CN102125000A - 血吸虫虫卵的孵化方法及其所用的孵化袋 - Google Patents

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陆珂
林矫矫
江艳
杨艺
李小红
刘毅
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Abstract

本发明公开了一种血吸虫虫卵的孵化方法，包括以下步骤：将待检粪样加入孵化袋后封口，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔；把装有待检粪样的孵化袋放入清洗装置中清洗、甩干，以去除待检粪样中部分杂质与色素，并保留血吸虫虫卵；将清洗完的孵化袋放入孵化杯，加入孵化水孵化。本发明还公开了一种用于血吸虫虫卵孵化的孵化袋。本发明血吸虫虫卵的孵化方法，不仅操作简便、耗时少，而且灵敏度高、准确性好，适用于大规模批量检测。

Description

血吸虫虫卵的孵化方法及其所用的孵化袋
技术领域
本发明涉及动物虫卵的孵化方法，尤其涉及一种血吸虫虫卵的孵化方法及其所用的孵化袋。
背景技术
日本血吸虫是一种严重的人畜共患寄生虫病，家畜、尤其是生活在疫区的家畜是主要的传染源。人与家畜血吸虫病的普查方法有多种，但最普遍、最准确的方法是采用粪便检查的方法。粪便检查血吸虫病也是当前病原检查的主要方法之一。粪便检查血吸虫的方法主要依靠粪便毛蚴孵化法，粪便毛蚴孵化法仍是当前可以作出正确诊断的检测方法，也是国家考核达标验收时规定的检测方法。该方法的操作程序分为四步骤：1.铜筛过滤；2.滤出物以尼龙筛绢淘洗；3.加入沉淀杯，沉淀换水，除去上浮物；4.倒入三角烧瓶或长颈烧瓶中进行孵化，为便于观察毛蚴，还要在瓶颈下1/2处加一块2-3cm的脱脂棉，再加清水至瓶口。这种方法通常称为常规尼龙筛绢淘洗粪便毛蚴孵化法，由于该方法既经过铜筛网过滤，又经过尼龙筛绢淘洗，粪渣清晰，孵出毛蚴易于观察，但是由于要经过铜筛网过滤，尼龙筛绢淘洗等多步骤，每一步骤均要散失一些虫卵。根据无锡血防所以16份阳性粪便进行试验，共检出毛蚴数1998只，其中沉淀内为1171只，仅占58.6％，而倒去的残杂却孵出毛蚴827只，占总数的38.1％，其他换水等散失占3.3％。这种孵化的方法的缺点是：(1)对低感染度人群或动物的敏感性低；(2)虫卵丢失多，计数不准确；(3)步骤多，耗时长。为此，有必要发展更灵敏、快捷的方法。
直接粪便毛蚴孵化法检测家畜血吸虫病，其操作方法上减少铜筛过滤、尼龙筛绢淘洗过滤这两个过程，将粪便直接倒入三角烧瓶或长颈烧瓶中进行孵化。有实验证实75克血吸虫病阳性牛粪采用直接粪便毛蚴孵化法与常规尼龙筛绢淘洗法进行对比试验，结果常规尼龙筛绢法孵出毛蚴22个，而直接粪便淘洗法仅孵出毛蚴2个，12小时后，前者换水重新孵化，已没有发现毛蚴，后者换水后分瓶孵化，却仍然出现大量毛蚴，说明许多虫卵尚未孵出毛蚴。第二次同样方法以50克粪便进行对比试验，常规尼龙筛绢法孵出毛蚴146个，而直接粪便毛蚴孵化法为101个，同样12小时后换水分瓶孵化，前者仍然没有孵出毛蚴，而后者依然有毛蚴孵出。常规尼龙筛绢淘洗粪便毛蚴孵化法，由于该方法既经过铜筛网过滤，又经过尼龙筛绢淘洗，粪渣清晰，所有毛蚴均能孵出，效果较直接粪便毛蚴孵化法好。
发明内容
本发明要解决现有的粪便毛蚴孵化法检测步骤繁琐、敏感性低、准确性差的技术问题，提供一种血吸虫虫卵的孵化方法，该方法不仅操作简便、耗时少，而且可批量操作，且灵敏度高、准确性好。
此外，还需要提供一种上述血吸虫虫卵的孵化方法所用的孵化袋。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种血吸虫虫卵的孵化方法，包括以下步骤：
将待检粪样加入孵化袋后封口，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔；
把装有待检粪样的孵化袋放入清洗装置中清洗、甩干，以去除待检粪样中部分杂质与色素，并保留血吸虫虫卵；
将清洗完的孵化袋放入孵化杯，加入孵化水孵化。
优选的，所述孵化袋的孔径为300～350目，因为300～350目的孵化袋能有效阻挡血吸虫虫卵通过，而孵化出的血吸虫毛蚴又易于钻出孵化袋，达到很好的孵化效果。
所述孵化袋的材质包括尼龙筛绢、涤纶筛绢、丙纶纤维或维纶纤维。优选的，本发明的孵化袋选用尼龙筛绢袋。
优选的，清洗所用水的温度不超过16℃，因为降低水体温度至16℃及以下后清洗孵化袋内虫卵时可抑制虫卵孵化，防止在清洗过程中因虫卵孵化成毛蚴而流失，提高检测的准确率。
优选的，清洗所用水的盐浓度大于等于0.5％，因为增加水体中盐的含量可增加孵化所需时间，0.5％及以上盐浓度水清洗孵化袋内虫卵时可抑制虫卵孵化，从而防止在清洗过程中因虫卵孵化成毛蚴而流失，提高检测的准确率。
优选的，所述清洗、甩干的次数为四次以上，可以将待检粪样清洗干净，提高毛蚴孵化率。
优选的，所述孵化的温度为26℃，26℃是最适孵化温度。
在本发明的另一方面，提供了一种用于血吸虫虫卵孵化的孵化袋，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔。
优选的，所述孵化袋设有自封条，便于封口。
本发明血吸虫虫卵的孵化方法，每一个样品在一个尼龙筛绢袋中完成待检物的过滤和孵化，减少了操作步骤和虫卵损失，提高了检测敏感性，同时由于可以进行自动化操作，本发明方法检测速度明显提高，适于血吸虫病疫区家畜的大规模检测。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明尼龙筛绢袋的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种血吸虫虫卵的孵化方法，包括以下步骤：将待检粪样加入孵化袋后封口，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔；把装有待检粪样的孵化袋放入清洗装置中清洗、甩干，以去除待检粪样中小于孵化袋孔径的杂质与色素，并保留大于孵化袋孔径的血吸虫虫卵；将清洗完的孵化袋放入孵化杯，加入孵化水孵化。在仅有上部开口的孵化杯中，虫卵得到孵化，由于孵化毛蚴具有向光性和向上性，汇聚到孵化杯上部的观察窗。当仅需要做定性检测时，可通过观察窗观察水体中是否有毛蚴出现；当需要做定量检测时，可通过过滤杯体中的水分收集全部毛蚴，达到定量效果。
本发明的孵化方法减少了经铜筛网过滤的步骤，直接将粪样放入特制的可封口的孵化袋内，用加水清洗甩干的方法淘洗粪样，减少了粪样的转移过程，使粪渣中的虫卵得以保存，能获得更多的毛蚴，同时，本发明方法又不同于直接粪便毛蚴孵化法。直接粪便毛蚴孵化法由于粪便未经铜筛网过滤，又没有经过尼龙筛绢袋淘洗，粪渣多，色素浓，影响其毛蚴孵出。有实验表明自然光线下孵出毛蚴数比黑暗情况下孵出毛蚴数高出3倍之多，直接粪便毛蚴孵化法，有多种原因造成虫卵孵出率较低，其中大量粪渣和粪渣中抑制虫卵孵化的物质以及水体透光率低可能是主要因素。本发明方法通过加水清洗甩干的方式淘洗孵化袋中的粪样，减少了粪渣中抑制虫卵孵化的物质，增加了透光率，既促进孵化，又便于毛蚴观测。
本发明用于血吸虫虫卵孵化的孵化袋的材质包括尼龙筛绢、涤纶筛绢、丙纶纤维或维纶纤维。在本发明的实施例中，孵化袋优选带有自封条的尼龙筛绢袋(如图1所示)。
下面通过实施例作进一步详细说明。
实施例1不同孔径尼龙筛绢袋对血吸虫虫卵的通透及孵化
100-500目/时的尼龙筛绢袋可阻挡血吸虫虫卵通过，而血吸虫毛蚴可方便通过。
制作不同孔径的尼龙筛绢袋，将吸取定量的血吸虫虫卵(1000个/ml)置于其中，加水过滤一次后计数过滤出的虫卵，袋内剩余虫卵孵化，观察不同孔径尼龙筛绢袋对虫卵和毛蚴的阻隔作用。
表1不同孔径尼龙筛绢袋对血吸虫虫卵的通透及孵化
Figure BDA0000051693610000031
结果：300目的尼龙筛绢袋能很好的防止虫卵流失并达到较好的孵化效果。超过500目阻碍虫卵流失好但孵化效果较差。因此，用300-350目的尼龙筛绢袋做血吸虫虫卵孵化，效果较佳。
实施例2清洗、甩干次数与孵化的关系
将待检牛粪50克置于300目的尼龙筛绢袋，用1000ml水清洗并甩干，重复上述步骤，检测检每次洗涤后的水样浑浊度(OD600值)以及对应的水的孵化毛蚴数。
表2清洗、甩干次数与孵化的关系
结果：甩干次数4-5次后虫卵的孵化基本不受影响。
实施例3不同水温对毛蚴孵化的影响
检测不同水温对毛蚴孵化的影响。
表3不同水温对毛蚴孵化的影响
结果：26℃是最适孵化温度，即降低水体温度至16℃及以下后清洗孵化袋内虫卵可抑制虫卵孵化。
实施例4不同孵化水内的盐浓度对毛蚴孵化的影响
表4不同孵化水内的盐浓度对毛蚴孵化的影响
结果：不含盐(NaCl)的水是最适孵化用水，即增加水体中盐的含量可增加孵化所需时间，1.2％及以上盐浓度水漂洗孵化袋内虫卵可抑制虫卵孵化。
实施例5检测最适合水温26℃时毛蚴孵化的时间
表5最适合水26℃时毛蚴孵化的时间
Figure BDA0000051693610000044
Figure BDA0000051693610000051
结果：最适水温26℃时血吸虫虫卵可快速孵化，一般观察时间在2小时内最好。
通过上述实施例1-5的实验，孵化袋通过以下方式使用，效果较佳：
粪样加入孵化袋后加入水温不超过16℃或加入NaCl至终浓度大于或等于0.5％的水，清洗甩干4次以上，清洗甩干时间可在20分钟内完成。然后装入孵化杯，加26℃孵化水在26℃的室温内孵化，一小时或两小时即可观察毛蚴孵出情况。
实施例6天然感染血吸虫牛粪检测
采集野外感染血吸虫的牛粪进行比较，由于虫卵数较少，一小时观察基本无孵化的毛蚴，故只记录3小时和5小时的观察和解剖镜计数结果，如表6所示。
表6日本血吸虫病粪便毛蚴孵化法比较
Figure BDA0000051693610000052
结果显示，不管用目直接观察还是用解剖镜吸出毛蚴计数，均以本发明孵化袋法毛蚴的孵出率最高，方差分析表明，孵化袋法的毛蚴孵出率显著高于常规方法(P＜0.05)。
实施例7人工掺入虫卵实验
为进一步验证上述结果，采用定量加入的方法，设计两组样品，一组每50克阴性粪样定量加入20个虫卵，为低掺入组；另一组每50克阴性粪样定量加入100个虫卵，为高掺入组。分别用两种方法检测每组粪样，比较检出情况。其他操作同前。
两次实验显示，无论粪样中加入的虫卵数较少(20个/50g粪样)或较多(100个/50g粪样)，孵化袋法毛蚴的孵出率均最高(见表7)。方差分析表明，孵化袋法的毛蚴孵出率在高掺入虫卵实验中极显著高于常规法(P＝＜0.01)；在低掺入虫卵实验中和标准法差别不显著(P＝0.06＞0.05)。
表7日本血吸虫病人工掺入虫卵粪便毛蚴孵化法比较
Figure BDA0000051693610000061
实施例8
A.称取50克粪样。
B.将粪样放入300目的尼龙筛绢袋中(8cmx12cm)。
C.用尼龙筛绢袋上的自封条双封口进行封口，以防粪样漏出。
D.用自来水在洗衣机内浸泡漂洗、甩干，最适的漂洗用水为去氯的自来水，水温在16℃以下，或在水中加0.5％终浓度的NaCl盐水。为保证孵化时水内盐分不影响孵化，最后一次可用不含盐的去氯水漂洗一次。
E.反复上述D步骤4-5次，直到漂洗干净，甩干转速一般为洗衣机转速(＜1000rpm)，时间为1分钟之内。
F.把收集的虫卵和杂物封闭在尼龙筛绢袋中一同放入孵化杯。
G.加孵化水，保持在26℃孵化，孵化观察时间为1-2小时。
H.可一次完成100个样品的同时漂洗和检测(使用5公斤的甩干机)。
I.检测结束，取出尼龙筛绢袋，倒出粪样，冲洗干净，用50℃以上水浸泡，晾干后可反复使用数次。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种血吸虫虫卵的孵化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检粪样加入孵化袋后封口，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔；
把装有待检粪样的孵化袋放入清洗装置中清洗、甩干，以去除待检粪样中部分杂质与色素，并保留血吸虫虫卵；
将清洗完的孵化袋放入孵化杯，加入孵化水孵化。
2.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，所述孵化袋的孔径为300～350目。
3.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，所述孵化袋的材质包括尼龙筛绢、涤纶筛绢、丙纶纤维或维纶纤维。
4.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，清洗所用水的温度不超过16℃。
5.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，清洗所用水的盐浓度大于等于0.5％。
6.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，所述清洗、甩干的次数为四次以上。
7.根据权利要求1所述的孵化方法，其特征在于，所述孵化的温度为26℃。
8.一种用于血吸虫虫卵孵化的孵化袋，其特征在于，该孵化袋具有100～500目孔径的微孔。
9.根据权利要求8所述的孵化袋，其特征在于，所述孵化袋的材质包括尼龙筛绢、涤纶筛绢、丙纶纤维或维纶纤维。
10.根据权利要求8所述的孵化袋，其特征在于，所述孵化袋设有自封条。
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