CN102127525A - 流感病毒疫苗株在Vero细胞上的适应方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了流感病毒疫苗株在Vero细胞上的适应方法，使流感病毒疫苗株在Vero细胞上快速适应，建立各种有效的病毒适应方法，以便使流感毒种能够在Vero细胞上适应，并在最小化由于病毒适应性选择而引起的所述病毒表面抗原变异的条件下，生产用作疫苗的病毒后代。用此方法适应的疫苗适应株制备的毒种血凝滴度在大于或等于160，符合中国药典2010版三部要求。
Description
技术领域
本发明涉及多种流感病毒疫苗株在Vero细胞上的适应方法，并获得疫苗适应株及毒种种子批，以制备Vero细胞流感疫苗，属于生物技术领域。
背景技术
传统的制备流感疫苗的方法是使用鸡胚制备的，国内使用鸡胚培养疫苗已经有50多年历史。目前使用的流感疫苗主要是鸡胚制备的灭活的流感三价裂解疫苗，包括甲型流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株。还有大流感疫苗（包括H5N1等）。疫苗株的来源主要是由WHO根据每年全球流感病毒的变化规律推荐的用于下一年度流感疫苗生产用流感病毒流行株的表面抗原来确定的，将WHO推荐的流行野毒株与鸡胚高产株（A/PR/8/34（H1N1））双重感染产生重配或反遗传学重配，得到的新的疫苗株，在鸡胚上具有高产的特性，但鸡胚存在有潜在污染可能,以及潜在的鸡胚蛋白引起的变态反应，而且培养周期过长，不易于控制产量，不利于应对大规模的流感爆发；如使用SPF级鸡胚成本过高；再者流感病毒在鸡胚上传代易引起变异，而以Vero细胞和MDCK细胞传代的流感病毒其抗原性和HA1区氨基酸顺序几乎没有变化。流感病毒在鸡胚内容易发生变异，可能是造成禽流感流行的一个重要原因。
目前，国内外多数正式生产流感疫苗的厂家，均采用9-11日龄鸡胚来培养流感病毒。但也有不少报道使用VERO细胞（非洲绿猴肾细胞）和用MDCK细胞（狗肾细胞）研究者，两种流感疫苗制备方法相比，细胞培养制备疫苗的方法克服了现有生产工艺的许多不足，显著增加了疫苗产量，降低了生产成本和时间。鸡胚疫苗存在的主要问题：一方面，对种蛋要求严格，不是每只种蛋都可以用来生产疫苗，只有经过认证的养鸡厂才可以提供此类种蛋；另一方面，涉及含胚鸡蛋生产流感疫苗的常规方法非常麻烦，涉及每周处理成千上万个鸡蛋，以及大规模纯化从尿囊液中获得的病毒悬液以保证不含鸡蛋蛋白。不仅如此，由于现有方法需要鸡胚数量庞大。如果一旦种蛋供应有问题，整个疫苗生产计划就会失败。更为重要的是，新的细胞培养法有助于人类灵活应对大规模爆发的流感。近年来，高致病性禽流感的爆发总让人担心届时疫苗够不够用。用鸡胚培养病毒的话，生产多少疫苗必须提前做出精确计划，但一般来说流感爆发时，人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数千万只鸡胚。而新方法可在很短的时间内、很小的生产空间内制造出大批安全有效的疫苗。
因此，在流感疫苗制备领域内许多厂家都进行了不屑努力，利用常规的组织培养技术，用已经建立MDCK和Vero细胞等流感病毒敏感细胞种子库，进行流感疫苗的研究与生产。虽然MDCK细胞是培养和分离流感病毒较好的哺乳动物细胞，但其潜在的致癌性，使得其在用于生产疫苗方面很难能得到专家认可及国家批准。但其用于毒种主代或主代前毒种传代，不会受此限制。非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）是世界卫生组织推荐的疫苗生产细胞，属贴壁依赖和规定代次以内非致瘤性，现在采用Vero细胞生产的疫苗主要有狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗、出血热疫苗等。现有的流感病毒疫苗株都是针对鸡胚重配的高产株，能在鸡胚上具有很好的适应性，但并不是每个疫苗病毒株都能很好的适应Vero细胞。因为细胞和鸡胚感染流感病毒的最大区别之一是细胞不含能够切割流感病毒血凝素HA0前体成为HA1和HA2两个片段，HA1和HA2是由精氨酸及二硫键连接起来，当精氨酸被胰蛋白酶裂解而形成仅由二硫键连接的HA1和HA2时，病毒方有感染性。HA1是病毒吸附宿主细胞的结合位点，而与感染性有关，HA2具有膜融合活性，促使病毒包膜与胞饮细胞膜的融合并释放核衣壳。因此胰蛋白酶是细胞培养流感病毒必备的。然而在某些情况下，在Vero细胞上适应部分毒株在有一定量胰蛋白酶的条件下，仍然是有困难的。Kaverian和Webster（J Virol 69/4：2700-2703，1995）报道：在Vero细胞培养物中，培养基中的胰蛋白酶活性从温育开始就快速降低，导致由于无法产生足够数量的感染性病毒颗粒而不能在培养上清中积累病毒，但这种现象在MDCK、猴肾和恒河猴肾细胞培养物中不是那么明显。他们得出结论：从Vero细胞中释放出一种胰蛋白酶抑制因子。他们进一步显示：通过重复加入胰蛋白酶，可以恢复病毒复制，并使病毒复制维持多个循环，导致更好的病毒产量。但我们研究的试验结果并没有显示通过此方法能够改变流感病毒在Vero细胞难于适应的根本问题。综上所述，如何解决Vero细胞中的胰蛋白酶抑制因子问题，以及快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株，成了Vero细胞流感疫苗研发的关键技术难题，因此需要不断改变疫苗病毒株在Vero细胞上适应方法，建立能够快速培育流感病毒Vero细胞高产适应株的各种方法，解决这一关键技术，为Vero细胞流感疫苗的制备打下坚实基础。
国内有关资料报道，均是从NIBSC公司邮购的流感毒种，直接感染Vero细胞，但这种方法并不是每个毒株都能得到很好适应，因此，本发明采用多种途径解决这一难题。
发明内容
本发明的目的之一是提供了流感病毒疫苗株在Vero细胞上的适应方法，使流感病毒疫苗株在Vero细胞上快速适应，建立各种有效的病毒适应方法，以便使流感毒种能够在Vero细胞上适应，并在最小化由于病毒适应性选择而引起的所述病毒表面抗原变异的条件下，生产用作疫苗的病毒后代。用此方法适应的疫苗适应株制备的毒种血凝滴度在大于或等于160，符合中国药典2010版三部要求。
本发明的另一目标是提供生产用的Vero细胞适应毒种，并且按所述方法生产制备的流感疫苗符合2010版《中国药典三部》要求。
本发明了一种流行性感冒病毒在非洲绿猴肾Vero细胞上的病毒适应方法。
本发明所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种直接感染MDCK细胞或需用9-11龄鸡胚传代，然后再在Vero细胞适应传代，所述鸡胚为SPF鸡胚；
本发明所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种在Vero细胞上传代后再用鸡胚传代后，再在Vero细胞适应传代，所述鸡胚为9-11龄SPF鸡胚。
本发明所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种在Vero细胞上传代后再用MDCK等流感病毒敏感细胞传代，再在Vero细胞适应传代，所述MDCK细胞等培养条件与Vero细胞基本相同。
本发明所述的适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种首先在MDCK等敏感细胞上传代，再回传鸡胚，然后再在Vero细胞上传代，所述鸡胚为SPF鸡胚。
本发明所述的任一种病毒适应方法，其特征在于：采用以下一种或两种方式感染细胞：
1）用一种所需流感病毒感染Vero单层细胞须经洗液冲洗后，加入复合感染量0.01-1.0MOI病毒稀释液，35-37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加维持液置32-36℃培养，所述维持液为普通培养基等一般细胞培养基或含生长因子的无血清培养基，添加1-6μg/ml胰酶。所述洗液或含1-6μg/ml胰酶，不超过96小时收获病毒上清悬液；
2）用一种所需流感病毒感染Vero单层细胞须经洗液冲洗后，复合感染量0.01-1.0MOI病毒加入到维持液中，32-36℃恒温培养，所述维持液为一般细胞培养基或不含血清蛋白的含生长因子的无血清培养基，添加1-6μg/ml胰酶，所述洗液或含1-6μg/ml胰酶，不超过96小时收获病毒上清悬液。
本发明的积极效果在于：使流感病毒疫苗株在Vero细胞上能够快速适应，建立各种有效的病毒适应方法，以便使流感毒种能够在Vero细胞上适应，并在最小化由于病毒适应性选择而引起的所述病毒表面抗原变异的条件下，生产用作疫苗的病毒后代。用此方法适应的疫苗适应株制备的毒种血凝滴度大于或等于160，符合《中华人民共和国药典》2010版三部要求。本发明提供生产用的Vero细胞适应毒种，并且按所述方法生产制备的流感疫苗符合2010版《中华人民共和国药典》要求。
具体实施方式：
流感病毒感染方法
1）细胞法：镜下挑选细胞，观察细胞形态，挑选细胞单层形态好的无染菌细胞。共9瓶细胞，代次p145将细胞生长液弃之，用洗液冲洗三遍，加不同感染复数的毒种稀释液5ml/瓶，37℃恒温吸附1-2小时，添加含5微克/ml胰酶的普通培养基10ml，33-35℃恒温继续培育；
2）鸡胚法：用照蛋器，找到气室及接种位置，避开血管丰富的地方，气室边缘1mm，做标记。首先用碘酒消毒接种部位，然后用酒精棉消毒，用灭菌的小锤将接种部位锤破，用一次性1ml注射器抽取0.2ml，每只接种0.2ml。用石蜡封口，稀释度10-3和10-4各接种5只鸡胚，33-35℃培育。
利用流感病毒各种适应方法建立病毒主种子批和工作种子批，具体见实施例：
实施例1
甲1型毒种，Who批准的，所罗门株，A/Solomon/3/06 (H1N1)-,IVR-145,来源于英国NIBSC，批号：Ivr-145，06/234，代次E7 （在鸡胚内病毒传代代次用E和数字表示，在细胞上病毒传代代次用C和数字表示）
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，10日龄。
Vero单层细胞，140-145代；
MDCK细胞，99-100代；
将A/Solomon/3/06 (H1N1)E7C0来源于NIBSC毒种感染MDCK细胞和鸡胚进行传代，鸡胚传代后毒种代次为E8C0，血凝滴度为640而MDCK细胞传代代次为E7C1，血凝滴度为20-40。将鸡胚传代的E8C0代毒种感染Vero细胞继续传代，细胞病变达+++-++++时收获，并建立主代种子批（血凝滴度320）和工作种子批（血凝滴度480），并用于单价疫苗的制备。将MDCK细胞传代毒种E7C1回传鸡胚，传代后代次为E8C1，将鸡胚毒种E8C1感染Vero细胞继续传代，并建立主代种子批（血凝滴度320）和工作种子批（血凝滴度640），并用于单价疫苗的制备。
结论：通过鸡胚增值后再在Vero细胞传代，并建立符合中华人民共和国药典要求的血凝效价大于160的血凝效价大于160符合中华人民共和国药典要求，并建立甲1型毒种的主种子批和工作种子批，可以用于季节性流感疫苗的制备。MDCK细胞传代后再回传鸡胚，然后再在Vero上传代，血凝效价大于160符合《中华人民共和国药典》2010版要求，并建立甲1型毒种的主种子批和工作种子批，可以用于季节性流感疫苗的制备。
实施例2
甲3型毒种，A/wisconsin/67/2005 (H3N2)-,NYMC-161,来源于NIBSC，批号：06/112，代次E9
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，10日龄。
Vero单层细胞，140-145代；
MDCK细胞，99-100代；
将A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E9C0来源于NIBSC毒种感染MDCK细胞和鸡胚进行传代，鸡胚传代后毒种代次为E10C0，血凝滴度为480而MDCK细胞传代代次为E9C1，血凝滴度为160。将MDCK传代的E9C1代毒种感染Vero细胞继续传代，细胞病变达+++-++++时收获，并建立主代种子批（血凝滴度240）和工作种子批（血凝滴度480），并用于单价疫苗的制备。鸡胚传代后毒种E10C0，感染MDCK细胞，血凝滴度达240，将MDCK传代的E10C1代毒种感染Vero细胞继续传代，细胞病变达+++-++++时收获，并建立主代种子批（血凝滴度240）和工作种子批（血凝滴度320），并用于单价疫苗的制备。
结论：A/wisconsin/67/2005 (H3N2)E9C0毒种通过鸡胚和MDCK细胞增值后再在Vero细胞传代，血凝效价大于160符合《中华人民共和国药典》2010版要求，并建立甲3型毒种的主种子批和工作种子批，可以用于季节性流感疫苗的制备。
实施例3
乙型毒种，B/Malaysia/2506/2004,来源于英国NIBSC，批号：06/104，代次E4
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，10日龄。
Vero单层细胞，140-145代；
将B/Malaysia/2506/2004E4C0来源于NIBSC毒种感染鸡胚和Vero细胞，血凝滴度，达240，传代后病毒代次为E5C0，而Vero细胞传代后代次为E4C1，血凝滴度达10。将B/Malaysia/2506/2004E4C1毒种回传鸡胚，血凝滴度可达480，再继续在Vero细胞上传代建立主代种子批（血凝滴度160）和工作种子批（血凝滴度240），并用于单价疫苗制备。
结论：B/Malaysia/2506/2004E4C0毒种通过Vero细胞传代，再回传鸡胚，然后再在Vero细胞上传代，血凝效价大于160符合《中华人民共和国药典》2010版要求，并建立乙型毒种的主种子批和工作种子批，可以用于季节性流感疫苗的制备。
实施例4、
H5N1型毒种，A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）来源于英国NIBSC，批号：09/184，代次E3
SPF 种蛋：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司
37℃生化培养箱中孵育，11日龄。
Vero单层细胞，140-145代。
将A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）来源于NIBSC毒种感染鸡胚，一代鸡胚血凝滴度，达320，传代后病毒代次为E4C0，再传Vero细胞后代次为E4C1，血凝滴度达160。再继续在Vero细胞上传代建立主代种子批（血凝滴度240）和工作种子批（血凝滴度320），并用于人用禽流感疫苗制备。
结论：A/Vietnam/1194/2004（NIBRG-14）毒种通过鸡胚增值后再在Vero细胞传代，血凝效价大于160符合《中华人民共和国药典》2010版要求，并建立H5N1型毒种的主种子批和工作种子批，可以用于大流感疫苗的制备。
Claims (6)
1.一种流行性感冒病毒在Vero细胞上的病毒适应方法。
2.权利要求1所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种直接感染MDCK细胞或需用9-11龄鸡胚传代，然后再在Vero细胞适应传代，所述鸡胚为SPF鸡胚。
3.权利要求1所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种在Vero细胞上传代后再用鸡胚传代后，再在Vero细胞适应传代，所述鸡胚为9-11龄SPF鸡胚。
4.权利要求1所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种在Vero细胞上传代后再用MDCK流感病毒敏感细胞传代，再在Vero细胞适应传代，所述MDCK细胞等培养条件与Vero细胞基本相同。
5.权利要求1所述的病毒适应方法，其特征在于：
流感疫苗病毒株毒种首先在MDCK敏感细胞上传代，再回传鸡胚，然后再在Vero细胞上传代，所述鸡胚为SPF鸡胚。
6.权利要求1至5所述的任一种病毒适应方法，其特征在于：采用以下一种或两种方式感染细胞：
1）用一种所需流感病毒感染Vero单层细胞须经洗液冲洗后，加入复合感染量0.01-1.0MOI病毒稀释液，35-37℃吸附1-4小时，弃吸附液，补加维持液置32-36℃培养，所述维持液为普通培养基等一般细胞培养基或含生长因子的无血清培养基，添加1-6μg/ml胰酶。所述洗液或含1-6μg/ml胰酶，不超过96小时收获病毒上清悬液；
2）用一种所需流感病毒感染Vero单层细胞须经洗液冲洗后，复合感染量0.01-1.0MOI病毒加入到维持液中，32-36℃恒温培养，所述维持液为一般细胞培养基或不含血清蛋白的含生长因子的无血清培养基，添加1-6μg/ml胰酶，所述洗液或含1-6μg/ml胰酶，不超过96小时收获病毒上清悬液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |