CN102125514A - 干细胞、非去极化肌松药和透明质酸复合抗衰老作用 - Google Patents

Abstract

干细胞、非去极化肌松药和透明质酸复合抗衰老作用，该发明属于生物技术领域内抗皮肤衰老的范畴，在世界上首次提出胚胎细胞的抗衰老理论，并在这一理论指导下，发明了胚胎干细胞抗皮肤衰老的复合剂。本发明所要解决的技术问题主要是肉毒碱在抗皮肤衰老中的毒性作用，提供了无肉毒碱的抗皮肤皱纹的无毒性、而且具有促进皮肤再生的抗皮肤衰老的复合剂。人体胚胎干细胞提取的复合成分可以促进皮肤细胞的再生，而非去极化肌松药可以代替肉毒碱的作用，透明质酸，维生素C和/或维生素E等成分在维护皮肤的健康都有一定的作用。本发明的主要用途是：抗皮肤的衰老，减缓、消除面部尤其是眼部的皱纹。

Description

干细胞、非去极化肌松药和透明质酸复合抗衰老作用

技术领域

本发明涉及用于消除或预防面部皱纹的组合物，特别涉及胚胎干细胞提取物、非去极化肌松药和透明质酸，以及含有胚胎干细胞提取物和透明质酸以及其它通常应用的具有护肤功能的物质的组合物。

背景技术

从医学组织学的观点说，皱纹是皮肤中真皮组织里的弹力纤维、结缔组织和肌肤纤维随着年龄的增长而退化萎缩，以及表皮和真皮内的水分、脂肪和皮下脂肪的减少而产生的。

1.面部肌肉运动频发，如经常抬头、大笑、皱眉、皱鼻等也容易促进皱纹的形成。

2.随着人们年龄的增长，肌力降低，面部肌肉收缩无力，皮肤的张力也随之降低，因而产生皱纹。

3.表皮组织水分的流失。在青春期，表皮组织内的细胞不断地生长，新陈代谢旺盛，在真皮组织中有一种“透明质酸”的物质，通过这种物质，可使体内的营养物质、微量元素及丰富的水分通透皮肤表面。随着年龄增长，表皮组织内的皮肤干细胞分裂、增殖减缓，其他的表皮细胞生长缓慢，使体内的“透明质酸”也逐渐减少，这时皮肤也变得粗糙、形成皱纹。

4.不良的环境因素。如紫外线、干燥的气候等。

5.精神因素，比如情绪不稳定，波动较大，精神过度紧张等。

6.其他因素，如脾胃功能不和，内分泌失调，体重过速减轻，化妆等。

据研究，早期皱纹的形成基本都是与面部肌肉运动频发有关。面部肌肉的运动是由神经-肌肉兴奋传递引起的。而神经-肌肉兴奋传递是通过轴突末端释放乙酰胆碱、作用于肌膜上的乙酰胆碱受体改变其离子通道，引起膜的电位变化使肌膜去极化，进而触发了兴奋-收缩耦联，引起肌肉纤维收缩。

目前市面上所用的肉毒素注射就主要是针对上述的面部肌肉运动频发造成的皱纹。它的作用机理是，它能抑制周围运动神经末梢突触前膜乙酰胆碱释放，阻断神经和肌肉之间的信息传导，从而引起肌肉的松弛性麻痹。也可以说，肉毒素是由于麻痹了肌肉使得肌肉失去收缩能力而消除了皱纹。但是，肉毒素从来就被规定为剧毒药品，超过一定剂量即可致人于死地。当然，它用作除皱时剂量很小，理论上讲是安全的，但其毒性和 副作用毕竟是客观存在的(高致命毒素除皱危险大年轻半年换来三角眼世界科技报道日期：2004-11-1810:09)。据资料记载，将肉毒素注射在鱼尾纹或鼻纹处，由于离眼睛很近，眼睑肌肉往往被麻痹，不少人的眼睛也会随之变小(但可恢复)。此外，由于肉毒素的毒副作用，注射后出现发烧、乏力、食欲欠佳的例子也不少。严重者还会出现复视、吞咽及呼吸困难等。国外还有注射肉毒素后发生心跳骤停的报道。因此，如何在有效地抑制面部肌肉收缩的同时确保其安全性是目前亟待解决的问题。应用非去极化肌松药可能是解决这一问题的有效方法。

非去极化肌松药(nondepolarized muscle relaxitant)，也能使肌肉失去收缩能力，但是其机理却与肉毒素不同。它能与肌肉上面的受体结合，从而阻滞了乙酰胆碱与受体结合，防止了去极化发生，肌肉纤维也就无法收缩。非去极化肌松药目前主要用作临床麻醉的辅助用药，具有安全，副作用小的特点。根据它的特性以及面部皱纹的形成原因，本发明人创造性地将它用于消除和预防面部皱纹，在此之前，还未见相关的报道。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在皮肤中主要表现为保水作用。

水解明胶，是胶原蛋白经酶(酸或碱)水解的产物，水解明胶能使水份固定在皮肤和组织上，不仅可以抗老化、防皱纹、美容养颜，还能增加皮肤细胞再生，恢复肌肤弹性。

胚胎干细胞，来源于囊胚：受精卵经过3-5天的发育，经由桑葚胚而发育成囊胚，囊胚内有一个由几十个细胞所形成的细胞团块，在医学生物学领域内称之为内细胞岛。岛内的细胞称为胚胎干细胞。随着胚胎的发育，一部分干细胞不断地增生，分化为身体组织的各种具有特异功能的细胞，  而部分胚胎干细胞则保持干细胞的特点，维持其不断自我更新的能力，在组织细胞受损时进行修复。  皮肤是人体的保护屏障，由于它位于人体的表面，所以受到外部环境的影响也大，其细胞的新陈代谢也比其他的组织细胞高，因而易于老化，其典型的特点是皮肤松弛、弹性减弱、皱纹的出现。

如上所述，胚胎干细胞是一种最年轻的原始细胞，表皮细胞的损伤可刺激皮肤干细胞分裂、增生，它们也可合成和分泌多种细胞生长因子，刺激本身和其他细胞的增生、修复。美国科学家James Thomson在1 998年成功地分离了人体的胚胎干细胞，并在体外建立了人体胚胎干细胞系(Science，1998；282：1145)。这是人胚胎干细胞研究的一个重要的里程碑，随作科学研究的深入，胚胎干细胞的研究成果不断涌现，现在我们已可在培 养皿中把胚胎干细胞诱导成不同的具有特殊功能的细胞，如皮肤的各种细胞、肌细胞、神经细胞等。胚胎干细胞也可用来进行细胞替代治疗，修复遭到损伤细胞和组织。由于胚胎干细胞是一种人体中最年轻、最具活力的细胞，它们的胞浆和培养液中含有丰富的多种促细胞生长因子，我们在本发明中用胚胎干细胞的培养夜和/或胚胎干细胞的提取物，结合非去极化肌松药和透明质酸等物质，制成复方抗表皮衰老剂，具有明显的面部和眼角的抗皱纹作用。

本发明人通过创造性的劳动，选择出能够与胚胎干细胞和非去极化肌松药联合应用的其它具有皮肤养护作用的物质，并利用适当的组合使其能够充分发挥协同的消除或预防面部皱纹的作用。

发明内容

为了更有效地预防或消除面部皱纹，克服现有的A型肉毒毒素美容产品中的毒性缺陷，本发明通过发明者的创造性研究，提供了一种不仅能够抑制、消除表情肌过度收缩所致的皱纹。而且，，而且能够强力保持面部皮肤水分的组合物

本发明的第一个方面，提供一种预防或消除面部皱纹的组合物，其包含胚胎干细胞的提取物和非去极化肌松药。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物可以含任意的胚胎干细胞提取物和/或非去极化肌肉松弛剂；不过如同时含有这两种成分，其抗皱作用则明显加强。

在本发明中，利用胚胎干细胞和/或非去极化肌松药联合应用的其它具有皮肤养护作用的物质，并利用适当的组合使其能够充分发挥协同的消除或预防面部皱纹的作用。与现有的A型肉毒毒素相比较，能避免其造成的面部表情肌瘫痪的毒副作用。

定义

本发明所述术语“预防或消除皱纹”指所用的组合物可以预防面部皱纹，尤其是表情肌过度收缩所导致的皱纹；减轻、缓解、控制、改善或完全消除面部皱纹，尤其是表情肌过度收缩所导致的眼部皱纹。

本发明所述术语“对照组”指由市场可购得的三种眼霜以及兰州生物制品研究所的A型肉毒毒素。

1.胚胎干细胞提取物

如上所述，由于胚胎干细胞是一种人体中最年轻、最具活力的细胞，能够不断地分裂、增生，从而分化成身体组织的各种成熟的具有特异功能的组织细胞。胚胎干细胞在培养 时能够合成、分泌多种促细胞生长因子，因此，在它们的胞浆和培养液中含有大量的表皮和真皮组织营养因子，在保持皮肤细胞的年轻化，维持其弹性，抗皱方面都有重要的功用。我们在本发明中用胚胎干细胞的培养夜和/或胚胎干细胞的提取物，和其他的成分制成复合的抗皮肤衰老剂。

2.非去极化肌松药

多种非去极化肌松药，例如，维库溴铵，罗库溴铵，咪库氯铵，哌库溴铵，可用于本发明的构建体中。本发明优选的哌库溴铵，即阿端，是不引起心血管副作用的长效神经肌阻滞药。起效时间约为5～7min，作用时间为120-180min。该化合物的分子式为C35H62Br2N4O4，其结构式见附图1。

3.胚胎干细胞提取物、非去极化肌松药和透明质酸的组合物

包括有效剂量的胚胎干细胞提取物、非去极化肌松药以及有效剂量的透明质酸的组合物，透明质酸(HyaluronicAcid)是糖氨聚糖中结构最简单的，是一种独特的线性大分子糖氨聚糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成，分子式为(C14H21NO11)n，依据组织来源不同，分子量变化于105～107之间。透明质酸与其它天然糖氨聚糖不同，其分子内不含硫酸基团，也不与蛋白质共价结合，能以自由链形式在体内游离存在。透明质酸广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中，在胚胎、眼玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高，血清中含量最低。

透明质酸具有许多天然糖氨聚糖共有的性质：呈白色，为无定形固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。但较其它糖氨聚糖而言，透明质酸有其独特的性质，兼具高分子量和大分子体积的特性。由于直链轴上基团之间的氢键作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的双螺旋柱型，其长可达20μm。在水溶液中透明质酸分子链上相邻-NH和-COO ^-残余基之间的“水桥”作用，进一步加强其刚性；同时，CH基团的连续定向排列，又在分子链上形成高度憎水区，为分子链之间相互缠绕和链链之间相互作用提供接点，透明质酸分子链的亲水和憎水特性，使浓度很低(1μg/ml)的透明质酸也能形成连续的三维蜂窝状网络结构，水分子则在网络内通过极性键和氢键与透明质酸分子相互结合，使得透明质酸象“分子海绵”一样，可以吸收和保持其自身重量上千倍的水分。事实上，透明质酸比其它任何天然或合成聚合物都具有更强的吸水力，以至2％的纯透明质酸溶液能将剩余98％的水紧紧吸住，使得能象胶状物一样被提起，但它实际上是溶液，能被稀释。透明质酸溶液具有独特的粘弹性，剪切力对其粘度值影响很大，溶液受高剪切力作用时，粘度可为1/1000以下，溶液的粘弹性随透明质酸分子量和浓度的增加而增加，也被认为是分子网络形成的结果。所以一个透明质 酸分子在水中将占据1000～10000倍于自身体积的空间。当透明质酸处于封闭的间隙如细胞间基质时，将产生膨压，加上分子表面的-COO^-因吸引了阳离子，更增加基质的渗透压。这是这些膨压使软骨、腱等结缔组织具有抗压和弹性。

人体表皮和真皮中含有高浓度的透明质酸，占人体中透明质酸总量的一半以上，皮肤中的含水量和透明质酸含量直接相关，随着年龄增长，皮肤老化，被认为是皮肤中透明质酸含量下降和聚合度改变的结果。体外细胞培养表明，皮肤的纤维细胞质膜处能生物合成透明质酸，代谢过程很快，半衰期为1～2d。

4.胚胎干细胞提取物、非去极化肌松药和透明质酸以及其它可用于面部养护物质的组合物

所述的其它可用于面部养护物质如水解明胶，维生素E等。

美国安利公司推出的胶原蛋白其主要成份也是水解胶原蛋白，其功效为：通过服用胶原蛋白，以内养外，增加肌肤弹性，减少皱纹。实验证明，连续服用2个月后，皮肤弹性增加45％，水份增加30％，透明光泽增加50％，皱纹减少30％，水解明胶能使水份固定在皮肤和组织上，水解明胶摄入后能形成更多的胶原蛋白，胶原蛋白不足时，皮肤的水份会减少失去弹性和水份，肌肤就无法保持年轻。水解明胶易于被身体吸收，帮助身体中胶原蛋白、弹力蛋白及网状蛋白的合成，从而滋养皮肤、毛发、指甲和全身的结缔组织，不仅可以抗老化、防皱纹、美容养颜，还能增加皮肤细胞再生，恢复肌肤弹性，同时可以补充组织流失的胶原蛋白，帮助排除皮肤多余脂肪，抑制皮肤过分出油。水解明胶的摄入还能有效消除皮肤斑点，去除黑斑、老人斑。

5.本发明组合物效用

发明人通过研究发现，胚胎干细胞提取物，非去极化肌松药，透明质酸和水解明胶均可以通过皮肤吸收，为此，发明人设计了胚胎干细胞提取物，非去极化肌松药，透明质酸和水解明胶的组合物，并且将所述的组合物施用于20至35岁人群的面部皮肤，共施行1 2例，取得了令人鼓舞的效果。所述的组合物的除皱效果显著优于所选的三种市售眼霜中任何一种的效果(实施例)。

6.毒性研究

本发明提供了检测组成的组合物对于机体的毒性的评价。我们施用10倍于正常剂量(指组合物中的剂量)的所述的组合物于受试验者皮肤，然后观察其皮肤情况，检测其血清中反映肝功能的指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及总胆红素，以及用心电图检测其心电活动。

7.从胚胎干细胞里抗皮肤衰老有效成分：

1)1％明胶(gelatin/PBS)coating T75 cm细胞培养瓶30分钟；

2)吸干后等3-5分钟；

3)在37度水浴箱快速溶解一管人胚胎干细胞，加10ml无血清培养液洗一次；

4)离心，1000转/分，5分钟，去除上清液，用1ml培养液重悬细胞；

5)加14ml无血清干细胞培养液到培养瓶，然后把干细胞转移到培养瓶培养3天；

6)吸出培养液；

7)用PBS清洗胚胎干细胞2次；

8)加2-3ml 2.5mM EDTA，是细胞悬浮，收集到15ml离心管；

9)加10ml PBS清洗干细胞，离心，吸干；

10)加2-3ml细胞溶解液(50mM Tris ph 8.2，150mM Nacl，2mM EDTA，1mM Na3Vo4，2.5mM NaF，1mM PMSF，0.5％NP-40 and proteinase inhibitor tablet from Roche)，，溶解细胞，然后收集到离心管内；

11)在4度摇晃1小时，离心14000转/分，30分；

12)取其上清液，4度PBS透析8小时，2x；

13)冰冻干燥，保存在-80度冰箱；

14)然后和非去极化肌肉松弛几，透明质酸，水解明胶按一定的比例制作皮肤防皱霜；

8.组合物的制备

1)以去离子纯净水作为溶剂，其中首先加入透明质酸，浓度为0.5-4g/L，优选2g/L。

2)加入水解明胶，30-200g/L，优选80g/L；将混合液置于60度温水浴锅，轻摇45分钟，溶液完全澄清透明后取出。

3)冷却到37度，然后加入适量的胚胎干细胞提取物，冷却至室温。溶液冷却后形成凝胶。

4)上述凝胶中加入非去极化肌松药，例如，维库溴铵，罗库溴铵，咪库氯铵，哌库溴铵，优选哌库溴铵，浓度为0.1g-1.0g/L，优选0.4g/L。充分搅拌混匀。

5)最后加入杀菌剂，充分搅拌混匀。置于避光低温保存。

8.使用方法

首先，用清水洗净面部，用食指挑少许本组合物轻柔均匀地涂抹在眼角及眼下，之后轻柔地由内向外按摩8-10次即可。使用期间尽量避免大笑等表情肌的剧烈运动。

附图说明

图1：哌库溴铵的分子式。

图2：使用一周后拍照比较对照组和治疗组，发现治疗组中II例有效，其中有2例眼部皱纹消失。

图3：使用一月后拍照比较对照组和治疗组，发现治疗组中12例均有效，有5例眼部皱纹消失。

实施例一、

随机选取12名眼部有明显皱纹，年龄在20-35岁青年，其中男女各六人。左眼使用作为对照的市面所售的三种不同眼霜产品；右眼使用本发明所述的组合物。对照分为三组，第一组以国内产品A(李医生)作为对照，第二组以国外产品B(Body Shop)作为对照，第三组以国外产品C(Simple)作为对照。使用方法均为洗净眼部和双手，用示指将米粒大小各种眼霜均匀轻柔地涂抹在眼角及眼下皮肤外表面。每日晚上睡前和起床后各使用一次。一周后拍照比较对照组和治疗组，发现第二、第三对照组中各有1例有效。而治疗组中11例有效，其中有2例眼部皱纹消失(见图2)。一月后拍照比较对照组和治疗组，发现第二对照组中有2例有效、第三对照组中有3例有效。而治疗组中12例均有效，其中有5例眼部皱纹消失。(见图3)。

Claims (9)

1.用于消除或预防面部皱纹的组合物，所述组合物包括有效剂量的：

第一组分，人和动物的胚胎干细胞及其他干细胞提取物；第二组分，非去极化肌松药；第三组分，透明质酸；第四组分水解明胶。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胚胎干细胞(也包刮其他各种干细胞)提取物和干细胞生长因子。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述非去极化肌松药。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述透明质酸。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述水解明胶。

6.权利要求1-5中任一权利要求所述组合物在制备用于消除或预防面部皱纹尤其是眼部皱纹中的用途。

7.权利要求1-2中所述的干细胞提取物在制备用于消除或预防面部皱纹的护肤品中的用途。

8.如权利要求1，其中还可包含Vitemin C、Vitemin E等可用于面部养护的营养素。

9.如权利要求1所述的组合物在预防和消除面部皱纹，特别是眼部皱纹方面的作用。

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