CN102128915A - 利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法，属于土壤污染监测与控制技术领域。该方法以人工养殖蚯蚓为标准试验动物，以氧自由基、丙二醛含量、蛋白质羰基含量以及还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例4种氧化损伤测试指标为诊断土壤污染的生物标志物，以清洁人工土壤为标准土壤，通过分析清洁人工土壤和供试土壤培养一定时间后蚯蚓体内4种氧化损伤指标的差异，可快速灵敏地诊断供试土壤污染状况。本发明可用于全面诊断土壤污染状况和健康程度，该方法对土壤中的痕量污染物有很好的敏感性，可作为土壤污染早期预警的监测方法。与化学分析方法相对，本发明具有操作简单，成本低廉的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种土壤污染监测的方法，具体说是土壤污染状况的蚯蚓生物标志物诊断方法，即利用蚯蚓体内的氧化损伤指标监测土壤污染状况，包括重金属污染和有机物污染等。
背景技术
近年来，随着工农业生产的迅速发展，大量污染物通过多种途径进入土壤环境中并共存，我国面临的土壤污染呈日益加剧趋势。土壤是环境的重要组成部分，同时也是各种污染物质的最终载体，承担着环境中大约90%来自各方面的污染物质，当外来的污染物超过土壤的自净能力时，就会破坏土壤的正常机能，使之失去自然生态平衡，成为我们生活中的化学定时炸弹，从而严重影响农产品产量和品质。污染土壤的污染物的种类繁多，既有无机污染物，同时存在无机污染物。这些污染物主要来自工业三废和农药、化肥的大量使用，它们可通过灌溉水进入土壤，也可通过大气污染、空中的颗粒物(含重金属和致癌物质等)沉降造成。
这些污染物不是以单一形式存在土壤环境中，而是同时存在，构成复合污染，使土壤的污染问题更加严重和复杂。采用化学分析方法仅能检测土壤中某些部分污染物含量，但无法全面评价土壤健康程度和污染状况，目前普遍采用生物监测方法来评价土壤总体健康程度和污染状况。
蚯蚓作为一种古老的生物在自然界已经存在6亿年之久，是土壤中生物量最大的动物类群之一，是土壤系统中重要的组成部分，其挖掘和饮食活动有助于显著增加水分渗入，土壤通气性，土壤团粒结构的稳定。此外，蚯蚓通过形成了有机质有助于增加表层土壤肥力。这些使蚯蚓成为很好的表征土壤污染的指示生物。蚯蚓的生理代谢及生命活动在一定程度上反映了土壤的生态功能，因此可以应用生物标志物来评价土壤生态功能并判定土壤污染状况和环境质量，某些生物标志物还可对复合污染的效应做出客观的判断，这是化学检测方法通常难以做到的。蚯蚓已被广泛应用于土壤污染的环境评估，是标准毒理实验的典型生物。蚯蚓生物标志物可以作为早期预警系统或污染危害的准确测量的有效工具。
近年来，细胞或分子水平上的生物标志物作为污染物暴露和毒性效应的早期响应指标在生态毒理学研究中越来越受重视，其中活性氧及抗氧化防御系统各种组分就是广受关注的一类重要指标。许多研究表明，通过诱导产生活性氧，引起生物体氧化损伤是污染物致毒的重要路径之一。蚯蚓在受到活性氧自由基的攻击后，抗氧化防御系统会激发相关的抗氧化酶进行保护防御，但是在大量自由基的攻击下，机体将会产生一些损伤，例如产生脂质过氧化、蛋白质产生氧化损伤等。在土壤污染生态毒理学研究领域，生物体抗氧化防御系统响应变化已开始广泛应用于评价污染土壤健康和污染状况，是土壤污染生态毒理诊断的一项重要指标。 但对于如何将与蚯蚓相关的这些指标系统的用与诊断土壤污染状况仍是没有相关文献给出说明。
发明内容
1. 发明要解决的技术问题
针对现有环境土壤中的污染物种类繁多，化学分析方法只能对有限的污染物进行分析监测，无法全面评价土壤健康程度和污染状况，本发明提供一种利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法，采用蚯蚓的氧化损伤生物标志物作为评价指标，可对土壤总体健康程度和污染状况进行监测与全面综合评价。
2. 技术方案
本发明的原理是利用土壤污染物可诱导蚯蚓体内产生氧自由基，造成氧自由基(ROS）、丙二醛含量（MDA）、蛋白质羰基含量（PCO）和还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）发生变化，蚯蚓机体在受到氧化损伤时的指标丙二醛MDA和羰基含量PCO间接反应土壤污染物浓度，可以作为土壤污染生态的生物标志物。生物体的活性氧代谢及抗氧化防御系统的变化对污染物胁迫的响应相当敏感，可为污染物暴露和毒性效应提供敏感信息。这4种氧化损伤指标变化程度可间接反映出土壤污染状况和健康程度。
本发明的技术方案为：
利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法，其步骤为：
(a)称取200g-500g的人工标准土壤和供试土壤,分别放置不同容器中,水份含量保持在30-50%；
(b)在人工标准土壤和供试土壤中分别投入10-30条健康成年且已清肠24小时的人工养殖蚯蚓，在20-25℃条件下培养3-20天；
(c)从土壤分离出蚯蚓，放入装有湿滤纸的培养皿中清肠12-24小时，然后分别测定蚯蚓体内氧自由基(ROS）、丙二醛含量（MDA）、蛋白质羰基含量（PCO）和还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例（GSH/GSSG）；
(d)通过比较人工标准土壤组和供试土壤组蚯蚓体内氧自由基(ROS）、丙二醛含量（MDA）、蛋白质羰基含量（PCO）和还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例（GSH/GSSG）的差异，对供试土壤污染状况进行诊断。
步骤（a）中的人工标准土壤是OECD人工土壤（2007），具体配方为：工业石英砂69%(含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒)，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%，混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH为6.5。
步骤（b）中人工养殖蚯蚓方法为：以人工土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪（符合生物有机肥料行业标准NY884-2004）为蚯蚓食物，20-25℃养殖；蚯蚓品种为赤子爱胜蚓（Esisenia fetida），安德爱胜蚓（Eisenia andrei）、参环毛蚓（Pheretima aspergillum）等。
步骤（c）中4种氧化损伤指标的检测方法为：
（1） 氧自由基(ROS）：蚯蚓用冰冷的生理盐水冲洗后，迅速称量0.1 g置于玻璃匀浆器内，加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）为溶剂配制的浓度为50 mM 的PBN溶液（加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号）。冰浴条件下匀浆后，将匀浆液密封好，在4℃条件5000rmp离心5min，取上层液400 mL 注入直径为3 mm石英管中，迅速放入液氮中保存。样品在电子顺磁共振仪（EPR）上测定。整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭操作箱中进行，并避免水分沾入。电子顺磁共振仪（EPR）操作参数：测试温度(TE)室温, 微波功率(SP)20mW，微波频率(SF)9.751GHz，调制频率(MF)100KHz，调制幅度(MA)0.5G，中心磁场(CF)3470G，扫场时间(TI)84s，时间常数(TC)41ms，扫场宽度(SW)200G，信号为5次叠加。
（2） 丙二醛含量（MDA）：取蚯蚓组织匀浆液200 μL，按如下顺序依次加入8.1% SDS，0.2 mL 20%醋酸缓冲液( pH 3.5) 1.5 mL，1% TBA 1.5 mL，蒸馏水1 mL。将上述反应液于90°C水浴60 min，冷却后，3000 r/min 离心15 min，取上清液在532 nm处测OD值，脂质过氧化产物MDA以每毫克蛋白中含TBARS的量即TBARS nmol/mg 表示，摩尔消光系数e=1.56×105/（mol·L-1·cm）。
（3） 蛋白质羰基含量（PCO）：用50 mM磷酸钾（pH 7.4）缓冲液（内含1 mM Na2EDTA，0.1% Triton X-100 (w/v)，1 mM PMSF，5 mg/L leupeptin）提取蚯蚓的粗蛋白液，用1% (w/v)链霉素溶液沉淀可能存在的核酸，取0.8 mL提取液与0.2 mL 20 mM二硝基苯肼反应1小时。然后，用0.6 M 三氯乙酸沉淀蛋白，用乙醇/乙酸乙酯(1:1,v/v) 洗涤沉淀，用6 M盐酸胍(pH 2.3)溶解沉淀，在370 nm下测定吸光度。根据牛血清白蛋白的标准曲线(0.25-2.0 mg/mL，溶解于6 M盐酸胍)计算最终的蛋白含量，应用消光系数22,000 M-1cm-1计算羰基基团的含量。
（4） 原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）：GSH含量测定：取100 μL新鲜制备的蚯蚓组织上清液，加入2.8 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)及100 μL邻苯二甲醛(OPT)的乙醇溶液(1 mg·mL-1)，充分混合。在室温下放置10 min后以350 nm为激发光(Ex)，430 nm测荧光强度。标准管(100 μL，内含4 μgGSH)和空白管(100 μLH2O)均须经过上述操作。GSSG含量测定:500 μL酶液与200 μL 0.04 M N-乙酰顺丁烯二酰亚胺（NEMI）溶液混匀，室温放置20分钟后，取100 μL加入2.8 mL 0.1 M NaOH及100 μL(1 mg/mL)OPT 荧光试剂，充分混合，然后在室温下放置10 min后以350 nm为激发光(Ex)，430 nm测荧光强度。最后计算原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）。
步骤（d）中采用t检验法对数据进行方差分析。当供试土壤的4种氧化损伤指标中有任一项与人工标准土壤有极显著差异（p＜0.01）时，可初步判断供试土壤受到污染。供试土壤的指标数值与人工标准土壤差异越大，表明土壤污染状况越严重。
3．有益效果
本发明提供了利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法，可用于全面诊断土壤污染状况和健康程度的方法。该方法对土壤中的痕量污染物有很好的敏感性，可作为土壤污染早期预警的监测方法。与化学分析方法相对，本发明提供的方法可全面监测土壤污染状况，同时具有操作简单，成本低廉的特点。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明
实施例1：
分别称取200g的人工标准土壤和供试土壤, 人工标准土壤的配方按按重量百分比为：工业石英砂69%(含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒)，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%，混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH为6.5。分别以人工标准土壤和供试土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪（符合生物有机肥料行业标准NY884-2004）为蚯蚓食物，土壤水分含量保持在重量百分比35%；然后分别投入10条健康成年且清肠24小时后的赤子爱胜蚓（Esisenia fetida），在25℃条件下培养5天。
蚯蚓放入装有湿滤纸的培养皿清肠24小时，然后测定蚯蚓的氧自由基(ROS）含量。具体为：蚯蚓用冰冷的生理盐水冲洗后，迅速称量0.1 g置于玻璃匀浆器内，加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）为溶剂配制的浓度为50 mM 的PBN溶液（加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号）。冰浴条件下匀浆后，将匀浆液密封好，在4℃条件5000rmp离心5min，取上层液400 mL 注入直径为3 mm石英管中，迅速放入液氮中保存。样品在电子顺磁共振仪（EPR）上测定。整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭操作箱中进行，并避免水分沾入。电子顺磁共振仪（EPR）操作参数：测试温度(TE)室温, 微波功率(SP)20mW，微波频率(SF)9.751GHz，调制频率(MF)100KHz，调制幅度(MA)0.5G，中心磁场(CF)3470G，扫场时间(TI)84s，时间常数(TC)41ms，扫场宽度(SW)200G，信号为5次叠加。
分别测得数据如下：
标准土壤组：2286，2396，2189，2462，2269，2508，2063，2485，2369
供试土壤组：5237，4667，4896，5307，4860，4966，5365，5603，5031
采用t检验法对标准土壤组和供试土壤组数据进行方差分析发现，供试土壤组蚯蚓的氧自由基(ROS）含量要极显著高于标准土壤组（p＜0.01），可初步判断供试土壤受到污染。
实施例2：
基本步骤同实施例1。分别称取300g的人工标准土壤和供试土壤, 人工标准土壤的配方按按重量百分比为：工业石英砂69%(含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒)，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%，混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH为6.5。分别以人工标准土壤和供试土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪（符合生物有机肥料行业标准NY884-2004）为蚯蚓食物，土壤水分含量保持在重量百分比30%；然后分别投入10条健康成年且清肠24小时后的安德爱胜蚓（Eisenia andrei），在25℃条件下培养7天。
蚯蚓放入装有湿滤纸的培养皿清肠24小时，然后测定蚯蚓的丙二醛含量（MDA）。具体为：取蚯蚓组织匀浆液200 μL，按如下顺序依次加入8.1% SDS，0.2 mL 20%醋酸缓冲液( pH 3.5) 1.5 mL，1% TBA 1.5 mL，蒸馏水1 mL。将上述反应液于90°C水浴60 min，冷却后，3000 r/min 离心15 min，取上清液在532 nm处测OD值，脂质过氧化产物MDA以每毫克蛋白中含TBARS的量即TBARS nmol/mg 表示，摩尔消光系数e=1.56×105/（mol·L-1·cm）。
分别测得数据如下(单位:μmol/mg Pr)：
标准土壤组：1.1，1.3，0.9，1.2，0.9，0.8，1.4，1.1，1.0
供试土壤组：2.6，2.3，2.8，2.1，2.7，2.9，3.1，2.6，2.5
采用t检验法对标准土壤组和供试土壤组数据进行方差分析发现，供试土壤组蚯蚓的丙二醛含量（MDA）要极显著高于标准土壤组（p＜0.01），可初步判断供试土壤受到污染。
实施例3：
基本步骤同实施例1。分别称取500g的人工标准土壤和供试土壤, 人工标准土壤的配方按按重量百分比为：工业石英砂69%(含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒)，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%，混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH为6.5。分别以人工标准土壤和供试土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪（符合生物有机肥料行业标准NY884-2004）为蚯蚓食物，土壤水分含量保持在重量百分比30%；然后分别投入20条健康成年且清肠24小时后的参环毛蚓（Pheretima aspergillum），在25℃条件下培养7天。
蚯蚓放入装有湿滤纸的培养皿清肠24小时，然后测定蚯蚓的蛋白质羰基含量（PCO）。具体为：用50 mM磷酸钾（pH 7.4）缓冲液（内含1 mM Na2EDTA，0.1% Triton X-100 (w/v)，1 mM PMSF，5 mg/L leupeptin）提取蚯蚓的粗蛋白液，用1% (w/v)链霉素溶液沉淀可能存在的核酸，取0.8 mL提取液与0.2 mL 20 mM二硝基苯肼反应1小时。然后，用0.6 M 三氯乙酸沉淀蛋白，用乙醇/乙酸乙酯(1:1,v/v) 洗涤沉淀，用6 M盐酸胍(pH 2.3)溶解沉淀，在370 nm下测定吸光度。根据牛血清白蛋白的标准曲线(0.25-2.0 mg/mL，溶解于6 M盐酸胍)计算最终的蛋白含量，应用消光系数22,000 M-1cm-1计算羰基基团的含量。
分别测得数据如下(单位:nmol/mg Pr)：
标准土壤组：16.9，18.6，17.0，15.3，19.1，20.3，18.5，17.9，18.3
供试土壤组：20.6，18.9，15.8，18.9，21.1，15.5，18.0，19.2，17.7
采用t检验法对标准土壤组和供试土壤组数据进行方差分析发现，供试土壤组蚯蚓蛋白质羰基含量（PCO）与标准土壤组无显著差别，可初步判断供试土壤的健康状况良好。
实施例4：
基本步骤同实施例1。分别称取500g的人工标准土壤和供试土壤, 人工标准土壤的配方按按重量百分比为：工业石英砂69%(含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒)，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%，混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH为6.5。分别以人工标准土壤和供试土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪（符合生物有机肥料行业标准NY884-2004）为蚯蚓食物，土壤水分含量保持在重量百分比30%；然后分别投入20条健康成年且清肠24小时后的参环毛蚓（Pheretima aspergillum），在25℃条件下培养7天。
蚯蚓放入装有湿滤纸的培养皿清肠24小时，然后测定蚯蚓的原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）。具体为：原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）：GSH含量测定：取100 μL新鲜制备的蚯蚓组织上清液，加入2.8 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)及100 μL邻苯二甲醛(OPT)的乙醇溶液(1 mg·mL-1)，充分混合。在室温下放置10 min后以350 nm为激发光(Ex)，430 nm测荧光强度。标准管(100 μL，内含4 μgGSH)和空白管(100 μLH2O)均须经过上述操作。GSSG含量测定:500 μL酶液与200 μL 0.04 M N-乙酰顺丁烯二酰亚胺（NEMI）溶液混匀，室温放置20分钟后，取100 μL加入2.8 mL 0.1 M NaOH及100 μL(1 mg/mL)OPT 荧光试剂，充分混合，然后在室温下放置10 min后以350 nm为激发光(Ex)，430 nm测荧光强度。最后计算原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）。
分别测得数据如下：
标准土壤组：2.3，2.6，2.4，2.6，2.5，2.2，2.5，2.6，2.1
供试土壤组：2.4，2.6，2.0，2.5，2.2，2.4，2.3，2.5，2.3
采用t检验法对标准土壤组和供试土壤组数据进行方差分析发现，供试土壤组蚯蚓原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）与标准土壤组无显著差别，可初步判断供试土壤的健康状况良好。
Claims (5)
1.一种利用蚯蚓生物标志物诊断土壤污染状况的方法，其步骤包括：
（a）称取200g-500g的人工标准土壤和供试土壤,分别放置不同容器中,水份含量保持重量百分比为30-50%；
（b）在人工标准土壤和供试土壤中分别投入10-30条健康成年的人工养殖蚯蚓，在20-25℃条件下培养3-20天；
（c）从土壤分离出蚯蚓，放入装有湿滤纸的培养皿中清肠12-24小时，然后分别测定蚯蚓体内羟自由基、丙二醛含量、蛋白质羰基含量和还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例；
（d）通过比较人工标准土壤和供试土壤培养的蚯蚓体内羟自由基、丙二醛含量、蛋白质羰基含量或还原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比例之间的差异，对供试土壤污染状况进行诊断。
2.根据权利要求1所述的诊断土壤污染状况的方法，其特征在于步骤（a）中人工标准土壤是OECD人工土壤按重量百分比具体为：工业石英砂69%，其中含50%以上0.05-0.2 mm细小颗粒，高岭土20%，苔藓土10%，CaCO3 1%；以上混匀，以1 M的NaOH调节土壤pH值为6.5。
3.根据权利要求2所述的诊断土壤污染状况的方法，其特征在于步骤（b）中人工养殖蚯蚓方法的主要特征为：以人工土壤为培养介质，用清洁牛粪或猪粪为蚯蚓食物，在20-25℃养殖；蚯蚓品种可为赤子爱胜蚓Esisenia fetida、安德爱胜蚓Eisenia andrei或参环毛蚓Pheretima aspergillum。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的诊断土壤污染状况的方法，其特征在于步骤（c）中4种氧化损伤指标的检测方法为：
(1)氧自由基ROS：蚯蚓用冰冷的生理盐水冲洗后，迅速称量0.1 g置于玻璃匀浆
器内，加入1 mL二甲基亚砜DMSO为溶剂配制的浓度为50 mM 的PBN溶液，加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号；冰浴条件下匀浆后，将匀浆液密封好，在4℃条件5000rmp离心5min，取上层液400 mL 注入直径为3 mm石英管中，迅速放入液氮中保存；样品在电子顺磁共振仪EPR上测定；整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭操作箱中进行，并避免水分沾入；电子顺磁共振仪EPR操作参数：测试温度TE：室温, 微波功率SP：20mW，微波频率SF：9.751GHz，调制频率MF：100KHz，调制幅度MA：0.5G，中心磁场CF：3470G，扫场时间TI：84s，时间常数TC：41ms，扫场宽度(SW)200G，信号为5次叠加；
(2)丙二醛含量MDA：取蚯蚓组织匀浆液200 μL，按如下顺序依次加入8.1% SDS， 0.2 mL 20%醋酸缓冲液( pH 3.5) 1.5 mL，1% TBA 1.5 mL，蒸馏水1 mL；将上述反应液于90°C水浴60 min，冷却后，3000 r/min 离心15 min，取上清液在532 nm处测OD值，脂质过氧化产物MDA以每毫克蛋白中含TBARS的量即TBARS nmol/mg 表示，摩尔消光系数e=1.56×105/（mol·L-1·cm）；
(3)蛋白质羰基含量PCO：用50 mM pH为7.4的磷酸钾缓冲液，该缓冲液内含1 mMNa2EDTA，0.1% Triton X-100 (w/v)，1 mM PMSF，5 mg/L leupeptin，提取蚯蚓的粗蛋白液，用1% (w/v)链霉素溶液沉淀可能存在的核酸，取0.8 mL提取液与0.2 mL 20 mM二硝基苯肼反应1小时；然后，用0.6 M 三氯乙酸沉淀蛋白，用乙醇/乙酸乙酯(1:1,v/v) 洗涤沉淀，用6 M pH为2.3的盐酸胍溶解沉淀，在370 nm下测定吸光度；根据牛血清白蛋白的标准曲线，以0.25-2.0 mg/mL，溶解于6 M盐酸胍，计算最终的蛋白含量，应用消光系数22,000 M-1cm-1计算羰基基团的含量；
(4)原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值GSH/GSSG：GSH含量测定：取100 μL新鲜制备的蚯蚓组织上清液，加入2.8 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)及100 μL邻苯二甲醛OPT的乙醇溶液(1 mg·mL-1)，充分混合；在室温下放置10 min后以350 nm为激发光Ex，430 nm测荧光强度；标准管100 μL，内含4 μgGSH和空白管100 μLH2O均须经过上述操作；GSSG含量测定:500 μL酶液与200 μL 0.04 M N-乙酰顺丁烯二酰亚胺NEMI溶液混匀，室温放置20分钟后，取100 μL加入2.8 mL 0.1 M NaOH及100 μL(1 mg/mL)OPT 荧光试剂，充分混合，然后在室温下放置10 min后以350 nm为激发光(Ex)，430 nm测荧光强度；最后计算原型谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽比值。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的诊断土壤污染状况的方法，其特征在于步骤（d）中采用t检验法对人工标准土壤和供试土壤的两组数据进行方差分析，当供试土壤的4种氧化损伤指标中有任一项与人工标准土壤有极显著差异（p＜0.01）时，可初步判断供试土壤受到污染；供试土壤的指标数值与人工标准土壤差异越大，表明土壤污染状况越严重。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102495197A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 利用跳虫急性毒性辅助鉴定土壤污染的方法 |
| CN102495198A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 利用跳虫繁殖辅助鉴定土壤污染的方法 |
| CN105223334A (zh) * | 2014-07-04 | 2016-01-06 | 中国环境科学研究院 | 污染场地的土壤生态毒性诊断方法及装置 |
| CN106769918A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-05-31 | 衢州学院 | 多溴联苯醚和重金属污染下苔藓生理生化的测定方法 |
| CN108344851A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-07-31 | 中冶华天工程技术有限公司 | 一种土壤重金属污染物的生物监测方法 |
| CN109804249A (zh) * | 2017-06-14 | 2019-05-24 | 清滔制药株式会社 | 用于测定人体体液氧化应激的方法 |
| CN110018288A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-07-16 | 云南大学 | 一种赤子爱胜蚓快速检测土壤中乙草胺的方法 |
| CN110257559A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-09-20 | 湖南省动物疫病预防控制中心 | 一种检测猪场土壤中是否携带非洲猪瘟病毒的方法 |
| CN111272894A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-06-12 | 山西大学 | 一种地龙1h nmr指纹图谱的构建方法与应用 |
| CN113984822A (zh) * | 2021-09-26 | 2022-01-28 | 牡丹江友搏药业有限责任公司 | 一种基于核磁共振技术的疏血通注射液质量控制方法及应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036963A2 (de) * | 1999-11-18 | 2001-05-25 | Gsf-Forschungszentrum Fur Umwelt Und Gesundheit Gmbh | Verfahren zum nachweis von schadstoffen unter verwendung pflanzlicher zellsuspensionen |
| JP2003154382A (ja) * | 2001-11-26 | 2003-05-27 | Canon Inc | グルタチオンによる有機化合物で汚染された環境または媒体の微生物による修復の効率化方法 |
| CN1645149A (zh) * | 2005-01-14 | 2005-07-27 | 华中师范大学 | 蛋白质羰基含量检测试剂盒 |
| CN1853508A (zh) * | 2005-04-19 | 2006-11-01 | 韩国养药多股份有限公司 | 有效改善肝功能、降低血液酒精浓度及加强抗氧化能力的组合物 |
| WO2008009292A1 (en) * | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Kobenhavns Universitet | An in vitro method for detection of inflammatory contaminants |
| CN101638634A (zh) * | 2009-09-03 | 2010-02-03 | 南京大学 | 一种提取蚯蚓体腔细胞的溶液及超声方法 |
| CN101639454A (zh) * | 2009-09-03 | 2010-02-03 | 南京大学 | 一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法 |
-
2010
- 2010-12-02 CN CN201010568542.0A patent/CN102128915B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036963A2 (de) * | 1999-11-18 | 2001-05-25 | Gsf-Forschungszentrum Fur Umwelt Und Gesundheit Gmbh | Verfahren zum nachweis von schadstoffen unter verwendung pflanzlicher zellsuspensionen |
| JP2003154382A (ja) * | 2001-11-26 | 2003-05-27 | Canon Inc | グルタチオンによる有機化合物で汚染された環境または媒体の微生物による修復の効率化方法 |
| CN1645149A (zh) * | 2005-01-14 | 2005-07-27 | 华中师范大学 | 蛋白质羰基含量检测试剂盒 |
| CN1853508A (zh) * | 2005-04-19 | 2006-11-01 | 韩国养药多股份有限公司 | 有效改善肝功能、降低血液酒精浓度及加强抗氧化能力的组合物 |
| WO2008009292A1 (en) * | 2006-07-18 | 2008-01-24 | Kobenhavns Universitet | An in vitro method for detection of inflammatory contaminants |
| CN101638634A (zh) * | 2009-09-03 | 2010-02-03 | 南京大学 | 一种提取蚯蚓体腔细胞的溶液及超声方法 |
| CN101639454A (zh) * | 2009-09-03 | 2010-02-03 | 南京大学 | 一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 卜元卿等: "赤子爱胜蚓谷胱甘肽和丙二醛含量变化指示重金属污染土壤的生态毒性", 《土壤学报》, vol. 45, no. 4, 15 July 2008 (2008-07-15), pages 616 - 621 * |
| 王秋林等: "血浆中游离还原型及氧化型谷胱甘肽的荧光测定法", 《光谱学与光谱分析》, vol. 25, no. 11, 30 November 2005 (2005-11-30), pages 1834 - 1838 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102495197A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 利用跳虫急性毒性辅助鉴定土壤污染的方法 |
| CN102495198A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 利用跳虫繁殖辅助鉴定土壤污染的方法 |
| CN105223334A (zh) * | 2014-07-04 | 2016-01-06 | 中国环境科学研究院 | 污染场地的土壤生态毒性诊断方法及装置 |
| CN105223334B (zh) * | 2014-07-04 | 2017-05-17 | 中国环境科学研究院 | 污染场地的土壤生态毒性诊断方法及装置 |
| CN106769918A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-05-31 | 衢州学院 | 多溴联苯醚和重金属污染下苔藓生理生化的测定方法 |
| CN106769918B (zh) * | 2016-11-21 | 2019-07-16 | 衢州学院 | 多溴联苯醚和重金属污染下苔藓生理生化的测定方法 |
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