CN102108356A - 新颖启动子及包含其之病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明构筑一种活化KRAS^mutant但非p53调控的启动子和产生一种剔除E1B-55kD(ΔE1B-55D)的腺病毒，带有转录上活化的转基因并在具活化KRAS^mutant的肿瘤细胞中具有溶裂复制能力。本发明腺病毒可用于治疗癌症。

Description

新颖启动子及包含其之病毒载体

技术领域

本发明系关于一种分离的核酸启动子及包含其的条件复制型腺病毒载体(conditionalreplication adenovirus vector，CRAD)。特定而言，分离的核酸启动子包含剔除p53反应组件(response element)的人类双微粒体基因2(human double minute 2，hdm2)P2启动子。

背景技术

癌症为死亡的重要原因。视癌症类型而定，主要以手术、化学治疗及/或放射治疗处理。此等治疗通常无法成功地以手术去除所有的癌症且可能发生转移；一些癌症对化学治疗及放射治疗具有抗性；及抗化学治疗的肿瘤常会扩散。有需要发展单独使用或结合传统技术的新颖疗法。

一种可能疗法为使用表现抗癌蛋白质的病毒载体治疗肿瘤。腺病毒载体已被证明可用于各种基因治疗应用，基于腺病毒的载体具有适合于癌症及基因疾病治疗的数种特征。腺病毒易于在培养基生长且达到安定的高效价病毒液。它们的宿主范围广泛，可在大部分的人类癌症细胞中复制，且可藉位置突变及插入以外来启动子调控的外来基因而操纵其基因组。

条件复制型腺病毒载体(CRAD)已成为新一类的抗癌剂，其可在肿瘤细胞中选择性复制并溶裂他们(1-3)。美国第7,109,029号专利发现一病毒载体，其具有至少一种干扰基因组件(interfering genetic element)，包含至少一种转录单元，其中至少一个隔绝序列(insulating sequence)位于5’至该转录单元的转录起始位置及3’至该干扰基因组件。美国第7026164号专利提供E1A/E1B缺陷腺病毒(E1A/E1B deficient adenovirus)生长的腺病毒包装细胞株(adenovirus packaging cell lines)，其实质上不含复制型腺病毒(replicationcompetent adenoviruses，RCA)。以CRAD为主的癌症治疗已进行临床试验评估(4-7)。CRAD的安全性及有效性视相对于正常细胞，肿瘤中的特定病毒复制而定。在正常细胞，但不在肿瘤细胞，删除编码病毒生命周期所需蛋白质的基因是诱导肿瘤专一性病毒复制溶裂的策略(3)。此策略已用于剔除E1B-55kD的治疗性CRAD，其在p53-非功能性肿瘤细细胞中运用特定细胞病变效果(8，9)。p53基因是已被充分研究且已知的基因之一。p53在将各种不同刺激(例如，DNA损伤，转录或复制的去调控(deregulation)及致癌基因转化(oncogene transformation))转变成细胞生长抑制或凋亡(cell growth arrest or apoptosis)的细胞压力反应(cellular stress response)中扮演重要角色。P53人类癌细胞中被去活化。当p53被去活化，不正常的肿瘤细胞无法自细胞族群中去除且能够增殖。剔除E1B-55kD的治疗性CRAD的实例为ONYX-015(dl1520)，其在p53非功能性肿瘤中已显示抗肿瘤活性(10，11)。剔除E1B-55kD的腺病毒在具p53^wild的细胞中无法有效复制。在正常细胞中由剔除E1B-55kD的腺病毒诱导的p53表达使得此等细胞对剔除E1B-55kD的腺病毒的溶裂复制具有抗性。相反地，缺乏p53使肿瘤细胞对剔除E1B-55kD的腺病毒的溶裂复制不具抗性。

人类ras基因家族由3个成员组成：H-ras、K-ras及N-ras基因。此等基因编码21kD的相关蛋白质，其位于细胞膜的内侧且被认为涉及从细胞表面受体至其细胞内目标的转导讯号。肿瘤细胞株及新鲜肿瘤组织的重要部份已被发现具有活化的ras基因。此等基因的特征在于诱导细胞的致癌基因转化(oncogenic transformation)。在大部分的例子中分析，活化是由于ras基因的第12或13密码的点突变导致基因产物的单一氨基酸取代。RAS的活化突变与许多恶性疾病(包括肺癌及大肠直肠癌，比例分别为约21％及34％)的肿瘤生成有关(12，13)。亦有许多其它恶性疾病带有RAS活化突变并呈现升高的RAF活性(14)。为了延伸CRAD的细胞病变效果至具有活化RAS的肿瘤，可使用采取隔离肿瘤细胞的p53但留下未影响的带有p53^wild的正常细胞的策略。反常地，已发现剔除E1B-55kD的腺病毒可在p53^wild肿瘤细胞中复制(15)。在这些例子中，可能牵涉到p53的负调控因子Hdm2，由于其被p53转录地上调并与p53形成回馈环以去活化p53(16)。hdm2基因的转录可藉RAS-上调的RAF/MEK/MARK通路以与p53无关的模式打开(17)。由ETSA及AP-1/ETSB组件组成的RAS/Raf讯号级联反应组件(Ras/Raf singalingcascade-responsive element)在老鼠双微粒体基因2(double minute 2；mdm2)P2启动子被鉴定出来，位于p53反应启动子组件的上游(17，18)。该hdm2 P2启动子由AP-1/ETSa组成，其为位于mdm2 P2启动子的AP-1/ETSB的保守性同源物；然而，不包括位于mdm2 P2启动子的ETSA的对应物。Hdm2 P2启动子的RAS/Raf讯号级联反应确实发现于人类癌细胞(17)。

因此，仍有需要发展有效地在肿瘤中复制及散布的载体，但他们被修饰使得不会在正常组织中复制。

发明内容

剔除E1B-55kD基因区段(ΔE1B-55kD)的腺病毒，能分解具有p53突变或不表达p53的肿瘤细胞。然而许多肿瘤细胞具KRAS活化突变(KRAS^aMut)，且表达自然型p53(p53^wild)。为增加ΔE1B-55kD腺病毒对肿瘤分解的应用性，使能分解表达自然型p53的肿瘤细胞，本发明利用KRAS活化突变去引导human double minute 2(hdm2)的表达进而中和自然型p53，而创作一个不拘肿瘤细胞p53突变或不突变的肿瘤分解腺病毒。hdm2的启动子含KRAS和p53的调控区段，去除p53调控区段后，本发明提供一个仅受KRAS^aMut调控的hdm2启动子-Δp53REP2启动子，并藉由启动子报告系统实验确定了其仅受KRAS^aMut调控的特异性。将藉由Δp53REP2去调控hdm2表达的系统导入ΔE1B-55kD的腺病毒内而制造出一种新的受KRAS^aMut调控的肿瘤分解腺病毒-Ad-KRHdm2。

本发明的启动子

在一方面，本发明提供一种分离的核酸启动子，其包括部分或全部的p53反应组件(p53 response element)被剔除的人类双微粒体基因2(hdm2)启动子。

用语“分离的(isolated)”，当用于分子(如启动子序列)，意指该分子是分离自与其在体内或在其天然存在状态结合的至少一种其它化合物，如蛋白质、DNA、RNA或其它污染物。因此，当一核酸序列已自与其天然结合的任何其它成分分离时，则被视为分离。用语“天然存在(naturally occuring)”或“野生型(wild type)”被用于描述发现于自然的物体，与人工制造的不同。例如，存在于生物(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列，其可分离自天然来源且其不为人类在实验室中蓄意修饰，为天然存在。

用语“核酸(nucleic acid)”或“核酸序列(nucleic acid sequence)”为一核苷酸、寡核苷酸、聚核苷酸、或其任何片段。

用语“启动子(promoter)”为一不转译DNA序列，通常位于编码区域的上游，其包含RNA聚合酶II的结合位置并开始DNA的转录。启动子区域亦可包括作为基因表达的调控子的其它组件。

在本发明，启动子基因是衍生自人类双微粒体基因2(hdm2)P2启动子，其中其p53反应组件被删除。该hdm2P2启动子(Δp53REP2启动子)含有RAS/RAF通路反应组件(RAS/RAF pathway response element)及两个p53反应组件(p53 response element)。根据本发明，在hdm2 P2启动子中的448至505的DNA序列(GGT CAAGTTCAGACACGTTCCGA AACTGCAGTA AAAGGAGTTA AGTCCTGACT TGTCT；SEQ ID NO：1)被剔除且该新构筑的启动子称为Δp53REP2启动子。衍生自Δp53REP2启动子的启动子DNA可藉删除一部分而被修饰，只要该启动子活性具有与Δp53REP2启动子类似的活性。根据本发明的具体实施例，本发明Δp53REP2启动子约为574bp长。本发明启动子的一较佳具体实施例具有下列序列：

1 GGATGGTGAG GAGCAGGTAC TGGCCCGGCAGCGAGCGGTC ACTTTGGGT

51 CTGGGCTCTG ACGGTGTCCC CTCTATCGCT GGTTCCCAGCCTCTGCCCGT

101 TCGCAGCCTTTGTGCGGTTC GTGGCTGGGG GCTCGGGGCGCGGGGCGCGG

151 GGCATGGGGC ACGTGGCTTT GCGGAGGTTT TGTTGGACTGGGGCTAGGCA

201 GTCGCCGCCA GGGAGGAGGG CGGGATTTCGGACGGCTCTC GCGGCGGTGG

251 GGGTGGGGGT GGTTCGGAGG TCTCCGCGGG AGTTCAGGGTAAAGGTCACG

301 GGGGCCGGGG GCTGCGGGGC CGCTTCGGCGCGGGAGGTCC GGATGATCGC

351 AGGTGCCTGT CGGGTCACTA GTGTGAACGC TGCGCGTAGTCTGGGCGGGA

401 TTGGGCCGGT TCAGTGGGCA GGTTGACTCA GCTTTTCCTCTTGAGCTCCA

451 GCTGGGGCTA TTTAAACCAT GCATTTTCCC AGCTGTGTTCAGTGGCGATT

501 GGAGGGTAGA CCTGTGGGCA CGGACGCACG CC(SEQ ID NO：2)

本发明的条件复制型腺病毒载体(conditional replication adenovirus vector，CRAD)

在一方面，本发明提供一种病毒载体，其包括本发明的启动子(较佳为Δp53REP2启动子)。根据本发明，该病毒载体为腺病毒、腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、牛痘病毒(vaccinia virus)、逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)或单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)。

根据本发明的具体实施例，本发明也提供一种条件复制型腺病毒载体，其包括本发明的启动子(较佳为Δp53REP2启动子)。根据本发明的另一具体实施例，该条件复制型腺病毒载体包括Δp53REP2启动子、位于Δp53REP2启动子下游且操作连结至Δp53REP2启动子的Hdm2编码DNA及E1A和E1B-19kD(但无E1B-55kD)的编码DNA。

用语“条件复制(conditionally-replicative)”为病毒基因的表达或病毒或载体的复制，其中该表达或复制视目标细胞中存在或缺乏特定因子而定。

用语“操作连结(operably linked)”为功能性相关的核酸序列。启动子与编码序列操作连结，如启动子控制编码多肽的转译。

用语“腺病毒(adenovirus)”及“腺病毒颗粒(adenoviral particle)”包括任何及所有分类为腺病毒的病毒，包括感染人类或动物的腺病毒，包括所有群(group)、亚群(subgroup)及血清型(serotype)。因此，“腺病毒”及“腺病毒颗粒”为病毒本身或其衍生物，并涵盖所有血清型及亚群及天然存在及重组型式。在一具体实施例，此等腺病毒感染人类细胞。此等腺病毒可为野生型或以各种已知或本发明揭示的各种方式修饰。此等修饰包括修饰包裹于颗粒中以制造感染性病毒的腺病毒基因组。本发明例示的腺病毒载体包括，但不限于，DNA、包含于腺病毒外壳的DNA、包裹于另一种病毒或类病毒形式(如单纯疱疹病毒或AAV)的腺病毒DNA、包含于微脂体(liposomes)的腺病毒DNA、与聚赖氨酸复合的腺病毒DNA、与合成聚阳离子分子复合的腺病毒DNA、与运铁蛋白(transferrin)结合的腺病毒DNA或与化合物(如PEG)复合以遮蔽抗原性及/或增加半衰期的腺病毒DNA、或与非病毒蛋白质结合的腺病毒DNA。

根据本发明，“E1A”为编码腺病毒E1A区域的所有基因产物，包括两个主要RNA：13S及12S的表达产物。他们分别转译成289及243个氨基酸的多肽。此两个蛋白质有46个氨基酸不同，其自12S mRNA剪切。本发明条件复制型腺病毒载体中的E1A编码核酸序列为E1A编码序列及其变异体。

根据本发明，“E1B”为编码腺病毒E1B区域的所有基因产物，包括19kd及55kd的三个主要多肽。E1B 19kd及55kd蛋白质在细胞转化方面具有重要性。本发明条件复制型腺病毒载体包含E1B-19kd但不包含E1B-55kd的编码序列。本发明条件复制型腺病毒载体中的E1B-19kd但不包含E1B-55kd的编码序列为E1B-19kd但不包含E1B-55kd的编码序列及其变异体。

本发明条件复制型腺病毒载体在癌细胞中选择性复制并以活化RAS，与p53基因的状态无关，藉由形成溶菌斑(plaque)及在细胞中呈现细胞毒性而发挥细胞病变效果。本发明复制型腺病毒载体，如同其它剔除E1B-55kD的腺病毒，以失去p53功能在肿瘤细胞中发挥细胞病变效果。

本发明的病毒载体可使用重组DNA技术制备。“重组DNA技术(recombinant DNAtechnology)”为组合两个或多个DNA分子的技术。重组DNA分子一般藉基因工程制造。同义用语包括“基因剪切(gene splicing)”、“分子克隆(molecular cloning)”及“基因工程(genetic engineering)”。此等操作的产物导致重组物或重组分子。

本发明包括一种本发明病毒载体于制造治疗癌症的药剂的用途。因此，本发明病毒载体可用于调节癌症的发展及进展，其包括，但不限于，赘瘤(neoplasm)、肿瘤(tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝细胞癌、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、神经节母细胞瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing′s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大肠癌、胰脏癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、血肿、胆管癌、黑色素瘤、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睪丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星状细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞肿瘤、白血病、(如急性淋巴细胞白血病)，急性成髓细胞性白血病、(骨髓母细胞白血病、急性前骨髓细胞性白血病，急性骨髓单核球性白血病，急性单核球性白血病及急性红血球性白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞白血病(颗粒球性白血病)及慢性淋巴球性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、直肠癌、头颈癌、脑癌、原发部位未明癌、周围经系统癌、中枢经系统癌、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、重链病、癌转移、及未控制或不正常细胞生长的任何疾病。较佳地，癌症为肺癌、小细胞肺癌、大肠癌或直肠癌。

在一具体实施例，本发明病毒载体藉由直接注射至肿瘤或癌组织投药。在另一具体实施例，本发明病毒载体或复制型腺病毒载体可为全身性投药(如静脉注射)。在另一具体实施例，本发明复制型腺病毒载体系投药至组织或器官的内腔(lumen)(如intravesically)。

在本发明的另一具体实施例，本发明病毒载体可与放射治疗结合使用。放射治疗可为本领域中已知的任何形式的放射治疗，如X射线治疗的外部光束放射、藉插入放射活性物质而递送于体内接近或在肿瘤位置的放射治疗，如以发散伽玛射线(gamma ray)的放射性核种的治疗、利用中子或带电荷粒子及其类似物的粒子光束治疗。此外，本具体实施例包括使用多于一种的本发明载体结合放射治疗。

本发明的另一具体实施例涉及使用本发明病毒载体与化学治疗结合。化学治疗剂是本领域中已知且包括抗代谢剂(包括嘧啶类似物及嘌呤类似物的抗代谢剂)、植物生物碱、抗肿瘤抗生素、烷化剂及其类似物。使用多于一种本发明载体与化学治疗剂也包括于本具体实施例。

本发明病毒载体在具活化KRAS^mutant的肿瘤细胞也在具p53^mutant的肿瘤中呈现细胞病变效果。其针对具活化KRAS^mutant的肿瘤细胞，不拘p53基因的型态，且对邻近的正常细胞没有明显的细胞病变效果。因此，本发明的条件复制型腺病毒载体具有肿瘤选择性。本发明条件复制型腺病毒载体亦可去活化p53以进行复制溶裂。本发明的病毒载体可作为抗癌剂。

医药组合物

在另一方面，本发明提供一种医药组合物，包括本发明病毒载体及医药可接受的载剂。

本发明医药组成物可藉任何现有技术中已知的适合路径投药，包括例如直接注射至肿瘤或藉其它注射路线如静脉内、皮下、肌内、穿皮、气管内或脑内。投药可如注射般快速或藉缓慢灌注或缓慢释出调配物而投药一段时间。

根据本发明的组合物可为医药制剂的形式。此等制剂以医药技术领域中已知的方式制造。一较佳的制剂利用生理食盐水溶液媒剂，但可使用其它医药上可接受载剂，如其它无毒性盐的生理上浓缩物、5％的葡萄糖水溶液、无菌水或其类似物。医药组合物亦可包括适合的缓冲液。此等溶液可被冷冻干燥并贮存于无菌瓶，添加无菌水后复原后用于立即注射。主要溶剂可为水性或非水性。

载剂可包括用于修饰或维持pH、渗透压、黏度、澄清度、颜色、无菌、安定性、溶离率、或调配物颜色的其它医药上可接受的赋形剂。同样地，载剂可包括用于修饰或维持释出或吸收或穿透血脑障壁的其它医药上可接受的赋形剂。此等赋形剂为惯用于调配单位剂型或多剂型式的非经肠投药剂型或藉连续或周期灌注的直接灌注于脑脊髓液的剂型的彼等物质。

包含本发明复制型腺病毒载体的组合物可口服投药。此等调配物较佳与适合载剂囊封并调配为固体剂型。适合载剂、赋形剂及稀释剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶(gum acacia)、磷酸钙、洋菜胶(alginate)、硅酸钙、微结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、甲基及丙基羟羟基苯甲酸酯(methyl-and propylhydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸镁、水、矿物油及其类似物。调配物可另外包括润滑剂、湿润剂、乳化及悬浮剂、保存剂、甜味剂或香料。组合物可经调配以提供活性成分在投药后快速、持续或延迟释放至病患。

剂量系根据病患体重或体表面积或身体体积计算。剂量的计算亦视投药路线而定。决定治疗的适当剂量所需的进一步的精细计算由所属技术领域的技术人员进行。此等计算可由所属技术领域的技术人员不需过度试验而进行。精确的剂量系结合标准剂量反应研究而决定。应了解确实投药的组合物量将由医生决定，基于病况、所选择投药的组合物、年纪、重量、个别病患的反应、病患症状的严重性及所选择的投药路线。可基于剂型调配物的药物动力参数及所使用的投药路线重复投药。

附图说明

图1显示在活化突变KRAS调控启动子控制下的Hdm2转基因及构筑成包裹腺病毒载体的穿梭质粒的控制。A：插入产生Ad-E1、Ad-Δp53REP2及Ad-KRhdm2腺病毒载体的穿梭质粒的转基因。Ad-E1腺病毒载体含有腺病毒的全长E1编码序列；Ad-Δp53REP2腺病毒载体含有E1A至E1b19KD编码序列及Δp53REP2启动子推动的emptycassette；及Ad-KRhdm2腺病毒载体带有Ad-Δp53REP2腺病毒载体的所有组件及藉Δp53REP2启动子推动的Hdm2 cDNA。B：Δp53REP2启动子构筑图。在A及B，显示引物的位置且其序列列于实施例的材料及方法部分。引物：1，E1-337-XhoI-F；2，E1-3528-BglII-R；3，E1-2150-NotI-R；4，BpA-NotI-F；5，BpA-KpnI-R；6，P2-KpnI-F；7，P2-BglII-R；8，P2-BamHI-R；9，H2-BamHI-F；10，H2-BglII-R；11，P2-KpnI-F；12，P2-BglII-R；13，P2-INT-F；14，P2-INT-R。C：转基因的片段长度藉PCR片段长度及直接测序检测。PCR片段溶解于1％洋菜胶。片段长度：Ad5E1为3208bps、ΔE1B-55kD E1(E1A to E1B-19kD)为1935bps、牛生长激素基因的多聚腺苷酸(polyadenylation)讯号为295bps、Δp53REP2启动子为574bps及Hdm2编码DNA为1533bps。

图2显示Hdm2及p14ARF于以Ad-KRhdm2转染的细胞株及对照组的表达的Western blot分析。A：Hdm2的代表性Western blot分析及B：p14ARF的代表性Westernblot分析。以Ad-E1、Ad-Δp53REP2或Ad-KRhdm2载体在1.0的MOI感染1小时，2天后自每一细胞株提取蛋白质。作为上样量(loading)对照，每一实验槽(panel)均分析α-tubulin蛋白质。C：Hdm2的强度及D：p14ARF的强度，藉α-tubulin的对应强度正常化，数据以平均值+/-SE(3个实验组)呈现。*，p＜0.05 by the Mann-Whitney test。

图3显示活化KRAS^mutatnt调控的启动子及p53反式活化的p21Cip启动子的荧光素酶报告子(luciferase reporter)活性。A：KRAS但非p53调控的Δp53REP2启动子的报告子活性及B：p53反式活化的p21Cip1启动子在每一细胞株的活性。为测定荧光素酶活性，4.5ug的pΔp53REP2-L(A)或pp21Cip1-Luc(B)报告子质粒，及0.5ug的pCMVβ报告子质粒被共转染至5X105的细胞株。转染后48小时测定荧光素酶活性。相对β-galactosidase活性，荧光素酶活性被正常化以呈现相对的活性单位(relativeluminescence units，RLU)。数据以平均值+/-SE(3个实验组)呈现。*，p＜0.05 by theMann-Whitney test。

图4显示腺病毒载体的病毒效价分析。A：以腺病毒载体感染的细胞株形成的溶菌斑。针对每一细胞株，10⁶细胞接种于每一60mm培养皿，且于Ad在10^-4的MOI感染1小时后，7天后评估以溶菌斑形成单位显示的细胞病变作用(CPE)。以1ml、0.03％中性红(neutral red)溶液染色后计算溶菌斑。B：以mock-Ad(supernatant of HEK293 cellculture)、Ad-E1、Ad-Δp53REP2或Ad-KRhdm2转染的细胞株的溶菌斑形成单位的数目以平均值+/-SE(3个实验组)呈现。

图5显示以Ad-KRhdm2及对照组转导的细胞株的存活结果。针对藉MTT分析测定的细胞存活，每一细胞株接种10⁴细胞至96孔盘的每一孔中并以Ad-E1、Ad-Δp53REP2或Ad-KRhdm2在指定的MOI(0.01，0.1，1，10，100及1,000)感染。7天后测定细胞存活。数据以平均值+/-SE(3个实验组)呈现。

图6显示裸鼠异种移植模型的肿瘤内注射Ad-KRhdm2及对照组的细胞病变作用。裸鼠的异种移植如实施例的材料及方法所述。每一RKO、LoVo、SW620及LS174T细胞株在4只裸鼠的8个异种移殖生长至100mm³并在该时间于肿瘤内注射10¹⁰pfus的各Ad-E1、Ad-ΔE1B55kD或Ad-hMDM2载体或PBS(每组4只小鼠)。监测平均肿瘤体积(+/-SE)并于Ad注射每5天后如材料及方法所述测定肿瘤体积。当肿瘤大到难以负荷时牺牲小鼠。

具体实施方式

本发明的较佳具体实施例描述于下列实施例。但该等实施例并非用以限制本发明。

实例1材料及方法

细胞株及细胞培养方法

本实验中所使用的人类肾脏胚胎上皮细胞(HEK293)、人类正常肺纤维母细胞(MRC-5)及人类大肠直肠癌细胞(RKO、HCT116、LoVo、LS174T、LS123、SW620及HT29)皆是取自美国细胞培养暨储存中心(American Type Culture Collection，Rockmille，Maryland)。以上各细胞中p53及KRAS基因的表达参考自“the catalogue of somaticmutations in cancer，in The Sanger Institute COSMIC database”(www.sanger.ac.uk)。其中MRC5及RKO细胞的KRAS及p53基因表达皆为正常，HCT116、LoVo及LS174T细胞中p53基因表达为正常；KRAS活化突变的形式分别为G13D、G13D及G12D，而LS123、SW620及HT29细胞的p53基因突变；且KRAS活化突变的形式分别为G12S、G12V及G61L。HEK293细胞以MEM培养基培养(Eagle`s minimum essential medium加入2mM左旋麸酰胺酸、0.1mM非必需胺基酸、1mM丙酮酸钠及10％去补体的马血清)，RKO and MRC5细胞以MEM培养基培养(Eagle`s minimum essential medium加入10％去补体的胎牛血清)，HCT116 and HT29细胞以McCoy′s 5A培养基培养(McCoy′s 5Amedium加入1.5mM左旋麸酰胺酸及10％去补体胎牛血清)。LoVo细胞以Ham′s F12K培养基培养(Ham′s F12K medium加入2mM左旋麸酰胺酸及10％去补体胎牛血清)。LS174T and LS123细胞以MEM培养基培养(Eagle`s minimum essential medium加入2mM左旋麸酰胺酸、0.1mM非必需胺基酸、1mM丙酮酸钠及10％去补体胎牛血清。SW620细胞以Leibovitz′s L-15培养基培养(Leibovitz′s L-15me dium加入2mM左旋麸酰胺酸及10％去补体胎牛血清)。所有细胞皆置于37℃、5％CO2培养箱中培养。建构仅受KRASmutant调控的hdm2启动子-Δp53REP2启动子

hmd2P2启动子包含RAS/RAF反应区段和两个p53反应区段。pΔp53REP2-Luc报告载体是藉由交迭引伸PCR的方式，将两个p53反应区段从hmd2 P2启动子中剔除(图1B)(19)，两套引物被用来扩增p53反应区段前端与后端的P2片段，其序列为第一组P2-KpnI-F：5`-CTGAGGTACCGGATGGTGAGGAGCA-3’(SEQ ID NO：3)和P2-INT-R：5`-CCCCAGCTGGAGCTCAAGAGGAAAAGCTGA-3’(SEQ ID NO：4)；第二组P2-INT-F：5`-CTCTTGAGCTCCAGCTGGGGCTATTTAAAC-3`(SEQ ID NO：5)和P2-BglII-R：5`-TGCTAGATCTGGCGTGCGTCCGTGC-3`(SEQiD nO：6)，两个内部引物，P2-INT-F和P2-INT-R，包含有相同的序列区段，因此进一步将这两段PCR相加，利用其中间相同序列区段进行黏合作用，再用P2-KpnI-F与P2-BglII-R作引物进行第二次PCR，即可得到剔除掉p53反应区段的P2启动子，然后插入包含荧光素酶基因的pGL3-Basic质粒(Promega，Madison，WI)，即建构成pΔp53REP2-Luc报告载体。pp21Cip1-Luc报告载体包含萤火虫冷光酶基因，其表达是受两段p53反应区段所调控(20)，作为对照组的报告载体是pCMVβ，其带有的β-galactosidase基因是受CMV启动子所调控，能持续在细胞中表达(Clontech，Mountain View，CA).。

荧光素酶报告系统实验

侦测相对的荧光素酶活性，试验p53调控pp21Cip1-Luc报告载体及KRAS调控pΔp53REP2-Luc报告载体的能力。利用

细胞转染试剂(Qiagen，Hilden，Germany)将4.5μg pp21Cip1-Luc或pΔp53REP2-Luc或pGL3-Basic(对照组)与0.5μgpCMVβ共同转染入5×105细胞内，48小时后收集细胞蛋白，利用Dual-

Reporter Assay System(Promega，Madison，WI)测试其中的荧光素酶活性，同时利用β-Galassay(Invitrogen，Carlsbad，CA)测试其中的β-galactosidase活性，相对的荧光素酶活性单位(relative luminescent unit，RLU)的计算方式为将荧光素酶活性除以β-galactosidase活性。

建构及包裹腺病毒载体

腺病毒载体的制作是利用同源重组的原理，将所希望加载的序列置入pShuttle载体后，再与含有剔除E1 Ad5基因组的AdEasy^TM腺病毒载体(Stratagene，Cedar Creek，TX)进行重组。如图1所示，制造复制胜任的Ad-E1腺病毒载体的穿梭质粒包含有完整的腺病毒E1编码序列；制造包含有E1A至E1B-19kD的E1B-55kD剔除的E1的Ad-Δp53REP2腺病毒载体的穿梭质粒及仅含有Δp53REP2启动子；Ad-KRhdm2腺病毒载体除了包含有E1A至E1B-19kD的基因区段外，还包含有由Δp53REP2启动子引导Hdm2的表达系统。Ad5-E1(3208bps)及E1A至E1B19kD(1935bps)的基因区段利用PCR的方式，从HEK293细胞的DNA中得出(图1C)，其使用引物分别为E1A组E1-337-XhoI-F：5`-CACTCGAGGTAATATTTGTCTAGGGCCGC-3`(SEQ ID NO：7)及E1-3528-BglII-R：5`-GCAGATCTGCCCACACATTTCAGTACC-3`(SEQ ID NO：8)；E1A至E1B19kD引物组E1-337-XhoI-F：5`-CACTCGAGGTAATATTTGTCTAGGGCCGC-3`(SEQ ID NO：9)及E1-2150-NotI-R：5`-AGGCGCGGCCGCCAACATTCATTCCCGA-`3(SEQ ID NO：10)。聚腺甘酸信号(polyadenylation signal)(295bps，Fig.1C)是从pGlow-TOPO质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)序列中得到，使用的引物为BpA-NotI-F：5`-GTTGGCGGCCGCCCCGCTGATCAGCCT-3`(SEQ ID NO：11)及BpA-KpnI-R：5`-ATCCGGTACCTCAGAAGCCATAGAG-3`(SEQ ID NO：12)。Δp53REP2启动子序列(574bps；图1B及C)是从pΔp53REP2-Luc报告载体中得出，使用引物组P2-KpnI-F：5`-CTGAGGTACCGGATGGTGAGGAGCA-3`(SEQ ID NO：13)及P2-BamHI-R：5`-TGCTGGATCCGGCGTGCGTCCGTGC-3`(SEQ ID NO：14)。hdm2编码DNA(1533bps；图1C)是利用RT-PCR的方式，从MRC5mRNA中得到，其利用的引物为Hdm2-BamHI-F：5`-CGCCGGATCCAGCAGGCAAATGTGC-3`(SEQ ID NO：15)及Hdm2-BglII-R：5`-AGAAAGATCTTTATAGACAGGTCAAC-3`(SEQ ID NO：16)。经由适当的限制酶作用后，个别的PCR片段相互黏合后置入pShuttle载体，进而与AdEasy^TM腺病毒载体(Stratagene，Cedar Creek，TX)于大肠杆菌株BJ5183内进行重组后，将重组完成的腺病毒载体转染至HEK293细胞内进行完整的腺病毒复制，再利用Adeno-XTM病毒纯化试剂盒(Clontech)，即可从细胞培养液中得到新的腺病毒Ad-E1，Ad-Δp53REP2，Ad-KRHdm2。所有腺病毒皆经过完整的基因序列分析确定其正确性，并以病毒效价测定法确定其效价。

人类腺病毒5型保藏编号(Human adenovirus type 5 DNA accession number)：AC000008；hdm2 DNA保藏编号(accession number)：AF527840.

西方墨点法(Western Blot Analysis)

将样品分别提取蛋白质后，先经过蛋白质电泳分离，再将其转至硝化纤维膜上(Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)，分别以anti-α-tubulin(DM1A)单克隆抗体(Calbiochem，Darmstadt，Germany)、anti-Hdm2(D 12)单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)、anti-p14ARF(4C6/4)单克隆抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)、anti-p53(1C12)单克隆抗体(Cell Signaling)及anti-adenovirus hexon(3G0)单克隆抗体(Santa Cruz)对膜上蛋白作专一性的结合，再用二次抗体(Promega，Madison，WI)，对上述抗体进行专一性的结合，然后以碱性磷酸酶(Thermo Scientific，Waltham，MA)呈色，以侦测个别蛋白质的表达量。

细胞存活率(Cell Viability Assay)

将10⁴个细胞置入96孔盘中，经24小时培养后，分别加入序列稀释的腺病毒载体(0.01，0.1，1，10，100及1,000的MOIs)，经7天培养，利用细胞活性测试TACS^TM MTTassay(R&D Systems，Minneapolis，MN)计算细胞存活率。

病毒效价测定法(Plaque-Forming Assay)

将10⁶个细胞置入6公分培养皿中，经过24小时的培养后，在培养基中分别加入1毫升序列稀释后的病毒载体，再经过2小时培养的后，加入0.65％琼脂胶(BD Difco，Loveton Circle Sparks，MD)覆盖(以MEM培养基溶解，并加入2％胎牛血清)，于37℃、5％CO2下培养7天后，以中性红(neutral red)染色，计数噬菌斑(plaque)的数目即可算出病毒效价。

利用裸鼠外殖肿瘤模式试验于肿瘤内注射腺病毒载体其毒杀肿瘤细胞的能力

本实验使用6周大的裸鼠(Balb/c Nude mice)购自乐斯科生物科技公司(BioLASCO，Taiwan)，所有的实验内容皆遵循台北荣民总医院动物管理委员会的规范。首先，先经由皮下注射在裸鼠下肢分别植入5×106个人类大肠直肠癌细胞(RKO、LoVo、SW620及LS174T)，每隔7天测量肿瘤大小，并由公式：(宽2×长)/2算出肿瘤体积。待肿瘤体积约为100立方厘米时，将老鼠随机分为四组，分别由皮下注入食盐水(negative control)、Ad-KRhdm2、Ad-Δp53REP2(the Hdm2-negative control)及Ad-Elvectors(theE1B-55kD-positive control)，各病毒载体的效价皆为1010pfus。

实例2腺病毒载体的构筑

如图1A所示的Ad-E1、Ad-Δp53REP2及Ad-KRhdm2的转基因并入用于Ad载体的构筑的对应穿梭质粒。使用携带Ad 5的编码全长E1 DNA的Ad-E1载体的转基因插入物构筑复制胜任的Ad-E1。Ad-Δp53REP2载体的转基因插入物含有E1A及E1B-19kD-编码DNA但不含E1B-55kD-编码DNA，及Δp53REP2启动子-推动的empty cassette，Δp53REP2启动子是以两个被剔除的p53反应组件推动自hdm2P2启动子(图1B)。Ad-KRhdm2载体的转基因插入物的构筑系藉由将Hdm2编码DNA并入Δp53REP2启动子的Ad-Δp53REP2下游。以PCR片段长度(图1C)及DNA定序分析确认此等转基因插入物的正确构筑及序列。hdm2-P2启动子的ETSA位置并未保留在Δp53REP2启动子并剔除两个p53反应组件。Δp53REP2启动子的序列显示如下：

1 GGATGGTGAG GAGCAGGTAC TGGCCCGGCAGCGAGCGGTC ACTTTTGGGT

51 CTGGGCTCTG ACGGTGTCCC CTCTATCGCT GGTTCCCAGCCTCTGCCCGT

101 TCGCAGCCTT TGTGCGGTTC GTGGCTGGGG GCTCGGGGCGCGGGGCGCGG

151 GGCATGGGGC ACGTGGCTTT GCGGAGGTTT TGTTGGACTGGGGCTAGGCA

201 GTCGCCGCCA GGGAGGAGGG CGGGATTTCGGACGGCTCTC GCGGCGGTGG

251 GGGTGGGGGT GGTTCGGAGG TCTCCGCGGGAGTTCAGGGT AAAGGTCACG

301 GGGGCCGGGG GCTGCGGGGC CGCTTCGGCGCGGGAGGTCC GGATGATCGC

351 AGGTGCCTGT CGGGTCACTA GTGTGAACGC TGCGCGTAGTCTGGGCGGGA

401 TTGGGCCGGT TCAGTGGGCA GGTTGACTCA GCTTTTCCTCTTGAGCTCCA

451 GCTGGGGCTA TTTAAACCAT GCATTTTCCC AGCTGTGTTCAGTGGCGATT

501 GGAGGGTAGA CCTGTGGGCA CGGACGCACG CC

以Ad-KRhdm2的成功转导藉Hdm2的表达得以证明(图2A)。

实例3 Hdm2在Ad-KRhdm2转导细胞中的表现系由活化KRAS^mutant调控，不拘p53基因的状态

在密码12或13的p14ARF的表达Hdm2表达显著增加，相较于具野生型KRAS的MRC5正常纤维母细胞或在RKO肿瘤细胞中Hdm2的表达(图2A及C)。然而，在Ad-KRhdm2转导的HT29细胞(其带有G61L KRAS突变)，Hdm2表达并未显著增加且不会显著活化hdm2Δp53REP2启动子(图2A及C及图3A)。增加的Hdm2表达发生于具p53^wild的Ad-KRhdm2转导的HCT116、LoVo及LS174T细胞株及具p53^mutant的LS123及SW620细胞株。在以Ad-Δp53REP2转导的细胞中，Hdm2表达不会增加，其为负对照组。

实例4在具活化KRAS^mutant的肿瘤细胞中p14^ARF的表达相当低且在Ad转导中增加

在带有KRAS活化突变的HCT116、LoVo、LS174T、LS123及SW620细胞株，p14^ARF的表达显著低于其在具有野生型KRAS的MRC5正常纤维母细胞或在RKO肿瘤细胞的表达(图2B及D)。在具KRAS活化突变的细胞株中p14^ARF的表达(但不在MRC5或RKO细胞中表现)在Ad感染后增加，然而，不超过以Ad-KRHDMS感染的MRC5或RKO细胞中的表现量(图2B及D)。

实例5hdm2Δp53REP2启动子的反式活化(transactivation)反应至活化KRAS^mutatnt，不拘p53基因的状态

进行报导分析以测定hdm2Δp53REP2启动子的活性对各种基因状态的KRAS的调控。为达成此目的，将Δp53REP2启动子的报告子质粒转染至图3A所示的细胞株。相较于在具有野生型KRAS的MRC5正常纤维母细胞或RKO肿瘤细胞，hdm2Δp53REP2启动子的活性在具KRAS活化突变的HCT116、LoVo、LS174T、LS 123及SW620细胞株中增加6至9倍。然而，具G61L突变的KRAS在HT29细胞中无法显著反式活化hdm2Δp53REP2启动子。

实例6藉Hdm2的活化KRASmutant-调控的表达，藉p53的P21Cip1启动子的反式活化被破坏

图3B显示者为p53wild(as in mock-transducted MRC5，RKO，HCT116，LoVo及LS 174T细胞株)但并非p53mutant(as in mock-transducted LS123，SW620及HT29细胞株)反式活化转染质粒中的P21Cip1启动子。图3B亦显示Ad-KRhdm2转导于p53反式活化活性的效果。P53wild在具活化KRASmutant/p53wild细胞株的反式活化活性藉由转导Ad-KRhmd2而破坏，其中Hmd2表达系上调如图2A及C所示。相较于Ad-Δp53REP2转导的控制，表现于此等Ad-KRhmd2转导的细胞的Hdm2负责p53反式活化活性的破坏。P21Cip1启动子在具p53wild的细胞株的反式活化藉Ad-E1而不藉Ad-Δp53REP2感染而破坏。E1b-55kD表达于Ad-E1但不表达于具p53wild的REP2转导的细胞株系抑制p53反式活化功能的结果。

实例7Ad-KRhdm2的选择性活体外细胞病变作用

进行活体外病毒效价测定以评估Ad-KRhmd2对肿瘤细胞株及MRC正常细胞株的细胞病变作用(cytopathic effect，CPE)。Ad-E1及Ad-Δp53REP2系用于感染作为对照组。以Ad-KRhmd2在4x10-5 to 4x10-3的MOI感染细胞。如图4所示，在4x10-4的MOI感染1小时后评估溶菌斑形成单位(plaque-forming units(pfu))。Ad-KRhdm2形成的溶菌斑标示于具活化KRASmutan，不拘p53状态，的HCT116、LoVo、LS174T、LS123及SW620细胞培养物(图4A及B)。Ad-Δp53REP2在LS123、SW620及HT29细胞株培养物(其带有失去p53功能的突变)亦产生标示的溶菌斑形成(图3B及图4)。由于在相同的MOI形成较多的溶菌斑，此等细胞株(LS123、SW620及HT29)相较于Ad-E1对Ad-KRhdm2呈现较高的感受性(susceptible)。

为定量剂量效果，检测Ad-KRhmd2对细胞株的细胞存活的选择性细胞病变作用。Ad载体的“CE50”代表以腺病毒载体感染，培养7天后，导致存活率降低50％的MOI。如表1及图5所示，Ad-KRhdm2对带有活化KRASmutant/p53wild的HT116、LoVo及LS174T细胞株的CE50分别为3.18±0.49，0.48±0.06，and 0.46±0.03，其低于Ad-KRhdm2于正常纤维母细胞(MRC5)及RKO肿瘤细胞的440至3400倍，低于Ad-Δp53REP2的1,000至17,000倍，及低于Ad-E1于HT116、LoVo及LS174T细胞株的2-11倍。同样地，Ad-KRhmd2于具KRASmutant/p53mutant的LS123、SW620及HT细胞株的CE50分别为0.41±0.09，0.53±0.08，and 6.07±0.11，其与Ad-Δp53REP2或Ad-E1载体于此等细胞株并无显著不同。

表1腺病毒载体于细胞株的CE50

结果以平均+/-标准偏差(n＝8)表示

实例8Ad-KRhdm2于活化KRASmutant肿瘤异种移植模型的杀肿瘤效果

来自RKO、LoVo、SW620或LS174T大肠直肠癌细胞株的8个异种移植分成四个治疗组(肿瘤内注射PBS、Ad-KRhdm2、Ad-Δp53REP2及Ad-E1载体)并监测并对时间作图，显示于图6。

所有治疗组的小鼠均无死亡，即使当肿瘤体积到达2500mm3。小鼠在肿瘤注射第1天的体重范围为16.0至19.2克。所有4个治疗组在第70天的体重为17.8至19.6克。对照组(注射PBS)及注射Ad-KRhdm2、Ad-Δp53REP2或Ad-E1载体组间的体重增加并无显著差异。当肿瘤大到难以负荷时(约2500mm3)牺牲小鼠。

在第70天的研究终点时，在Ad-KRhdm2注射后，所有接种每一LoVo、SW620及LS174T细胞株的8个位置均无肿瘤(图6)。同时，在第70天，在Ad-Δp53REP2注射后，所有接种SW620或LS174T细胞株的8个位置亦无肿瘤。然而，在第40天肿瘤生长到最大时，裸鼠的RKO肿瘤的异种移植维持生长且在4组(PBS、Ad-Δp53REP2、Ad-KRhdm2及Ad-E1)的肿瘤体积并无显著差异。Ad-KRhdm2因此在具KRASmutant，不拘p53状态的LoVo、SW620及LS174T肿瘤异种移殖中呈现选择性的杀肿瘤功效，然而，Ad-Δp53REP2在具p53mutant的SW620及LS174T肿瘤异种移殖呈现选择性的杀肿瘤功效。

参考文献

1.Alemany R，Balague C，Curiel DT.Replicative adenoviruses for cancer therapy.Nat Biotechnol2000；18：723-7.

2.Heise C，Kirn DH.Replication-selective adenoviruses as oncolytic agents.J Clin Invest2000；105：847-51.

3.Alemany R.Designing adenoviral vectors for tumor-specific targeting.Methods Mol Biol2009；542：57-74.

4.DeWeese TL，van der Poel H，Li S，et al.A phase I trial of CV706，a replication-competent，PSA selective oncolytic adenovirus，for the treatment of locally recurrent prostate cancer followingradiation therapy.Cancer Res 2001；61：7464-72.

5.Khuri FR，Nemunaitis J，Ganly I，et al.A controlled trial of intratumoral ONYX-015，aselectively-replicating adenovirus，in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients withrecurrent head and neck cancer.Nat Med 2000；6：879-85.

6.Nemunaitis J，Ganly I，Khuri F，et al.Selective replication and oncolysis in p53 mutant tumorswith ONYX-015，an E1B-55kD gene-deleted adenovirus，in patients with advanced head and neckcancer：a phase II trial.Cancer Res 2000；60：6359-66.

7.Chu RL，Post DE，Khuri FR，Van Meir EG.Use of replicating oncolytic adenoviruses incombin ation therapy for cancer.Clin Cancer Res 2004；10：5299-312.

8.B ischoff JR，Kirn DH，Williams A，et al.An adenovirus mutant that replicates selectively inp53-deficient human tumor cells.Science 1996；274：373-6.

9.Heise CC，Williams AM，Xue S，Propst M，Kirn DH.Intravenous administration of ONYX-015，a selectively replicating adenovirus，induces antitumoral efficacy.Cancer Res 1999；59：2623-8.

10.Goodrum FD，Ornelles DA.The early region 1B 55-kilodalton oncoprotein of adenovirusrelieves growth restrictions imposed on viral replication by the cell cycle.J Virol 1997；71：548-61.

11.Steegenga WT，Riteco N，Bos JL.Infectivity and expression of the early adenovirus proteinsare important regulators of wild-type and DeltaE1B adenovirus replication in human cells.Oncogene 1999；18：5032-43.

12.Chan TL，Zhao W，Leung SY，Yuen ST.BRAF and KRAS mutations in colorectal hyperplasticpolyps and serrated adenomas.Cancer Res 2003；63：4878-81.

13.Eberhard，DA，Johnson，BE，Amler，LC，et al.Mutations in the epidermal growth factorreceptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lungcancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib.J Clin Oncol2005；23：5900-9.

14.Zhang H，Rosdahl I.Expression of oncogenes，tumour suppressor，mismatch repair andapoptosis-related genes in primary and metastatic melanoma cells.Int J Oncol 2001；19：1149-53.

15.Rothmann T，Hengstermann A，Whitaker NJ，Scheffner M，zur Hausen H.Replication ofONYX-015，a potential anticancer adenovirus，is independent of p53 status in tumor cells.J Virol1998；72：9470-8.

16.Chen J，Lin J，Levine AJ.Regulation of transcription functions of the p53 tumor suppressor bythe mdm-2 oncogene.Mol Med 1995；1：142-52.

17.Phelps M，Darley M，Primrose JN，Blaydes JP.p53-independent activation of the hdm2-P2promoter through multiple transcription factor response elements results in elevated hdm2expression in estrogen receptor alpha-positive breast cancer cells.Cancer Res 2003；63：2616-23.

18.Ries S，Biederer C，Woods D，et al.Opposing effects of Ras on p53：transcriptional activationof mdm2 and induction of p19ARF.Cell 2000；103：321-30.

Claims (16)

1.一种分离的核酸启动子，其包含剔除部分或全部p53反应元件(response element)的人类双微粒体基因2(human double minute 2，hdm2)P2启动子。

2.根据权利要求1所述的启动子，其包含人类双微粒体基因2(hdm2)P2启动子，其中所述hdm2P2启动子的氨基酸序列498至505(GGT CAAGTTCAGA CACGTTCCGAAACTGCAGTA AAAGGAGTTA AGTCCTGACT TGTCT)被剔除。

3.根据权利要求1所述的启动子，其中人类双微粒体基因2(hdm2)P2启动子为约574bp长。

4.根据权利要求1所述的启动子，其具有如SEQ ID NO：2所示的核酸序列(Δp53REP2启动子)。

5.一种病毒载体，其包含根据权利要求1所述的启动子。

6.根据权利要求5所述的病毒载体，其中该病毒载体为腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、逆转录病毒、慢病毒或单纯疱疹病毒。

7.根据权利要求5所述的病毒载体，其中该病毒载体为腺病毒。

8.一种条件复制型腺病毒载体，其包含如权利要求4的Δp53REP2启动子、位于Δp53REP2启动子下游且操作连结至Δp53REP2启动子的Hdm2编码DNA及E1A和E1B-19kD(但无E1B-55kD)的编码DNA。

9.根据权利要求5或8所述的病毒载体，其可用于结合放射治疗或化学治疗。

10.根据权利要求5或8所述的病毒载体，其具有肿瘤选择性。 

11.一种根据权利要求5或8所述的病毒载体于制备治疗癌症的药剂中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其中所述癌症选自由赘瘤(neoplasm)、肿瘤(tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝细胞癌、肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、神经节母细胞瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing′s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大肠癌、胰脏癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、血肿、胆管癌、黑色素瘤、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睪丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星状细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞肿瘤、白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、直肠癌、头颈癌、脑癌、原发部位未明癌、周围经系统癌、中枢经系统癌、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、重链病、癌转移、及以未控制或不正常细胞生长表征的任何疾病或病症组成的群组。

13.根据权利要求11所述的应用，其中该癌症为肺癌、小细胞肺癌、大肠癌或直肠癌。

14.一种医药组合物，其包含根据权利要求5或8所述的病毒载体及医药上可接受载剂。

15.根据权利要求14所述的医药组合物，其系用于治疗癌症。

16.根据权利要求15所述的医药组合物，其中所述癌症选自由赘瘤(neoplasm)、肿瘤(tumor)、癌瘤(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)、腺瘤(adenoma)、骨髓白血病、肝细胞癌、 肝母细胞瘤、横纹肌肉瘤、食管癌、甲状腺癌、神经节母细胞瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing′s sarcoma)、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、大肠癌、胰脏癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、血肿、胆管癌、黑色素瘤、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、睪丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星状细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞肿瘤、白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症及非何杰金氏症)，多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、直肠癌、头颈癌、脑癌、原发部位未明癌、周围经系统癌、中枢经系统癌、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、重链病、癌转移、及以未控制或不正常细胞生长表征的任何疾病或病症组成的群组 。

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