CN102133405B - 脂质体-壳聚糖复合基因载体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质体-壳聚糖复合基因载体的制备方法及应用，包括：将DOTAP稀释液缓慢滴加到同体积的DNA稀释液中，室温保温5-10min；再将分子量范围为50KDa-190Kda、脱乙酰度为75-85％的壳聚糖加入其中并混匀，室温保温20-30min，制得复合基因载体。该载体克服了阳离子脂质体DOTAP转染效率低的问题，具备了更高的转染效率。同时降低了细胞毒性，解决了阳离子脂质体细胞毒性偏大的问题。本发明的新型复合基因载体能缓释基因药物，增加基因的吸收和生物利用度。具备高效、安全、细胞相容性好、使用方便等优点，是一种新型的高效基因载体和转染试剂。
Description
技术领域
本发明属于基因载体的制备方法及应用，具体涉及一种脂质体-壳聚糖复合基因载体的制备方法及其应用。
背景技术
基因治疗是一种通过载体将目的基因传递到靶细胞内进行适度表达以治疗疾病为目的的生物医学治疗方法。基因治疗作为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病，其中，癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。但同时，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主要目标之一是发展安全和高效的基因导入系统。能用于基因转运的载体主要有病毒载体和非病毒载体，虽然病毒载体用于基因的转运具有效率高的优点，但存在免疫原性高、载体的容量小、变异性和致癌性等缺点。近年来，非病毒载体的研究得到了迅速的发展。阳离子类脂已经成为基因转运载体的首选，但仍存在效率低和具有细胞毒性的问题。第一个阳离子类脂是由Felgner在1987年合成的单价DOTMA。由于单价阳离子类脂不能有效压缩核酸，转染效率不高。所以人们又开发了一系列多价阳离子化合物。主要有：(1)阳离子聚合物，如PLL和PEI等，这类聚合物的转染率很高(2)多价阳离子类脂，如罗氏拥有的发明专利DOTAP(专利号：US 4.954.630)，转染效率有所提高。Ten等人合成了一类多价阳离子化合物，这类化合物将多价阳离子结合到类脂或一些亲油基团的结构上，综合了脂质体和阳离子聚合物的优点，不但有较高的转染效率，又具有较好的稳定性。也有研究将阳离子聚合物与脂质体结合在一起使用，如LPD复合体和Oku等人配制的PCL复合体，这类复合体综合了脂质体和阳离子聚合物的某些优点，但稳定性较差。提高转染效率的方法之一是设计合成高效阳离子类脂和修饰一系列阳离子类脂派生物。另一方面要对载体与基因药物相互作用，以及其胞内行为和基因最终如何进入细胞核进行深入研究。
壳聚糖是一种具有良好生物相容性的生物质材料，具有低毒、低免疫原性、易生物降解等特性，其用于体内、外的成功转染均有报道，是一种有良好应用前景的基因药物载体。国内有关于靶向壳聚糖基因载体的研究专利，转染效率有一定程度的提高，但还是不够理想(公开号：CN1884551)。我们经过研究发现壳聚糖对阳离子类脂的基因转移具有协同效应。基于此，发明了一种高效、低毒的新型复合型非病毒基因载体。
主要参考文献
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发明内容
本发明的目的在于提供一种脂质体-壳聚糖复合基因载体的制备方法及应用。本发明是通过以下步骤实现：
①DOTAP的DMEM稀释液与DNA的DMEM稀释液混匀，室温保温5-10min；
②壳聚糖与步骤①的产物混匀，室温保温20-30min，制得脂质体-壳聚糖复合基因载体；
其中，步骤①所述DOTAP与DNA的质量比为3-8∶1；步骤②所述壳聚糖(Chitosan)与DNA的质量比为0.2-32∶1；步骤①所述DOTAP的DMEM稀释液与DNA的DMEM稀释液的体积比为1∶1；步骤②所述壳聚糖的分子量范围为50KDa-190KDa，脱乙酰度为75-85％；复合基因载体的应用，其特征在于作为非病毒基因载体。
根据现有技术，本领域的技术人员熟知如何获得DMEM(哺乳动物细胞培养基)和DOTAP([1-(2，3-二油酰基)]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐)，本发明所用DMEM(10567-014)购自美国GIBCO公司，DOTAP(14545500)购自瑞士Roche公司，DOTAP结构为：
本发明的有益效果是：新型基因复合载体对脂质体(DOTAP)进行了修饰和功能增强，具备压缩核酸的能力，可以形成纳米级的阳离子脂质体-壳聚糖复合物。该载体克服了阳离子脂质体DOTAP转染效率低的问题，具备了更高的转染效率。同时降低了细胞毒性，解决了阳离子脂质体细胞毒性偏大的问题。发明的新型基因复合载体能缓释基因药物，增加基因的吸收和生物利用度。具备高效、安全、细胞相容性好、使用方便等优点，是一种新型的高效基因载体和转染试剂。
附图说明
本发明共有七幅附图，其中：
图1为复合基因载体形态及粒径的原子力显微镜分析(壳聚糖/DNA为16/1、DOTAP/DNA为8/1)；
图2为复合基因载体电泳图谱；
图3为Hep-2细胞DOTAP转染效率；
图4为Hep-2细胞DOTAP/Chitosan复合载体转染效率；
图5为Hela细胞DOTAP转染效率；
图6为Hela细胞DOTAP/Chitosan复合载体转染效率；
图7为细胞毒性实验，在基因转染24h后测定的细胞存活率。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
制备工艺采用55μl复合物体系，96孔板高通量转染程序。壳聚糖与DNA的质量比是1/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中后，室温保温5-10min，加入0.1-1μg(按壳聚糖/DNA＝1/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例2
壳聚糖与DNA的质量比是2/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入0.2-2μg(按壳聚糖/DNA＝2/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例3
壳聚糖与DNA的质量比是3/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入0.3-3μg(按壳聚糖/DNA＝3/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例4
壳聚糖与DNA的质量比是4/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入0.4-4μg(按壳聚糖/DNA＝4/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例5
壳聚糖与DNA的质量比是6/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入0.6-6μg(按壳聚糖/DNA＝6/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例6
壳聚糖与DNA的质量比是8/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入0.8-8μg(按壳聚糖/DNA＝8/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例7
壳聚糖与DNA的质量比是16/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入1.6-16μg(按壳聚糖/DNA＝16/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例8
壳聚糖与DNA的质量比是24/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入2.4-24μg(按壳聚糖/DNA＝24/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例9
壳聚糖与DNA的质量比是32/1，96孔板每孔0.1-1μg DNA计算的配制方法：将0.1-1μg DNA用DMEM稀释至25μl，0.3-8μg DOTAP(按DOTAP/DNA＝3-8/1的质量比)用DMEM稀释至25μl，将二者轻轻混合(脂质体稀释液加到质粒稀释液中)后，室温保温5-10min，加入3.2-32μg(按壳聚糖/DNA＝32/1)壳聚糖，用DMEM稀释到5μl，轻轻混匀，室温保温20-30min。即制得脂质体-壳聚糖复合基因载体。
实施例10测定与实验
1、复合基因载体形态及粒径的观察
采用Veeco Dimension3100原子力显微镜控制系统进行复合基因载体形态和粒径的测定。在室温下利用轻敲模式(Tapping Mode)，扫描速度为2HZ，作用力为10-11N-10-8N，用硅尖Si3N4(Veecco Model RTESP14)扫描样品。参见图1所示，原子力显微镜(AFM)在壳聚糖/DNA为16/1、DOTAP/DNA为8/1的条件下，粒径形态及分布。复合物形态基本呈压扁的球形，个别有复合物聚集态存在。复合物粒径在60-540nm之间，粒径范围在有效的粒径转染(＜1μm)范围之内。
2、复合载体压缩核酸能力
使用DNA延滞实验检测转染试剂结合DNA的能力，如图2所示。凝胶延滞实验第1泳道为marker，2泳道为裸DNA，3泳道为DOTAP，4-12泳道分别为添加壳聚糖的三元复合物，壳聚糖与DNA的比例分别是1/1、2/1、3/1、4/1、6/1、8/1、16/1、24/1、32/1。在未加转染试剂的情况下(裸DNA)，出现典型的质粒条带。DOTAP与DNA的质量比为3/1-8/1时(3泳道比例是8/1)，DNA移出原点。当添加壳聚糖后，DNA延滞能力明显增强。当添加壳聚糖与DNA比例为16时，DNA被完全结合，在电场中停止泳动。
3、体外细胞转染效率测定
使用Hep-2，Hela等哺乳动物细胞验证DOTAP-壳聚糖复合载体的运载基因能力。转染前，细胞铺板密度为0.5-2×104每孔，细胞用无血清、无双抗的培养液(1640或DMEM)于37℃培养18h，细胞汇合度达到70-90％。先用PBS然后用不含FBS和P/S的DMEM培养液冲洗细胞，然后每孔用100μl无血清无双抗的DMEM再洗一遍，每孔加入50μl复合物后96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4-5小时。培养液换成含血清和双抗培养液继续培养24-48h后，用倒置荧光显微镜检测核酸的表达效果。图3-4示Hep-2细胞使用该细胞运载绿色荧光蛋白报告基因质粒的表达效果图。图5-6示Hela细胞使用该细胞运载绿色荧光蛋白报告基因质粒的表达效果图。两种非病毒载体DOTAP，DOTAP-壳聚糖复合载体负载pGFP-N2质粒转染Hep-2细胞48h，转染效率分别为(15±2.9)％(图3)，(90±1.4)％(图4)，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。另外，两种非病毒载体DOTAP，DOTAP-壳聚糖复合载体负载pGFP-N2质粒转染Hela细胞48h，转染效率分别为(19±3.4)％(图5)，(96±1.4)％(图6)，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。显然，对于Hep-2和Hela细胞，新型复合载体与商品试剂DOTAP相比，具备明显的高转染效率，超过DOTAP 75％，克服了阳离子脂质体转染效率低的问题。
4、毒性分析(MTT法)
细胞毒性实验在基因转染24h后，采用四甲基偶氮唑盐法测定了细胞存活率。由于通过基因转染实验，在最佳比例下，DOTAP和DOTAP/Chitosan复合体的细胞存活率分别为(78±2)％和(93±2)％，见图7。
Claims (1)
1.一种脂质体-壳聚糖复合基因载体的制备方法，包括：
①DOTAP的DMEM稀释液与DNA的DMEM稀释液混匀，室温保温5-10min；
②壳聚糖与步骤①的产物混匀，室温保温20-30min，制得脂质体-壳聚糖复合基因载体；
步骤①所述DOTAP与DNA的质量比为3-8：1,所述DOTAP的DMEM稀释液与DNA的DMEM稀释液的体积比为1:1;
步骤②所述壳聚糖与步骤①所述DNA的质量比为0.2-32：1,所述壳聚糖的分子量范围为50KDa-190KDa，脱乙酰度为75-85%。
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