CN102086456A - 一种湿地嗜油产碱杆菌的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种湿地嗜油产碱杆菌的基因及其应用。本发明分离、筛选出的嗜油菌的基因表明其为产碱杆菌，具有较好降解高浓度柴油污水的功能。这就拓宽了人们对产碱杆菌属在其功能方面应用研究思路，并为降解高浓度柴油污水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。

Description

一种湿地嗜油产碱杆菌的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种湿地嗜油产碱杆菌的基因及其应用。

背景技术

在油污染环境中存在着一定数量的微生物，这些微生物对受油污染环境有较好的适应能力。初筛选出的嗜油微生物经过驯化后，即可作为嗜油微生物菌株应用到油污染废水与污泥的处理实践中。黄浦江作为上海市水上运输的主干道，过往船只突发性污染泄漏事故的风险较高，溢油事件时有发生，使黄浦江-长江口附近湿地生态系统受到了一定程度的污染。湿地的微生物修复技术相比于土壤的微生物修复技术起步较晚，许多修复措施主要是借鉴土壤微生物修复措施。而湿地环境与土壤环境的风化过程、温度、可利用的氧浓度、可利用的营养基质浓度、pH以及盐度等环境因素的特点有所不同，因此探索适合于湿地环境的微生物修复技术就变得非常重要。从黄浦江-长江口岸边湿地油污土壤中筛选出嗜油微生物，结合这些微生物的最宜生长条件与特性，将其应用于柴油的降解并研究其降解特性。

微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学方法。经典分类方法主要指依据形态特征、培养特征及生理生化特征等分类方法。分子生物学分类法，又称分子分类方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分类的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。

目前，16S rDNA序列分析的方法主要有两种：一种是16S rDNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序，另一种是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。更进一步的可靠方法是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，将该序列做成感受态细胞，质粒扩增，然后对质粒进行测序。这是一种研究rDNA同源性最直接可靠的方法。

目前已发现自然界中能够降解石油污染物的微生物有100多个属，200多个种，分别属于细菌、真菌和藻类等。其中降解石油污染物的细菌主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Archrobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、棒状杆菌属(Coryneforms)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)诺卡氏菌属(Nocardia)和分支杆菌属(Mycobacterium)。常见的石油降解真菌主要有木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicilium)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)和镰刀霉属(Fusarium)中的一些菌株。细菌和真菌是土壤石油生物降解的最基本的作用者。能够降解石油烃类物质的酵母主要有假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、球拟酵母属(Torulopsis)、酵母菌属(Saccharomyces)和掷孢酵母属(Sporobolomyces)等中的菌株，以假丝酵母最为广泛。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种湿地嗜油产碱杆菌的基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目的之二在于提供该基因在降解废水、污泥中的油污中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种湿地嗜油产碱杆菌的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

2)与SEQ ID NO：1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

一种上述的湿地嗜油产碱杆菌的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

2)通过将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白具有相同的生物学功能。

一种重组载体，其特征在于该重组载体含有上述的湿地嗜油产碱杆菌的基因。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有上述的重组载体。

上述的一种湿地嗜油产碱杆菌的基因在降解废水、污泥中的油污中的应用。

一种克隆上述的湿地嗜油产碱杆菌的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

i.从油污湿地筛选的湿地产碱杆菌菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因；

ii.对上述提取的16S rDNA基因进行PCR扩增，采用了如下的扩增条件和扩增的引物：

PCR扩增条件为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸8min；

PCR扩增的引物是：

P1正向引物为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；

P2反向引物为：5’GGTTACCTTGTTACGACTT；

PCR产物的回收；

iii.采用SK2211-T-载体PCR产物克隆目的片断TA克隆。

iv.连接产物转化；

v.蓝白斑筛选；

vi.质粒提取，最终得到湿地嗜油产碱杆菌的基因全序列。

本发明的湿地嗜油产碱杆菌的基因的序列全长为1178个核苷酸。

采用BLAST分析法，将嗜油产碱杆菌M4的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与产碱杆菌有很高的同源性。将其应用于柴油污水的处理中，考察其对油污的降解率特征。油污降解率计算公式如下：

菌株对油污降解率＝(空白含油率-接菌含油率)/空白含油率×100％

菌株一周内对柴油的去除率为56.38％，降解率为15.21％。经气相色谱测定各组分特征，可见其对于C₁₈～C₂₄范围内的正构烷烃均具有较好的降解效果。本发明的湿地嗜油产碱杆菌的基因对柴油污染具有较好的降解效果。

附图说明

图1本发明嗜油产碱杆菌(alcaligenes)M4的生长曲线

图2本发明嗜油产碱杆菌(alcaligenes)M4的适宜生长温度

图3本发明嗜油产碱杆菌(alcaligenes)菌M4的适宜生长pH值

图4本发明嗜油产碱杆菌(alcaligenes)M4的适宜生长盐度

图5本发明嗜油产碱杆菌(alcaligenes)M4降解柴油各组分特征

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

一、嗜油菌的基因全序列测定

采用BLAST分析法，将该嗜油菌的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与假单胞菌有很高的同源性。由此可以从分子水平确定该菌株是假单胞菌。同明，结合经典分类方法所获得的形态及生理生化特征，最终确定该菌株是产碱杆菌(alcaligenes)。本发明从油污湿地筛选的湿地产碱杆菌菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因、16S rDNA基因PCR扩增、PCR产物的回收，将DNA片断进行TA克隆，制备感受态细胞，提取质粒进行16S rDNA的全序列测定和分析，来获取菌株的16S rDNA基因全序列。本发明提供的嗜油产碱杆菌(alcaligenes)M4的16S rDNA全序列。

上述步骤具体如下：

1)基因组提取采用生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，从油污湿地筛选的湿地产碱杆菌菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因。

2)在16S rDNA基因的PCR扩增过程中，采用了如下的扩增条件和扩增的引物：

PCR扩增条件为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸8min；

PCR扩增的引物是：P1正向引物为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’20bp，P2反向引物为5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’19bp；

3)PCR产物的回收：采用SK1131-UNIQ-10DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA片断；

4)采用SK2211-T-载体PCR产物克隆试剂盒目的片断TA克隆。

①连接反应

1μl         10×Ligation Buffer

1μl         50％PEG

50ng         pUCm-T Vector

0.2pmol      PCR Product

xμl         H₂O

2.5U         T4 DNA Ligase

Final Volume 10μl

注意：一般最后加入T4 DNA Ligase，16～23℃连接1～2小时。

②连接产物转化

使用生工SSCS快速一步法试剂制备感受态细胞，产品编号SK2301。转化步骤如下：将100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；加入10μl连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟；42℃水浴热激90秒。冰上放置15～20分钟；加400μl SOC培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20μl 100mM IPTG和100μl 20mg/mlX-gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

③蓝白斑筛选

当外源DNA片段插入到pUCm-T中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。

5)质粒提取

使用生工质粒提取试剂盒SK1191的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取DNA(附件5)。6)在Applied Biosystem 3730测序仪上测序，然后用BLAST软件，将测得的16S rDNA全序列与GenBank数据库比较分析，最终确定其为假单胞菌的基因全序列。

二、嗜油菌株筛选方法及其应用

(一)材料与方法

1、菌源和菌采集环境

(1)菌源：黄浦江-长江口湿地(N31°23’5.4”E121°30’28.3”)受石油类污染沉积物；

(2)沉积物基本理化性质见表1所列。

表1黄浦江-长江口湿地沉积物性质分析

2、供试柴油

供试柴油为零号柴油：上海市宝山区中石化明和加油站购买。

3、培养基

分离(完全)培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠5g；蒸馏水1000ml；

筛选培养基：K₂HPO₄ 1g，KH₂PO₄ 1g，NaCl 0.5g，NH₄(SO₄)₂ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，KNO₃ 0.2g，CaCl₂ 0.02g，NaCl 0.5g，FeCl₃痕量，维生素母液0.1ml，8.46～84.6g柴油，蒸馏水1000ml，pH 7.5；

维生素母液：硫胺素10mg、核黄素5mg、维生素B65mg、泛酸钙20mg、对-氨基苯甲酸5mg、烟碱5mg、肌醇100mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4μm滤膜过滤除菌；

扩大培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠5g；蒸馏水1000ml；柴油42.3g/L；

以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用。

4、实验仪器和设备

常用小型设备：恒温振荡器，光照生物培养箱，蒸汽灭菌锅，755型分光光度计，超声波清洗机，光学显微镜，超净工作台，pH计；

中大型仪器：PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司)；3730测序列分析仪(美国ABI公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)；YXJ-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司)H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；凝胶成像系统(Gene Genius公司)；Agilent 6890 GC。

(二)菌株的分离与筛选

1、菌胶团的破碎

取10g黄浦江-长江口湿地油污土壤，加入事先灭菌好的装有100ml无菌水与玻璃珠的250ml的三角瓶内，并加入5ml pH为7.4的Tris缓冲液，摇床振荡，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用。

2、嗜油菌种的分离

用无菌移液管吸取10ml上述泥水混合物，加入分离培养基90ml，30℃恒温培养5天，待本三角瓶内培养基变混浊，说明细菌已经生长，然后平板稀释涂布，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，直至获得单一菌株，并于斜面培养基上斜面保存。

3、嗜油菌种的筛选

挑取上述分离出的单菌落，分别接种于筛选培养基内，30℃恒温培养5～7天，观察菌悬液的混浊情况，油滴分散且菌悬液变混浊的即为筛选出的嗜油菌株。并不停提高接种的培养基中柴油浓度，经过筛选，得到一株嗜油菌株。将其自斜面接入种子培养基中，置30℃，150r/min震荡培养12h后，按1％转入盛有100mL培养基的三角瓶中培养，每隔2小时取样，分光光度计测定OD600吸收值。得到嗜油菌在培养基中生长情况如图1所示。

4、嗜油菌适宜生长条件的选择

耐温性：接种一环菌种接入种子培养基中，分别于20，25，30，32，35，40℃下培养48h后用紫外分光光度计于600nm处测量其OD值。

耐酸性：接种一环菌于pH值分别为5，6，7，7.5，8，9，10的种子培养基中，30℃培养48h后于600nm处测OD值。

耐盐性：接种一环菌种于NaCl含量分别为0，0.5％，1.0％，3.0％，5.0％，7.0％的种子培养基中，30℃培养48h后于600nm处测OD值。

该嗜油菌在各种条件下的生长情况如图2、3、4所示。嗜油菌的适宜生长温度为32℃，适宜pH值为7.5，适宜盐度为0～0.5％。

5、嗜油微生物菌株形态与生理特征

菌落乳白色，不透明，圆形凸起，表面光滑有光泽，菌落直径2～3mm。细胞球状，单或成对、成堆出现，无鞭毛。不运动，革兰氏阴性，好氧。最适宜生长pH值：7.5，生长温度：30～35℃。

三、嗜油菌M4的应用

接种单菌落于富集培养基中，30℃培养24h，制成菌悬液，以10％的接种量接入含油无机盐培养基中检测菌株对柴油的降解效果。在扩大培养基中将嗜油菌株M4进行扩大培养，取含油无机盐培养液100ml(含1g柴油)分别加入250ml的锥形瓶中，石油烃浓度为84.6g/L，分别加入菌株的菌悬液5ml，做3个重复，同时做三个不接菌对照。pH7.5，30℃恒温摇床上120rpm，振荡反应7天，菌株对柴油的对柴油的去除率为56.38％，降解率为15.21％。经气相色谱测定具体各组分情况见图5，可见其对于C₁₈～C₂₄间的正构烷烃均具有较好的降解效果。

本发明分离、筛选出的嗜油菌的基因表明其为产碱杆菌，具有较好降解高浓度柴油污水的功能。这就拓宽了人们对产碱杆菌属在其功能方面应用研究思路，并为降解高浓度柴油污水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。

Claims (6)

1.一种湿地嗜油产碱杆菌的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

2)与SEQ ID NO：1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

2.一种根据权利要求1所述的湿地嗜油产碱杆菌的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

2)通过将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白具有相同的生物学功能。

3.一种重组载体，其特征在于该重组载体含有权利要求1所述的湿地嗜油产碱杆菌的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的一种湿地嗜油产碱杆菌的基因在降解废水、污泥中的油污中的应用。

6.一种克隆根据权利要求1所述的一种湿地产碱杆菌的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.从油污湿地筛选的湿地产碱杆菌菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因；

b.对上述提取的16S rDNA基因进行PCR扩增，采用了如下的扩增条件和扩增的引物：

PCR扩增条件为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸8min；

PCR扩增的引物是：

P1正向引物为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；

P2反向引物为：5’GGTTACCTTGTTACGACTT；

c.PCR产物的回收；

d.采用SK2211-T-载体PCR产物克隆目的片断TA克隆。

e.连接产物转化；

f.蓝白斑筛选；

g.质粒提取，最终得到湿地产碱杆菌的基因全序列。

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