CN102080117B - 微生物来源的炎症因子受体拮抗剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物来源的炎症因子受体拮抗剂及其制备方法，其中所述炎症因子受体拮抗活性剂为一种肿瘤坏死因子受体(TNFR)拮抗剂A，其包括A1和A2两种形式。本发明还涉及一种产生所述肿瘤坏死因子受体拮抗剂A的球孢白僵菌A1。本发明还涉及所述肿瘤坏死因子受体(TNFR)拮抗剂A用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体配基过量相关疾病的药物的用途。
Description
发明领域
本发明涉及微生物来源的炎症因子受体拮抗剂及其制备方法，其中所述炎症因子受体拮抗活性剂为一种肿瘤坏死因子受体(TNFR)拮抗剂A，其包括A1和A2两种形式。本发明还涉及一种产生所述肿瘤坏死因子受体拮抗剂A的球孢白僵菌A1。本发明还涉及所述肿瘤坏死因子受体(TNFR)拮抗剂A用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体配基过量相关疾病的药物的用途。
发明背景
炎症是机体对各种损伤的反应，细胞因子在炎症反应加重、修复和慢性化上均起重要作用。已知肿瘤坏死因子(TNF)是炎症反应的重要介质。肿瘤坏死因子通过与细胞表面的受体结合，由信号传导系统将信息传入细胞内而发挥其生物学活性。
肿瘤坏死因子有两种受体，其基因已被分离纯化，阐明了结构。已知这两种受体蛋白质分子量分别为55Kd和75kD，分别称为P55R(TNFR I)和P75R(TNFR II)。细胞表面的TNFR经蛋白酶水解下来的受体片段，存在于人的各种体液中，即可溶性TNF受体，与膜表面相对应，来源于TNFR I的称为sTNFR I，来源于TNFR II的称为sTNFRII。sTNFR对TNF有高亲和力，一旦与TNF结合，阻断TNF与TNFR的结合，从而间接抑制TNF的活性。sTNFR的作用有两方面：在高浓度时sTNFR可拮抗TNF作用；在低浓度时对TNF的结构具有稳定作用。
鉴于细胞因子的受体参与机体的多种生理和/或病理过程，是药物作用的重要靶点。近年来，随着分子生物学在药理学领域中的发展，尤其是人类基因组计划的开展，针对细胞因子的新的受体和亚型不断被发现，所述受体(亚型)的功能以及在疾病发展过程中的作用也逐渐被阐明。这驱使药物研究工作者能够从寻找相应的受体拮抗剂或激动剂出发，一方面通过所述受体的拮抗剂或激动剂研究这些信使物质的生物学功能，另一方面也能够从特异性受体的拮抗剂或激动剂中获得调节机体功能的新的药物。
已知人源sTNFR可以作为天然TNF的拮抗剂，用于治疗与其相应的配基过量有关的疾病，所述疾病包括类风湿关节炎、败血症休克、急慢性髓性败血病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反应等。因此，不同来源的TNFR的拮抗剂长期以来一直受到广泛关注。
本发明人利用TNFR拮抗剂筛选模型，多年来不断对大量微生物来源的代谢产物进行反复筛选，再次获得新的微生物来源的炎症因子受体拮抗剂A。
发明内容
本发明一个方面，利用TNFR受体拮抗剂筛选模型跟踪各个纯化阶段的样品，获得了一种微生物来源的肿瘤坏死因子受体拮抗剂A，其通过如下方法制备：在适于产生所述受体拮抗剂A的条件下培养球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1，以及从球孢白僵菌A1的发酵液中获得所述受体拮抗剂A。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A采用如下方法制备：
1)粗品制备：
将经过滤的球孢白僵菌A1发酵液通过大孔吸附树脂，丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品；
2)纯化：
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的沉淀，经去离子水溶解后，利用TNFR受体拮抗剂筛选模型追踪分析各纯化阶段的样品，依次用DEAE-Sephadex A25柱梯度洗脱组分；用GDX-104型大孔吸附树脂柱处理的洗脱组分经冷干得白色絮状固体，即：本发明所述受体拮抗剂A的一种形式--肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1；
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的上清液，浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱(1cm×30cm)不连续梯度洗脱，利用TNFR受体拮抗剂筛选模型追踪分析各纯化阶段的样品，将活性最高的组分冷干得白色固体，即本发明所述受体拮抗剂A的另一种形式--肿瘤坏因子受体拮抗剂A2。
在本发明的一个实施方案中，所述粗品制备包括：将经过滤的发酵液通过GDX-104型大孔吸附树脂，弃去流出液，用30％丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A纯化过程中对于步骤1)中粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的沉淀，采用如下步骤纯化：
沉淀部分用去离子水溶解，上DEAE-Sephadex A25柱，依次用H2O、0.5N NH4Cl、0.1N HCl梯度洗脱，收集0.1N HCl的洗脱液，用NaOH中和至中性，上GDX-104型大孔吸附树脂柱，用去离子水洗脱至检测不到Cl-离子，接着用30％丙酮洗脱，收集洗脱液，挥去丙酮后冷干，得白色絮状固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A纯化过程中对于步骤1)中粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的上清液，采用如下步骤纯化：
上清液浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱(1cm×30cm)，以水-甲醇系统自100％水至100％甲醇不连续梯度洗脱，流速3ml/15min，每份3ml，共得90份，组分20-25冷干，即得白色粉末肿瘤坏死因子受体拮抗剂A2。
在本发明的一个具体实施方案中，所述球孢白僵菌A1的发酵液通过如下方法制备：
以YM斜面培养基28℃培养7天的球孢白僵菌A1作为菌种，接种于100ml种子培养基中(500ml三角烧瓶装)，26℃振荡培养48小时，然后转种至发酵培养基中，接种量为2％，26℃振荡培养96小时，得到含有本发明所述受体拮抗剂A的发酵液。
在本发明中，所述YM斜面培养基为：酵母粉0.4％，麦芽浸膏粉1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂1.2％，pH＝7.2，10磅消毒。所述100ml种子培养基为：每500ml三角烧瓶装：甘油1％，葡萄糖2％，蔗糖1％，黄豆饼粉0.2％，蛋白胨(F403)1％，KH2PO4 0.03％，聚乙二醇(6000)0.25％，NaNO3 0.3％，(NH4)2SO4 0.3％，pH＝6.0，15磅消毒。所述发酵培养基的组成同种子培养基。
本发明又一方面，还涉及一种产生所述受体拮抗剂A的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1。为满足专利审查要求，本发明人将所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1于2010年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏号CGMCC No.4294。
本发明又一方面，涉及利用所述保藏号为CGMCC4294的球孢白僵菌A1制备所述肿瘤坏死因子受体拮抗剂A的方法，包括：
1)粗品制备：
将经过滤的球孢白僵菌A1发酵液通过大孔吸附树脂，丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品；
2)受体拮抗剂A的纯化：
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的沉淀，经去离子水溶解后，利用TNFR受体拮抗剂筛选模型追踪分析各纯化阶段的样品，依次用DEAE-Sephadex A25柱梯度洗脱组分；用GDX-104型大孔吸附树脂柱处理的洗脱组分经冷干得白色絮状固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1；
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的上清液，浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱(1cm×30cm)不连续梯度洗脱，利用TNFR受体拮抗剂筛选模型追踪分析各纯化阶段的样品，将活性最高的组分冷干得白色固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A2。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A的制备方法中，所述粗品制备步骤包括：将经过滤的发酵液通过GDX-104型大孔吸附树脂，弃去流出液，用30％丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A的制备方法中，所述受体拮抗剂A纯化过程中步骤1)中粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的沉淀，采用如下步骤纯化：
沉淀部分用去离子水溶解，上DEAE-Sephadex A25柱，依次用H2O、0.5N NH4Cl、0.1N HCl梯度洗脱，收集0.1N HCl的洗脱液，用NaOH中和至中性，上GDX-104型大孔吸附树脂柱，用去离子水洗脱至检测不到Cl-离子，接着用30％丙酮洗脱，收集洗脱液，挥去丙酮后冷干，得白色絮状固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A的制备方法中，所述受体拮抗剂A纯化过程中步骤1)中粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的上清液，采用如下步骤纯化：
上清液浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱(1cm×30cm)，以水-甲醇系统自100％水至100％甲醇不连续梯度洗脱，流速3ml/15min，每份3ml，共得90份，组分20-25冷干得白色粉末，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A2。
在本发明的一个具体实施方案中，所述受体拮抗剂A的制备方法中，其中所述球孢白僵菌A1的发酵液通过如下方法制备：
以YM斜面培养基28℃培养7天的球孢白僵菌A1作为菌种，接种于100ml种子培养基中(500ml三角烧瓶装)，26℃振荡培养48小时，然后转种至发酵培养基中，接种量为2％，26℃振荡培养96小时，得到含有本发明所述受体拮抗剂A的发酵液。
本发明的再一方面，涉及所述受体拮抗剂A用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体(TNFR)配基过量相关疾病的药物的用途。在本发明中，所述疾病包括但不限于急性炎症，例如类风湿关节炎、败血症休克、急慢性髓性败血病、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反应。
以下结合实施例，对本发明所述受体拮抗剂及其制备方法和生物活性进一步加以阐述。
实施例1微生物来源的肿瘤坏死因子受体拮抗剂A的制备
在本发明中，采用以下检测抗急性炎症活性的常规方法对微生物代谢产物样品的受体拮抗活性进行跟踪分析。
1、肿瘤坏死因子受体拮抗剂的筛选模型和活性跟踪方法
1.1包被：重组人肿瘤坏死因子(TNF)以0.5μg/ml的浓度溶解于pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中，按每孔100μl量包被96孔板，4℃放置12小时。
1.2封闭：吸去包被液，以3％BSA的PBS溶液每孔250μl封闭96孔板，4℃放置12小时。
1.3洗板：吸去封闭液，用PBS洗板2次。
1.4样品的测定：将hsTNFR按1mg/ml溶于PBS，取60μl与待测样品(调pH7.0)60μl等体积混合，10000r pm，按每孔100μl加入酶标板，4℃放置12小时。同时设两组对照孔，对照1：除不加待测样品外，其他步骤同前。对照2：PBS加显色剂。
1.5洗板：用含有0.1％Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。
1.6加入山羊抗人hs TNFR抗体，按1∶2000稀释在1％BSA的PBS中，每孔加100μl，4℃放置1小时。
1.7洗板：用含有0.1％Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。
1.8加入辣根过氧化物酶标记的马抗山羊I gG抗体，按1∶1000稀释在1％BSA的PBS中，每孔加100μl，4℃放置1小时。
1.9洗板：用含有0.1％Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。
1.10显色：每孔加入显色底物TMB，室温放置45分钟，可观察到样品孔逐渐变蓝。
1.11显色终止与检测：每孔加入2N HCl100μl以终止显色，立即检测吸光度。检测波长为450nm。
2.肿瘤坏死因子受体拮抗剂A的制备
1)微生物培养
以YM斜面培养基(酵母粉0.4％，麦芽浸膏粉1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂1.2％，pH＝7.2，10磅消毒)28℃培养7天的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1作为菌种，接种于100ml种子培养基中(500ml三角烧瓶装，甘油1％，葡萄糖2％，蔗糖1％，黄豆饼粉0.2％，蛋白胨(F403)1％，KH2PO40.03％，聚乙二醇(6000)0.25％，NaNO 30.3％，(NH4)2SO40.3％，pH＝6.0，15磅消毒)，26℃振荡培养48小时，然后转种至发酵培养基(组成同种子培养基)中，接种量为2％，26℃振荡培养96小时，随即放瓶提取。
2)受体拮抗剂A的纯化
发酵液过滤后，滤液通过GDX-104型大孔吸附树脂，弃去流出液，用30％丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品。称取适量粗品，用甲醇充分溶解、离心后，分为上清液和沉淀。
对于沉淀部分，用去离子水溶解，上DEAE-Sephadex A25柱，依次用H2O、0.5N NH4Cl、0.1N HCl梯度洗脱，收集0.1N HCl的洗脱液，用NaOH中和至中性，上GDX-104型大孔吸附树脂柱，用去离子水洗脱至检测不到Cl-离子，接着用30％丙酮洗脱，收集洗脱液，挥去丙酮后冷干，得白色絮状固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1。
对于上清液，浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱(1cm×30cm)，以水-甲醇系统自100％水至100％甲醇不连续梯度洗脱，流速3ml/15min，每份3ml，共得90份，组分20-25冷干，即得白色粉末，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A2。
所得白色絮状固体和白色粉末经肿瘤坏死因子受体拮抗剂的筛选和活性跟踪方法测定，均具有相应的受体拮抗剂活性。
实施例2.微生物来源的肿瘤坏死因子受体拮抗剂活性测定
为研究上述微生物来源的炎症因子受体拮抗剂A的生物学活性--抗急性炎症活性，依据中华人民共和国卫生部药政局新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)(1993年)，采用动物实验，以巴豆油引起的小白鼠耳肿胀模型加以研究。操作步骤如下：
1、将体重25克的昆明种雄性小白鼠，分为3组，每组8只，地塞米松组为阳性对照组，生理盐水组为阴性对照组，受体拮抗剂A1和A2为给药组，腹腔注射给药1小时后，给小鼠右耳耳廓涂巴豆油溶液，20μl/只，致炎。
2、4小时后，颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下双耳，用直径为9mm不锈钢打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用电子天平称重。
3、每鼠右耳片重量减去左耳片重量即为肿胀度。将对照组与给药组的肿胀度进行统计学处理。
4、抗炎强度以抑制率表示。
对于巴豆油引起的小鼠耳肿胀急性炎症，本发明所述受体拮抗剂A1和A2分别在10mg/kg，25mg/kg剂量下均有明显的抑制作用，且随着浓度的加倍，抑制作用也随之增强。见表1所示。
表1受体拮抗剂A对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
*P＜0.01；**P＜0.05
Claims (3)
1.微生物来源的肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1或A2，其采用如下方法制备：
1)粗品制备：
将经过滤的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1发酵液通过GDX-104型大孔吸附树脂，弃去流出液，用30％丙酮洗脱，收集洗脱液并挥干，得深棕色粗品；
2)受体拮抗剂的纯化：
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的沉淀，经去离子水溶解后，上DEAE-Sephadex A25柱，依次用H2O、0.5NNH4Cl、0.1N HCl梯度洗脱，收集0.1N HCl的洗脱液，用NaOH中和至中性，上GDX-104型大孔吸附树脂柱，用去离子水洗脱至检测不到Cl-离子，接着用30％丙酮洗脱，收集洗脱液，挥去丙酮后冷干，得白色絮状固体，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1；
对于步骤1)中的粗品用甲醇溶解并充分离心后所得到的上清液，将上清液浓缩后进行ODS/C-18反相柱色谱，以水-甲醇系统自100％水至100％甲醇不连续梯度洗脱，流速3ml/15min，每份3ml，共得90份，组分20-25冷干得白色粉末，即肿瘤坏死因子受体拮抗剂A2，
其中所述球孢白僵菌A1的发酵液通过如下方法制备：
以YM斜面培养基28℃培养7天的球孢白僵菌A1作为菌种，接种于100ml种子培养基中，26℃振荡培养48小时，然后转种至发酵培养基中，接种量为2％，26℃振荡培养96小时得到所述球孢白僵菌A1的发酵液，所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)A1的保藏号为CGMCC No.4294。
2.权利要求1所述肿瘤坏死因子受体拮抗剂A1或A2用于制备治疗与天然肿瘤坏死因子受体(TNFR)配基过量相关疾病的药物的用途，其中所述疾病为急性炎症或自身免疫性疾病。
3.权利要求2的用途，其中所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
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