中都发现这种含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关(刘强，赵南明，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，2000)。刘强等认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达(刘强，赵南明，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，2000)。Kasuga等的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达，转基因植株的抗逆性大大增强(KasugaM，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1999)。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高(Jaglo-Ottosen KR，Gilmour SJ，Zarka DG，Schabenberger O，Thomashow MF.，1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

根据含DNA结合区的数目，AP2/EREBP转录因子分为AP2(APETALA2)和乙烯应答元件结合蛋白EREBP(ethylene-responsive element binding protein)以及RAV三个大类型。AP2型转录因子包括拟南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。这种类型的转录因子含有两个AP2/EREBP结构域，调节细胞的生长发育，在拟南芥中已发现14个AP2型转录因子基因；EREBP型转录因子仅含1个AP2/EREBP结构域，调节植物对激素(乙烯)、病原、低温、干旱及高盐等地分子应答反应。EREBP型转录因子中，已发现有烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥RAV1-2、AtEBP、AtERF1-5、DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B等许多成员，分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关。这些EREBP型转录因子又可以再分为：EREBP(ethylene-responsive element binding protein，即ERF)亚组，包括烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥AtEBP、AtERF1-5、这类转录因子与含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特异结合，因此，它的DNA结合区又称为GCC-盒结合域(GCC-box binding domain，GBD)，其中第2个G、第5个G、第7个C对ERF蛋白的识别有重要作用(Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A，1998)。用核磁共振对其三维空间结构的研究表明，AtERF1的GBD通过形成3个反向的β-片层与其靶序列GCC-盒的大沟相结合；DREBP亚组， 包括拟南芥DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B，这类转录因子在干旱、高盐、低温下特异结合干旱应答元件DRE/CRT，在拟南芥基因组中发现124个DREBP型转录因子基因；RAV型转录因子包括拟南芥RAV1、RAV2、含有两个不同的DNA结合区一ERF/AP2和B3，在拟南芥中已发现6个RAV型转录因子基因。还有一类特殊的转录因子AL079349，它与以上的转录因子都不同，自成一类。

最近发现EREBPs蛋白参与了干旱、高盐和低温胁迫的信号传导和基因表达调控。Mine等人从低温储藏的土豆块茎中分离到了EREBP转录因子CIP353，受低温胁迫诱导强烈表达(Mine T，Hiyoshi T，KasaokaK，Ohyama A，2003)，说明可能有EREBP蛋白参与了受低温胁迫的基因表达调控。Park等利用西红柿为材料，得到了受高盐、乙烯或茉莉酸诱导表达的EREBP转录因子Tsi基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)试验分析发现，Tsi蛋白与GCC-box和DRE/CRT顺式元件都能结合(Park JM，Park CJ，Lee SB，Ham BK，Shin R，Paek KH，2001)，尽管前者结合能力大于后者，但说明，某些EREBP蛋白能激活受渗透胁迫诱导表达的基因。在正常生长条件下，Tsi基因的超量表达提高了转基因植株(35S::Tsi1)的耐盐性、增强了抗病性(Park JM，Park CJ，Lee SB，Ham BK，Shin R，Paek KH，2001)，以上说明了Tsi基因可能参与了生物胁迫和非生物胁迫两条信号传导途径。由高盐胁迫激活的一条类MAPK信号传递模式(包括SIMKK和SIMK)，将胁迫信号传递给EIN2(在乙烯信号传递途径的CTR1下游)(Guo HW and EckerJ，2004)，最后激活某些EREBPs转录因子，调控渗透胁迫相关基因的表达，提高植物的耐盐性。对于是否存在含GCC-box元件，且表达产物直接参与非生物胁迫响应的基因，还有待作进一步的证实。

综合目前的研究结果，植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径：(1)依赖于ABA的信号传递途径有三条：受干旱、高盐诱导，激活MYB、MYC类转录因子基因，调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐、高温诱导，激活ABF/AREB类转录因子基因，调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐诱导，激活CBF4，DREB1类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。(2)不依赖于ABA的信号传递途径有三条：受干旱、高盐诱导，激活DREB2类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因；受低温诱导，激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐或乙烯诱导，激活ERF类转录因子基因，调控具有DRE/CRT或GCC顺式作用元件的靶基因。

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图3所示，将DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(His3、LacZ和URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的脱水应答元件结合蛋白，名称为ZmDBP4，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2的氨基酸残基序列是由232个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第44位-54位氨基酸残基序列为可能的核定位信号区，自氨基端第59位-118位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。

脱水应答元件结合蛋白编码基因，名称为ZmDBP4，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列1中的cDNA序列由1179个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5′端第69位-767位碱基，共编码232个氨基酸(序列表中的序列2)。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增ZmDBP4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

实验证明本发明的ZmDBP4在干旱、高盐、低温的诱导下表达，并且可以特异的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列：CCGAC)的基因的转录表达。本发明的ZmDBP4为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为ZmDBP4与玉米ZmDREB氨基酸序列的同源性比对结果

图2为ZmDBP4受胁迫诱导表达的实时荧光定量PCR图谱

图3为用酵母单杂交系统证明转录因子的体内结合特异性和激活特性原理示意图

图4为实时荧光定量PCR反应条件图

图5为获得ZmDBP4基因编码氨基酸部分的全序列的PCR扩增条件图

具体实施方式

实施例1、ZmDBP4的克隆

一、mRNA的分离

将沙土中生长20天左右的玉米两叶期幼苗进行干旱处理5小时(处理方法：将幼苗小心的取出，注意不要伤根，用干净的吸水纸将叶片及根部的水分吸干，再将幼苗放在干净的吸水纸上，置于阴凉处5小时)，用液氮速冻，-80℃保存备用。

采用Trizol法(TianGen)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)(TaKaRa)。采用SMART法(BD)进行合成ds cDNA：取2μl cDNA进行100μl体系的LD-PCR扩增ds cDNA，循环 数为24，延伸时间为6min。扩增结束后取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳检测。

二、ZmDBP4基因全长序列的获得

通过5’RACE和3’RACE的方法从玉米中获得一个新的脱水应答元件结合蛋白基因核苷酸序列及对应的氨基酸序列，结果得到具有序列表中序列1所示的核苷酸序列的ZmDBP4，其开放阅读框架为自5′端第59位-118位碱基，共编码232个氨基酸(序列表中的序列2)，序列2中的自氨基端第44位-54位氨基酸残基序列和第63位-67位氨基酸残基序列为两个可能的核定位信号区，自氨基端第69位-767位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。同源序列比对结果表明，ZmDBP4与已报道的玉米ZmDREB1A(AAN76804)和玉米的ZmCBF3(AAY33832)的同源性最高，只有74.61％的同源性(如图1所示)，说明ZmDBP4是一个新发现的玉米基因。图1中，黑框表示一致的氨基酸部分。

实施例2、实时荧光定量PCR分析ZmDBP4的表达特性

一、苗龄为20天的玉米幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理：将水培的玉米幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养1小时、2小时、5小时、12小时、24小时、48小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理：将玉米幼苗置于2％的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐溶液中(NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3∶2)中，光照培养1小时、2小时、5小时、12小时、24小时、48小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)冷害处理：将玉米幼苗置于4℃培养箱，光照培养1小时、2小时、5小时、12小时、24小时、48小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)ABA处理：将玉米幼苗置于200μM的ABA溶液中，光照培养1小时、2小时、5小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)对照的处理：直接取未经任何处理的玉米幼苗-80℃冻存作为对照。

二、mRNA的分离

将生长20天的幼苗处理后，，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Quikprep Micro mRNA PurificationKit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

三.反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)将纯化的mRNA反转录为cDNA.

反应体系：

10×RT buffer                2μl

dNTP mix(2.5mM each)         4μl

oligo-dT引物(10)             2μl

RNase inhibitor(10U/)        1μl

Quant reverse transcriptase  1μl

RNase free H2O     5μl

模板RNA            5μl

总体系为20

37℃孵育60min。

四、实时荧光定量PCR

根据已知的ZmDBP4序列，在其可变区设计特异引物。ZmDBP4RTF：5’-GCTACTGAGCTGTAGAGTCTGTC-3’；ZmDBP4RTR：5’-GTGCCAGTGCCAGTACAG-3’

以actin为内参基因。

反应体系：

cDNA                    1μl

2.5×RealMasterMIX      8μl

20×SYBR                1μl

ddH₂O                   10μl

反应条件：图4

ZmDBP4对各个胁迫及激素表现出响应。图2

实施例3、ZmDBP4的激活特性

一、将ZmDBP4基因构建到表达载体YEP-GAP上

1、获得ZmDBP4基因编码氨基酸部分的全序列

根据已克隆的ZmDBP4基因的序列设计引物，引物末端分别加EcoRI和XhoI酶切位点，PCR扩增获得编码氨基酸部分的全序列，程序及体系如下：

引物序列：

ZmDBP4-EI：5’-GGGGAATTCCCACTGCCATCACATGGAGTAC-3’

ZmDBP4-XI：5’-GGGCTCGAGGCTGGAGACAGACTCTACAGCTC-3’

反应体系(50μl)：

模板(60ng/ul)            0.5μl

dNTP(10mM)               1μl

引物(25μM)              1μl

10×buffer               5μl

ddh₂O                    42.1μl

Taq(5U/μl)              0.4μl

扩增条件(PTC-200)：图5

取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描，观察在1.1Kb左右的位置处是否有一条亮带。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化PCR产物(同三、cDNA文库的筛选的探针的回收)。

2、将ZmDBP4基因构建到表达载体YEP-GAP上

将步骤1中纯化的PCR产物和表达载体YEP-GAP(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分别酶切4-6hr，反应体系如下：

10×缓冲液H            5μl

EcoR I(12U/μl)        2μl

XhoI(12U/μl)          2μl

PCR产物/YEP-GAP        20μl

ddH₂O                  21μl

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化酶切产物(同三、cDNA文库的筛选的探针的回收)。

将纯化的酶切PCR产物和酶切载体YEP-GAP连接4-8hr，反应体系如下：

10×Ligase buffer          1μl

酶切PCR产物                4μl

酶切载体YEP-GAP            4μl

T4DNA Ligase               1μl

取0.5μl连接产物，电击转化JM109菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，测序分析序列是否正确，得到含有ZmDBP4基因的重组表达载体YEP-GAP-ZmDBP4。

二、ZmDBP4的体内结合特异性和激活特性的验证

1、酵母报道子的构建

将含有4个DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列：TACCGACAT)分别构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子和pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，分别得到重组载体pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I内切酶分别将pHis-1-DRE和pLacZi-DRE载体切成线状。先将线状pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His/Ura-培养基上，选择获得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子；将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的双重酵母报道子构建方法，再构建一 个含4个MDRE盒的突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)；

(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时至OD600＝0.5±0.1，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；

(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg表达载体YEP-GAP-ZmDBP4、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；

(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；

(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0，15mmol/L3-AT的SD/His/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养步骤1构建的正常双重酵母报道子，另一半培养步骤1构建的突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。

(10)结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His/Ura/Trp的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His/Ura/Trp的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子ZmDBP4能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子(还是Pmin_HIS3启动子或P_CYCI启动子？)，促使报道基因表达。从而证明了ZmDBP4的体内结合特异性和激活功能。

三、药剂配制：

(1)YPD液体培养基

细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)  10g/L

细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)        20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。

(2)SD/His/Ura/Trp选择性培养基

不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)            6.7g/L

营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml

琼脂粉(Bacteriological agar)                         20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

(3)营养缺陷型混合物(Drop-out mix)：(10X)

L-Isoleucine(异亮氨酸)                300mg/L

L-Valine(缬氨酸)                      1500mg/L

L-Adenine(腺嘌呤)                     200mg/L

L-Arginine(精氨酸)                    200mg/L

L-Histidine Hcl monohydrate(组氨酸)   200mg/L

L-Leucine(亮氨酸)                     1000mg/L

L-Lysine Hcl(赖氨酸)                  300mg/L

L-Methionine(甲硫氨酸)                200mg/L

L-Phenylalanine(苯丙氨酸)             500mg/L

L-Threonine(苏氨酸)                   2000mg/L

L-Tyrosine(酪氨酸)                    300mg/L

(4)1×PEG/LiAc：

50％(w/v)PEG5450            8ml

10×TE buffer               1ml

10×LiAc                    1ml

(5)10×TE Buffer：

100mM Tris-Hcl

10mM EDTA，pH＝7.5

121℃高压灭菌，室温保存。

(6)1×TE/LiAc：

10×TE buffer            1ml

10×LiAc                 1ml

ddH₂O                    8ml

(7)Z Buffer：

Na₂HPO₄·7H₂O            16.1g/L

NaH₂PO₄·H₂O             5.5g/L

KCl                        0.75g/L

MgSO₄·7H₂O                0.246g/L

调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

(8)X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：

用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。

(9)含有X-gal的Z buffer缓冲液100ml(Z buffer with X-gal)，注意现用现配：

Z buffer                                 98ml

β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)          0.27ml

X-gal储存液(X-gal stock solution)        1.67ml

Claims (10)

1.一种脱水应答元件结合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述SEQ ID №：2的自氨基端第44位-54位氨基酸残基序列为可能的核定位信号区。

4.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述SEQ ID №：2的自氨基端第59位-118位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。

5.一种脱水应答元件结合蛋白编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中序列1的DNA序列。

7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于：所述基因的开放阅读框架为自5′端第69位-767位碱基。

8.含有权利要求5、6或7所述基因的表达载体。

9.含有权利要求5、6或7所述基因的细胞系。

10.扩增权利要求5、6或7所述基因中的任一片段的引物对。

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