CN102094000A - 一种改进细胞色素p450酶家族体外表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。
背景技术
细胞色素P450（CYP450）酶是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，是I相反应中活性最强的代谢酶，可参与许多前致癌物和前毒素的代谢活化，生成亲电性很强的中间产物或终产物，引发一系列的毒性效应。现有研究CYP450酶代谢活化外源化合物的途径主要分体内和体外代谢两种。体内代谢研究以动物模型为代表，但不同种属的动物与人之间存在较大的差异，尤其是在代谢方面，参与化合物代谢的酶种类、酶的贡献程度、反应类型以及代谢产物等均可能不相同，把动物实验结果外推到人体误差高且准确性低。此外，CYP酶的代谢底物非常广泛，每个CYP 酶都有其特异的代谢谱，开展单种代谢酶对毒物的代谢特征研究就需要得到单一组分的CYP酶，动物体内代谢中参与化合物代谢的酶种类繁多，难以达到目的。随着对CYP酶的深入认识，人们开始通过各种方法得到单一的纯酶，构建各种体外代谢系统，对外源化合物的体外代谢进行研究。最初，人们通过纯化哺乳动物肝或肾中的CYPs 得到单一的纯酶再进行研究，但CYPs 家族中的各种代谢酶的性质非常接近，很难得到纯酶，或者产量很低。到了20 世纪90 年代，随着分子生物学、生物化学的飞速发展，通过在异源表达系统中表达得到纯CYPs酶已成为得到单一纯酶并进而开展化学物体外代谢的主要方法手段。
到目前为止，几个常用的表达体系，如细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等系统都已被用于CYP450s 的表达。其中杆状病毒昆虫细胞（Baculovirus/Sf9）表达系统可高效表达外源基因，且昆虫细胞的蛋白加工和修饰方式与哺乳动物细胞相似，可实现较为正确的蛋白糖基化、分泌和组织定位表达，且蛋白表达量高，可以高水平表达多种原始的CYP450蛋白。但CYP450蛋白的异源表达除了需要有完整的细胞、亚细胞结构、正确的蛋白糖基化、分泌和组织定位表达外，还需要有血红素等辅助因子的参与，同时CYP450酶活性的发挥还需要细胞色素P450氧化还原酶（POR）、NADPH等辅酶为其提供电子，所以如何在各种异源表达系统中得到高量、有酶活性的CYP450蛋白成为了化合物体外代谢的关键点和难点。
如前所述，CYP450s酶类需要在血红素铁上加入两个电子（即被还原后）才能行使其活性，这种电子一般由与CYP450短暂结合的蛋白作为电子供体，从辅基中传递而提供。哺乳动物CYP450s作为膜结合蛋白质，有些位于线粒体内膜，有些位于内质网，共有两条不同的电子传递链，CYP450s的位置不同电子传递链也不同，在内质网中为CYP450提供电子的蛋白是POR蛋白。人的POR蛋白是一种膜结合的黄素蛋白，它由相同比例的FMN和FAD黄素蛋白组成，存在于大多数真核细胞中，是一些内质网结合的加氧酶蛋白的电子供体蛋白，它可以从NADPH为CYP450s提供电子。
为系统研究CYP450 对化合物的代谢活化作用，提高体外代谢反应效率，因此研究CYP450和POR非常有必要。但采用经典方法制备CYP450和POR的时，发现其得率很低，难以满足研究需求。本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，使得CYP450和POR能高效表达且活性较高。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于：本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，使得CYP450和POR能高效表达且活性较高。
技术方案
一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤4所述的有关辅助因子的4种条件之一：①0.5-6μg/ml Hemin；②0.05-0.6mM 5-ALA；③0.01-0.4mM Fe3+；④0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物。最优化的条件为0.2 mM 5-ALA与0.02mM Fe3+混合物。
具体制备方法如下（以CYP2A13和POR为例）：
1、重组转移载体pFastBac1-CYPs/POR质粒的构建与鉴定
pFastBac1-CYP2A13为本实验室保存。双酶消化重组质粒pcDNA3.1(+)/POR和转移质粒载体pFastBacTM 1 ，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段。用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBac1-POR。经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA。使用双酶切消化验证pFastBac1-CYP2A13和pFastBac1-POR。
2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBac1-CYPs/POR重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYPs/POR的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用PCR反应进行验证。
3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR的获得
在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液（含青霉素100 IU/ml；链霉素100 μg/ml），27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。
4、重组CYP450s/POR蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的CYP450蛋白。感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后-80℃保存备用。以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳，以免疫印迹法检测CYP2A13和POR蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析。
5、CO-差示光谱法检测CYP450蛋白活性
采用CO差示光谱法检测CYP450蛋白酶活性：微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀释至1mg/ml，取1ml加入到1cm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混匀后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混匀使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒体蛋白中CYP450蛋白的含量。
6、细胞色素C分析法检测POR蛋白活力
在1cm光径的比色皿中加入0.84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0.1ml 0.8 mM细胞色素C，再加入20μl稀释适当倍数的微粒体悬液，混匀后测定blank，然后加入50μl 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混匀，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。
有益效果
1，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mM Fe3+和0.2mM 5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2 pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。
2，该条件的优化和建立，为体外高效表达外源代谢酶并开展药物和毒物的体外代谢研究提供了重要的平台。该条件具有一定的普适性，可适用于多种体外活性蛋白的表达。一经推广，将产生良好的社会效益和可观的经济效益。
附图说明
图1. 不同条件辅助因子对CYP2A13表达的影响，其中A为Immunoblotting检测加入不同浓度的Hemin后CYP2A13蛋白表达差异，B为A图经过Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析后的结果；C为Immunoblotting检测加入不同浓度的5-ALA后CYP2A13蛋白表达差异，D为C图经过Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析后的结果；E为Immunoblotting检测加入不同浓度的Fe3+后CYP2A13蛋白表达差异，F为E图经过Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析后的结果；G为Immunoblotting检测加入不同条件的辅助因子后CYP2A13蛋白表达差异，H为G图经过Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析后的结果。
图2. 不同条件辅助因子对CYP2A13活性的影响，其中A为加入不同条件的辅助因子后所表达的CYP2A13的特征吸收峰图；B为使用Sata 7.0软件对CYP2A13蛋白活性进行的统计分析图。
图3. 不同条件辅助因子对POR活性的影响，其中A为加入不同浓度5-ALA后POR蛋白的活性；B为加入不同浓度的Fe3+后POR蛋白的活性；C为加入不同浓度的Hemin后POR蛋白的活性；D为加入不同种类的辅助因子后POR蛋白的活性差异。
图4. 不同病毒效价比例对CYP2A13与POR共表达的影响，其中A为加入不同Ac-Bacmid-CYP2A13病毒效价（MOI，pfu/cell）后CYP2A13蛋白的表达；B为加入不同Ac-Bacmid-POR病毒效价（MOI，pfu/cell）后POR蛋白的表达；C为加入不同效价比例的Ac-Bacmid-CYP2A13和Ac-Bacmid-POR病毒后CYP2A13蛋白的表达；D为加入不同效价比例的Ac-Bacmid-CYP2A13和Ac-Bacmid-POR病毒后POR蛋白的活性变化。
具体实施方式
实施例 1
1、重组转移载体pFastBac1-CYP2A13质粒的构建与鉴定
pFastBac1-CYP2A13为本实验室保存。经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA。使用双酶切消化验证pFastBac1-CYP2A13。
2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP2A13 DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBac1-CYP 2A13重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYP2A13的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac-Bacmid-CYP2A13 DNA，用PCR反应进行验证。
3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13的获得
在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液（含青霉素100u/ml；链霉素100 μg/ml），27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。
4、重组CYP 2A13蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的CYP2A13蛋白。感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后-80℃保存备用。以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳，以免疫印迹法检测CYP2A13蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析。
其中步骤4中辅助因子为0.5-6μg/ml Hemin。
实施例2
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0.05-0.6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。
实施例3
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0.01-0.4mM Fe3+不同外，其他皆相同。
实施例4
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物不同外，其他皆相同。
实施例5
将实施例1-4所生成的重组CYP 2A13蛋白，利用CO-差示光谱法检测CYP2A13蛋白活性
采用CO差示光谱法检测CYP2A13蛋白酶活性：微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀释至1mg/ml，取1ml加入到1cm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混匀后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混匀使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒体蛋白中CYP450蛋白的含量。
结果：CYP2A13体外表达及活性的条件优化
为了增强昆虫细胞-杆状病毒表达系统用于表达CYP450s的实用性，我们在进行CYP2A13蛋白的表达时加入了Hemin、5-ALA和/或Fe3+，观察不同条件辅助因子对蛋白表达水平和活性的影响。
图1所示，CYP2A13蛋白在45kD左右有条带，说明蛋白在Bac-to-Bac系统中成功表达（A，C，E，G）。经灰度值扫描分析，在加入1μg/ml Hemin，0.2mM 5-ALA或0.02 mM Fe3+时，CYP2A13蛋白表达量比其他浓度各辅助因子高（B，D，F）。对于单独加入0.2mM 5-ALA或0.02 mM Fe3+，同时加入0.2mM 5-ALA和0.02mM Fe3+时，CYP2A13蛋白的表达最高（图H）。
此外，研究了不同辅助因子对CYP2A13活性的影响。结果同样发现，同时加入0.2mM 5-ALA和0.02mM Fe3+时，CYP2A13蛋白的活性也明显高于其他单独给予的辅助因子（图2）。
实施例6
1、重组转移载体pFastBac1- POR质粒的构建与鉴定
双酶消化重组质粒pcDNA3.1(+)/POR和转移质粒载体pFastBacTM 1 ，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段。用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBac1-POR。经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA。使用双酶切消化验证pFastBac1-POR。
2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid- POR DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBac1- POR重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各POR的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac-Bacmid- POR DNA，用PCR反应进行验证。
3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid- POR的获得
在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液（含青霉素100u/ml；链霉素100 μg/ml），27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。
4、重组POR蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的POR蛋白。感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后-80℃保存备用。
其中步骤4中辅助因子为0.5-6μg/ml Hemin。
实施例7
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0.05-0.6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。
实施例8
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0.01-0.4mM Fe3+不同外，其他皆相同。
实施例9
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物不同外，其他皆相同。
实施例10
将实施例6-9所生成的重组POR蛋白，利用细胞色素C分析法检测POR蛋白活力
在1cm光径的比色皿中加入0.84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0.1ml 0.8 mM细胞色素C，再加入20μl稀释适当倍数的微粒体悬液，混匀后测定blank，然后加入50μl 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混匀，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。
结果：POR蛋白表达及活性的条件优化
比较了不同浓度的Hemin、5-ALA、Fe3+对POR表达活性的影响，如图3所示，在加入0.5μg/ml Hemin，0.2mM 5-ALA或0.02 mM Fe3+时，POR蛋白表达活性比其他浓度各辅助因子高（图3.A，B，C）。相对单独加入0.2mM 5-ALA或0.02 mM Fe3+，同时加入0.2mM 5-ALA和0.02mM Fe3+时，POR蛋白的表达活性最高（图3.D）。
实施例11
将实施例1步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13，在辅助因子为0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物时，通过加入MOI为1-5 pfu/细胞，按实施例1步骤4的方法表达CYP2A13蛋白，并运用免疫印迹法进行鉴定。
实施例12
将实施例6步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-POR，在辅助因子为0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物时，通过加入MOI为1-6 pfu/细胞，按实施例6步骤4的方法表达POR蛋白，并运用免疫印迹法进行鉴定。
实施例13
在辅助因子为0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物时，将实施例1步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13和实施例6步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-POR，按照CYP2A13-MOI和POR-MOI的比例为5/0-5/6进行配比，按实施例1步骤4的方法联合表达CYP2A13蛋白和POR蛋白。运用免疫印迹法进行鉴定CYP2A13蛋白，运用实施例10的方法测定POR蛋白活力。
结果：CYP2A13和POR蛋白共表达的条件优化
在直径为15cm的平皿中接种3×107/皿的Sf9细胞，待细胞贴壁后分别加入不同MOI的CYP2A13和POR病毒，加入0.02mM Fe3+和0.2mM 5-ALA，27℃培养，以表达有活性的CYP450蛋白和POR蛋白。
图4A和B所示，经免疫印迹检测，发现在分子量72 kD和45 kD位置显示有目的蛋白表达，当CYP2A13 MOI为5pfu/细胞、POR MOI为2 pfu/细胞时，CYP2A13和POR蛋白表达最高。选择CYP2A13 MOI为5pfu/细胞，用不同MOI的POR病毒在Sf9细胞中共表达CYP2A13和POR蛋白。结果显示不同MOI的POR病毒对CYP2A13蛋白表达未有影响（图4. C）。虽然POR活性在相同条件下较单独表达的要低，但随着共表达中POR的MOI的升高出现递增趋势，在MOI为6pfu/细胞时，已基本达到了较高水平，完全可满足体外代谢活性分析的要求（图4. D）。
Claims (2)
1.一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5-6μg/ml Hemin；②0.05-0.6mM 5-ALA；③0.01-0.4mM Fe3+；④0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe3+混合物；
具体制备方法如下：
A、重组转移载体pFastBac1-CYPs/POR质粒的构建与鉴定
双酶消化重组质粒pcDNA3.1(+)/POR和转移质粒载体pFastBacTM 1 ，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段；用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBac1-POR；经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA；使用双酶切消化验证pFastBac1-CYP2A13和pFastBac1-POR；
B、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBac1-CYPs/POR重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYPs/POR的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用PCR反应进行验证；
C、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR的获得
在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h；现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液含青霉素100 IU/ml；链霉素100 μg/ml，27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止；收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液；
D、重组CYP450s/POR蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入辅助因子，以表达有活性的CYP450蛋白；感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后-80℃保存备用；以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳，以免疫印迹法检测CYP2A13和POR蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析；
E、CO-差示光谱法检测CYP450蛋白活性
采用CO差示光谱法检测CYP450蛋白酶活性：微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀释至1mg/ml，取1ml加入到1cm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混匀后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混匀使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒体蛋白中CYP450蛋白的含量；
F、细胞色素C分析法检测POR蛋白活力
在1cm光径的比色皿中加入0.84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0.1ml 0.8 mM细胞色素C，再加入20μl稀释适当倍数的微粒体悬液，混匀后测定blank，然后加入50μl 4mM的NADPH，用封口膜封口后，迅速混匀，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。
2.根据权利要求1所述的一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于步骤D所述的辅助因子为0.2 mM 5-ALA与0.02mM Fe3+混合物。
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