CN102093968B - 用于除臭的复合微生物菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于除臭的复合微生物菌剂。本发明提供的菌剂的活性成分包括绿色木霉(Trichoderma viride)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。微生物除臭工艺作为一种绿色技术，对环境冲击少，不会造成二次污染，具有生态可持续性。本发明提供的微生物菌剂具有良好的除臭性能，除臭效果明显，具有很大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于除臭的复合微生物菌剂。
背景技术
近年来环境问题日益引起人们的关注，尤其是固体垃圾引起的环境问题日益凸显。固体垃圾包括畜禽粪便、生活垃圾等，无论在发达国家还是发展中国家，畜禽粪便已成为固体垃圾的主要来源，对大气、水源与土壤造成了严重污染，危害着人类生活和健康。2000年我国畜禽粪便年产生量已达17.3亿吨，是工业废弃物的2.7倍。由于我国固体垃圾除臭处理系统相对薄弱，大量的固体垃圾散发出难闻的恶臭以及滋生蚊蝇等，严重破坏了人们的生活环境，甚至对人们的健康造成了威胁。因此，如何对固体垃圾进行有效除臭成为一个亟待解决的问题。
同时，畜禽粪便蕴藏着丰富的N、P、K等元素，是巨大的有机肥宝库，其N、P、K总贮量为0.633亿吨，相当于0.493亿吨的尿素、1.194亿吨过磷酸钙和0.338亿吨的氯化钾。因此将其经除臭等无公害处理转化为现代农业所亟需的有机肥，具有良好的经济效益和社会效益。
目前，国内外研究出来的除臭剂已达20余种，有的是直接加入到畜禽粪尿中进行除臭(如沸石、绿矾、磷酸钙pH缓冲剂等)，有的是添加到畜禽饲粮中通过提高日粮营养物质的消化率来达到除臭的目的(如酶制剂、沸石、酸制剂等)。目前的除臭剂主要有以下几种类型：吸附型除臭剂、香料掩蔽型除臭剂、化学除臭剂、酶制品除臭剂、微生物型除臭剂、植物型除臭剂、复合型除臭剂等。基于物理除臭和化学除臭具有成本高，牺牲部分肥力或难以大规模应用等不足，生物除臭已成为治理恶臭的重要方法。近年来的许多研究表明，在堆肥过程中添加微生物复合菌剂能加速有机碳的分解、减少氮素损失，减少堆制过程中氨气的挥发，缩短发酵时间，提高堆肥品质。采用微生物菌剂进行除臭具有脱臭率高、无二次污染、所需设备简单、易操作、费用低廉、管理维护方便等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于除臭的复合微生物菌剂。
本发明提供的除臭剂，它的活性成分包括绿色木霉(Trichoderma viride)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
所述活性成分还可包括巴氏醋杆菌(Acetobacter pastuerianusi)。
所述活性成分可由绿色木霉(Trichoderma viride)、巴氏醋杆菌(Ace tobac terpastuerianusi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobaciilus plantarum)组成。
所述绿色木霉、所述巴氏醋杆菌、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例可为(0.9-1.1)∶(0.7-0.9)∶(0.4-0.6)∶(0.4-0.6)∶(0.7-0.9)。所述绿色木霉、所述巴氏醋杆菌、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例具体可为(0.9-1.0)∶(0.7-0.8)∶(0.4-0.5)∶(0.4-0.5)∶(0.7-0.8)。所述绿色木霉、所述巴氏醋杆菌、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例具体可为(1.0-1.1)∶(0.8-0.9)∶(0.5-0.6)∶(0.5-0.6)∶(0.8-0.9)。
所述活性成分具体可由绿色木霉(Trichoderma viride)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lac tobacillus plan tarum)组成。
所述绿色木霉、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例可为(0.9-1.1)∶(0.4-0.6)∶(0.4-0.6)∶(0.7-0.9)。所述绿色木霉、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例具体可为(0.9-1.0)∶(0.4-0.5)∶(0.4-0.5)∶(0.7-0.8)。所述绿色木霉、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例具体可为(1.0-1.1)∶(0.5-0.6)∶(0.5-0.6)∶(0.8-0.9)。
所述绿色木霉具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30166的菌株。所述巴氏醋杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC10600的菌株。所述产朊假丝酵母具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20060的菌株。所述酿酒酵母具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20065的菌株。所述植物乳杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 11016的菌株。
所述的除臭剂可用于固体生活垃圾和/或畜禽粪便除臭。
微生物除臭工艺作为一种绿色技术，对环境冲击少，不会造成二次污染，具有生态可持续性。本发明提供的微生物菌剂具有良好的除臭性能，除臭效果明显，具有很大的实用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。CFU(colony formine unit)即菌落形成单位。
以下菌株均获自中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural CultureCollection of China，简称ACCC)：
绿色木霉(Trichoderma viride)：ACCC保藏编号为30166，简称ACCC30166；
巴氏醋杆菌(Acetobacter pastuerianus)：ACCC保藏编号为10600，简称ACCC10600；
产朊假丝酵母(Candida utilis)：ACCC保藏编号为20060，简称ACCC20060；
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：ACCC保藏编号为20065，简称ACCC20065；
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)：ACCC保藏编号为11016，简称ACCC11016；
乳酸菌J。
后续所用的试剂如下：
2％硼酸溶液：硼酸20.41g和蒸馏水1000ml混合。
50g/L乙酸锌(醋酸锌)溶液：称取50g乙酸锌溶于少量蒸馏水中，加入1-2滴冰醋酸，搅动至溶液变清亮，加入1-2滴乙醇，用蒸馏水定容至1L。
0.1％溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.10g溴甲酚绿，溶于乙醇，用乙醇定容至100ml。
0.2％甲基红乙醇溶液配制：称取0.20g甲基红，溶于乙醇，用乙醇定容至100ml。
甲基红-溴甲酚绿指示剂：3体积的0.1％溴甲酚绿乙醇溶液与1体积的0.2％甲基红乙醇溶液混合。
碘标准溶液[c(1/2I2)＝0.1mol/L]：称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中，用蒸馏水定容至至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。
0.005mol/L硫酸溶液：硫酸0.005mol，用蒸馏水定容至1L。
0.05ml/L硫代硫酸钠溶液：称取13g五水硫代硫酸钠，0.5g碳酸钠，用蒸馏水定容至1L，缓慢煮沸10min，盛于棕色瓶中。
0.5％淀粉指示液：1g淀粉加蒸馏水10ml，注入200ml煮沸的蒸馏水中，微沸2min。
盐酸(1+1)溶液：将1体积水和1体积37％盐酸。
固体垃圾产生的臭气的主要成分是氨气和硫化氢，对人畜的危害很大，实施例中主要采用氨气检测、硫化氢检测和感官检测对微生物菌剂的除臭能力进行评价。
氨气检测方法：利用强酸制弱酸的化学性质；用2％硼酸溶液吸收气体中的氨气，然后用0.005mol/L硫酸溶液滴定，滴定时先滴加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂5-6滴于吸收了氨气的硼酸溶液中，再用0.005mol/L硫酸溶液滴定直至变粉红色即到终点，根据硫酸溶液的用量(体积)计算氨气含量。测定中一定要注意防止温度变化造成的氨气在吸收过程中挥发而影响测定的精确性，滴定的过程中要操作认真，尽量减少误差，同时要做空白对照试验以减小误差。
反应方程式为：(1)NH3+H3BO3→NH4H2BO3；
(2)NH4H2BO3+H2SO4→(NH4)2SO4+2H3BO3；
氨气的物质的量的计算公式：n1＝0.005*(V1-V01)*10-3；n1-氨气的物质的量(mol)，0.005-硫酸的物质的量浓度(mol/L)，V1-试液滴定时硫酸溶液的用量(ml)，V01-空白滴定时硫酸溶液的用量(ml)。
硫化氢检测方法：碘量法是一种经典的化学分析方法，具有指示剂灵敏、方法准确可靠、检测限低、操作简单等优点，碘量法的原理是用醋酸锌吸收原料气中的硫化氢，在微酸性溶液中加过量碘标准滴定溶液把S2-氧化成单质S，剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定，根据硫代硫酸钠溶液消耗量，计算硫化氢含量；将5mL碘标准溶液、5mL盐酸(1+1)溶液加入吸收了硫化氢的50g/L醋酸锌溶液中，密闭反应5分钟，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，近终点时滴加0.5％淀粉指示剂，至变为无色，记录所用的硫代硫酸钠溶液的体积，即可计算出硫化氢的含量。实验过程中盐酸、碘混合液加入吸收液中时，不宜过快，也不宜过热，以免硫化氢及碘蒸发，同时要做空白对照试验以减小误差。
碘量法滴定的反应式：(1)H2S+Zn2+→ZnS ↓+2H+；
(2)ZnS+I2→Zn2++2I-+S ↓；
(3)I2+2S2O3 2-→2I-+S4O6 2-；
硫化氢的物质的量的计算公式：n2＝[0.5-0.05*(V02-V2)/2]*10-3；n2-硫化氢的物质的量(mol)，0.5-标准碘液的物质的量(mol)，0.05-硫代硫酸钠溶液的物质的量浓度(mol/L)，V02-空白滴定时硫代硫酸钠溶液的用量(ml)，V2-试液滴定时硫代硫酸钠溶液的用量(ml)。
实施例1、培养基和菌种的准备
一、培养基的制备
醋酸菌液体培养基(pH6.8)：由葡萄糖100g、酵母膏10g、碳酸钙20g和蒸馏水1000ml组成(固体培养基加入琼脂15-20g)。
GPYA液体培养基：由葡萄糖40g、蛋白胨5g、酵母膏5g和蒸馏水1000ml组成(固体培养基加入琼脂15-20g)。
MRS改良液体培养基(pH 6.1-6.3)：由牛肉蛋白胨10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、磷酸氢二钾2g、MnSO4.H2O 0.05g、蔗糖20g和蒸馏水1000ml组成(固体培养基加入琼脂15-20g)。
马铃薯液体培养基(PDA)：由马铃薯200g(去皮的马铃薯切成小块，煮沸30分钟过滤去滤液)、葡萄糖20g和蒸馏水1000ml组成(固体培养基加入琼脂15-20g)。
发酵除臭基质：每份发酵除臭基质由干鸡粪60g、秸秆粉10g和水组成，含水量为50％。
二、菌种的活化
绿色木霉接种在PDA培养基上，产朊假丝酵母和酿酒酵母接种在GPYA培养基上，巴氏醋杆菌接种在醋酸菌培养基上，植物乳杆菌和乳酸菌J接种在MRS改良培养基上。植物乳杆菌和乳酸菌J 37℃培养，其它菌种28℃培养。
将绿色木霉(ACCC30166)、巴氏醋杆菌(ACCC10600)、产朊假丝酵母(ACCC20060)、酿酒酵母(ACCC20065)、植物乳杆菌(ACCC11016)和乳酸菌J分别进行斜面转接，接入相应斜面培养基，活化培养2-3天。
实施例2、菌株间的相互拮抗实验
将活化后的绿色木霉(ACCC30166)、巴氏醋杆菌(ACCC10600)、产朊假丝酵母(ACCC20060)、酿酒酵母(ACCC20065)、植物乳杆菌(ACCC11016)和乳酸菌J进行菌株间的相互拮抗实验，两两组合，共分成三十种组合方式，每个组合三个平行。
结果见表1。
表1菌种间的拮抗效果
注：“-”表示拮抗反应阴性，“+”表示拮抗反应阳性
试验结果表明乳酸菌J对巴氏醋杆菌和植物乳杆菌有抑制作用，巴氏醋杆菌对乳酸菌J有抑制作用。
实施例3、单个菌株的发酵除臭能力测定
将活化后的绿色木霉(ACCC30166)、巴氏醋杆菌(ACCC10600)、产朊假丝酵母(ACCC20060)、酿酒酵母(ACCC20065)、植物乳杆菌(ACCC11016)和乳酸菌J分别用液体培养基培养3天(植物乳杆菌和乳酸菌J 37℃培养，其它菌种28℃培养)，得到各个菌株的菌液。
将各个菌株的菌液分别进行如下实验：将菌液接在发酵除臭基质内，于500mL烧杯中混匀(每份发酵除臭基质接种10mL菌液)，作为实验样本，设置发酵除臭基质作为对照样本，各样本用牛皮纸及一层塑料纸封口。每个样本(六种实验样本和一种对照样本)设置三个平行处理，每个平行处理设置三个重复，结果取三个重复的平均值。在第一个平行中放置内盛20mL的2％硼酸溶液的小烧杯用以吸收发酵过程中产生的氨气，第7天用酸滴定法测定；在第二个平行中放置内盛20mL的50g/L乙酸锌溶液用以吸收发酵过程中产生的硫化氢，第7天用碘量法测定；第三个平行，第7天进行感官测定。
结果见表2。
表2单个菌的发酵除臭能力
注：“+”的多少表示感官测定臭气等级，“+”越多表示感官测定越臭。
结合感官检测和氨气和硫化氢含量的检测结果表明，绿色木霉除臭效果最为显著，其次为巴氏醋杆菌、乳酸菌J、植物乳杆菌，再次为产朊假丝酵母和酿酒酵母。
实施例4、复合菌剂的发酵除臭能力测定
根据实施例2和实施例3的结果，将除臭效果好且无拮抗反应的菌株，组合成复合微生物除臭菌剂。
一、复合菌剂的制备
将活化后的绿色木霉(ACCC30166)、巴氏醋杆菌(ACCC10600)、产朊假丝酵母(ACCC20060)、酿酒酵母(ACCC20065)、植物乳杆菌(ACCC11016)和乳酸菌J分别用液体培养基培养3天(植物乳杆菌和乳酸菌J 37℃培养，其它菌种28℃培养)，得到各个菌株的菌液。绿色木霉菌液的OD600值为2.2，巴氏醋杆菌菌液的OD600值为2.8，产朊假丝酵母菌液的OD600值为3.0，酿酒酵母菌液的OD600值为3.0，植物乳杆菌菌液的OD600值为1.8，乳酸菌J菌液的OD600值为1.8。
复合菌剂甲：将绿色木霉、巴氏醋杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液按一定比例混合(即5种菌的CFU比例为0.9-1.1∶0.7-0.9∶0.4-0.6∶0.4-0.6∶0.7-0.9)，得到复合菌剂甲。复合菌剂乙：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液按一定比例混合(即4种菌的CFU比例为0.9-1.1∶0.4-0.6∶0.4-0.6∶0.7-0.9)，得到复合菌剂乙。复合菌剂丙：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和乳酸菌J的菌液按一定比例混合(即4种菌的CFU比例为0.9-1.1∶0.4-0.6∶0.4-0.6∶0.7-0.9)，得到复合菌剂丙。
复合菌剂甲-I：将绿色木霉、巴氏醋杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶巴氏醋杆菌∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝1∶0.8∶0.5∶0.5∶0.8；CFU比值)，得到复合菌剂甲-I。
复合菌剂甲-II：将绿色木霉、巴氏醋杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶巴氏醋杆菌∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝0.9∶0.9∶0.6∶0.6∶0.9；CFU比值)，得到复合菌剂甲-II。
复合菌剂甲-III：将绿色木霉、巴氏醋杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶巴氏醋杆菌∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝1.1∶0.7∶0.4∶0.4∶0.7；CFU比值)，得到复合菌剂甲-III。
复合菌剂乙-I：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝1∶0.5∶0.5∶0.8；CFU比值)，得到复合菌剂乙-I。
复合菌剂乙-II：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝0.9∶0.6∶0.6∶0.9；CFU比值)，得到复合菌剂乙-II。
复合菌剂乙-III：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和植物乳杆菌的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶植物乳杆菌＝1.1∶0.4∶0.4∶0.7；CFU比值)，得到复合菌剂乙-III。
复合菌剂丙-I：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和乳酸菌J的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶乳酸菌J＝1∶0.5∶0.5∶0.8)，得到复合菌剂丙-I。
复合菌剂丙-II：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和乳酸菌J的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶乳酸菌J＝0.9∶0.6∶0.6∶0.9)，得到复合菌剂丙-II。
复合菌剂丙-III：将绿色木霉、产朊假丝酵母、酿酒酵母和乳酸菌J的菌液混合(绿色木霉∶产朊假丝酵母∶酿酒酵母∶乳酸菌J＝1.1∶0.4∶0.4∶0.7)，得到复合菌剂丙-III。
9种复合菌剂的菌种组合情况见表3。
表3菌种组合情况
(“√“表示含有这种菌，“-”表示不含这种菌)
二、复合菌剂的发酵除臭能力测定
将各种复合菌剂分别进行如下实验：将复合菌剂接在发酵除臭基质内，于500mL烧杯中混匀(每份发酵除臭基质接种10mL复合菌剂)，作为实验样本，设置发酵除臭基质作为对照样本，各样本用牛皮纸及一层塑料纸封口。每个样本设置三个平行处理，每个平行处理设置三个重复，结果取三个重复的平均值。在第一个平行中放置内盛20mL的2％硼酸溶液的小烧杯用以吸收发酵过程中产生的氨气，第7天用酸滴定法测定；在第二个平行中放置内盛20mL的50g/L醋酸锌溶液用以吸收发酵过程中产生的硫化氢，第7天用碘量法测定；第三个平行，第7天进行感官测定。
结果见表4。
表4复合菌剂的除臭检测
注：“+”的多少表示感官测定臭气等级，“+”越多表示感官测定越臭。
以上三种复合微生物除臭菌剂以复合菌剂甲的除臭效果最好，复合菌剂乙和复合菌剂丙也有一定除臭效果。复合菌剂甲的除臭效果明显好于单个菌株的除臭效果，具有很大的实用价值，可被用于固体生活垃圾及畜禽粪便除臭。
Claims (8)
1.一种除臭剂，它的活性成分包括绿色木霉(Trichoderma viride)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
2.如权利要求1所述的除臭剂，其特征在于：它的活性成分由绿色木霉(Trichoderma viride)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pastuerianusi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成。
3.如权利要求2所述的除臭剂，其特征在于：所述绿色木霉为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30166的菌株；所述巴氏醋杆菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 10600的菌株；所述产朊假丝酵母为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20060的菌株；所述酿酒酵母为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20065的菌株；所述植物乳杆菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 11016的菌株。
4.如权利要求2或3所述的除臭剂，其特征在于：所述绿色木霉、所述巴氏醋杆菌、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例为(0.9-1.1)∶(0.7-0.9)∶(0.4-0.6)∶(0.4-0.6)∶(0.7-0.9)。
5.如权利要求1所述的除臭剂，其特征在于：它的活性成分由绿色木霉(Trichoderma viride)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成。
6.如权利要求5所述的除臭剂，其特征在于：所述绿色木霉为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 30166的菌株；所述产朊假丝酵母为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20060的菌株；所述酿酒酵母为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 20065的菌株；所述植物乳杆菌为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 11016的菌株。
7.如权利要求5或6所述的除臭剂，其特征在于：所述绿色木霉、所述产朊假丝酵母、所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌的CFU比例为(0.9-1.1)∶(0.4-0.6)∶(0.4-0.6)∶(0.7-0.9)。
8.权利要求1至7中任一所述的除臭剂在固体生活垃圾和/或畜禽粪便除臭中的应用。
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