CN102078601A - 抗肿瘤组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤组合物及其制备方法，该组合物由氨基酸序列在NCBI数据库中登录号分别为Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi 2148175、Gi 157674463、Gi 505529、Gi 157690694、Gi 116248322、Gi 156603504、Gi 8980621的蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j组成。本发明组合物对多种癌细胞均有抑制作用，制备方法简单，具有较好的市场化前景。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种抗肿瘤组合物及其制备方法。
背景技术
大头金蝇(Chrysomyia megacephala)，别名红头苍蝇，是节肢动物门有颚亚门昆虫纲有翅亚纲双翅目丽蝇科金蝇亚科昆虫的一种。它食物转化率高，生长速度快，繁殖力高，产卵期长，其虫体的蛋白质含量高，饲养条件和养殖设备相对简单，有利于大规模生产。
大头金蝇是一种完全变态的昆虫，生活史包括：卵→幼虫→蛹→成蝇4个阶段。大头金蝇卵为淡黄色，呈香蕉型，长度约一毫米，一克卵大约有7000粒。幼虫呈锥形，前端尖，后端钝圆，有明显的体节，体长为13～16毫米，一克幼虫约有15条，在适宜的温度环境下，成熟幼虫1～2天就可以成蛹，蛹经过5天左右，即可羽化出成虫。成虫体长8～11毫米，金属绿色，身被灰色，复眼红色。
CN101032525A公开了一种从蝇蛆提取分离具有体外抗肿瘤作用的有效组分，该组份从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得，具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖生长的作用，当受试物浓度为250MG/ML时，外源物质诱导的蝇蛆干粉及其不饱和脂肪酸体外抑制人原髓细胞白血病HL-60增殖生长的效果分别为25.5％与96.2％，抑制人肺腺癌A549细胞增殖生长的效果分别为26.8％与97.0％。该组合物由不饱和脂肪酸组成，未明确予以定量，成分复杂，保存过程中易氧化，对其进行活性测试的剂量较大，疗效欠佳。
发明内容
本发明提供了一种抗肿瘤组合物，该组合物对多种肿瘤细胞均有较强的抑制活性。
一种抗肿瘤组合物，由氨基酸序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库中登录号分别为Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi2148175、Gi 157674463、Gi 505529、Gi 157690694、Gi 116248322、Gi156603504、Gi 8980621的蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j组成。
优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为：蛋白a 20～25％、蛋白b 20～25％、蛋白c 1～5％、蛋白d 15～20％、蛋白e 5～10％、蛋白f10～15％、蛋白g 10～15％、蛋白h 1～5％、蛋白i1～5％、蛋白j 1～5％。
更优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为：蛋白a 20～22％、蛋白b 20～22％、蛋白c 2～5％、蛋白d 15～18％、蛋白e 5～7％、蛋白f10～12％、蛋白g 10～12％、蛋白h 1～3％、蛋白i 1～3％、蛋白j 1～3％。
最优选的，所述的抗肿瘤组合物重量百分比组成为：蛋白a 21.97％、蛋白b 21.59％、蛋白c 3.88％、蛋白d 17.26％、蛋白e 5.85％、蛋白f10.82％、蛋白g 10.95％、蛋白h 2.19％、蛋白i 2.74％、蛋白j 2.75％。
本发明还提供了一种上述抗肿瘤组合物的制备方法，包括：
(1)将大头金蝇消毒后驯化2代以上，得到种蝇；
(2)培养基置于培养箱内发酵3～5小时后，将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养箱内氨气浓度为50～200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度26～35℃，氨气浓度为500～1000ppm，继续培养24～120小时；
(3)将幼虫清洗干净，冷冻干燥、粉碎，溶于水中，在1～15℃浸提30～40小时，10000转/分下离心5分钟，取上清液并进行超滤，去除原料粉末中分子量低于8000KD的组分，即为成品。
卵孵化前，培养箱内一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20～50ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm。
卵孵化后，培养箱内一氧化碳浓度小于10ppm。
所述的培养基为青蛙肉、家禽肉、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中的一种或多种，这些基料易获得，成本低廉。
所述培养基可以选用以下几种配方：
(1)10～60％的淡水鱼肉、20～70％猪内脏和10～50％的青蛙肉；
(2)30～70％的猪内脏和30～70％的青蛙肉；
(3)10～50％的猪肉和10～50％淡水鱼肉及10～50％鸡肉；
(4)20～60％的牛肉和30～70％青蛙肉；
(5)30～70％的羊肉、10～50％淡水鱼肉及20～60％猪内脏。
本发明组合物对多种癌细胞均有抑制作用，制备方法简单，具有较好的市场化前景。
具体实施方式
实施例1 驯化野生大头金蝇
取自然界的大头金蝇，为避免野生种类的带菌传病之嫌，经过高猛酸钾消毒处理后，进行2～3代隔离饲养，然后在接近自然的养蝇房内养殖驯化，经过四代后，种蝇驯化完成，得到种蝇。
如来年不再驯化种蝇，就需要保存种蝇。保种的方法为：在9～10月份秋末时，把蝇蛹放入密封容器内，置于温度为5～10℃的冷藏室内，在该温度下蛹不会死亡也不会孵化，来年室外温度上升到22℃以上时，取出放进蝇房即可孵化。
实施例2 培养幼虫
将20千克培养基(60％的淡水鱼肉、30％猪内脏和10％的青蛙肉)置于培养箱内。培养箱体积0.14立方米，制作材料可使用金属、塑料、木材、水泥、复合材料等，形状为长方体或正方体，顶面设有一个可调节大小的通气孔。当培养基开始发酵后，将种蝇的卵放在培养基的表面，并控制培养箱内氨气浓度在50～200ppm，一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20～21ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm，培养大概6个小时左右，卵开始孵化。
接着把通气孔孔径减小，增加氨气浓度至500～1000ppm，一氧化碳浓度降低小于10ppm，继续培养100小时，得到幼虫。整个过程中，不再加入新鲜的培养基，当气体浓度超出上述范围，则将通气孔增大，调整到上述范围内。
实施例3 后处理
首先把收集的蝇幼虫活体放置在60目尼龙筛网制成的无盖网箱内，用清水冲洗。30分钟冲洗一次，连续冲洗四次以上，此方法能将幼虫体内的污物彻底清洗干净，真空冷冻干燥至含水量10％以下。取出存放于密封容器内，在1～4℃的环境下保存即可。
将冻干物粉碎至80目，以水为溶媒，将粉碎物与水按1∶10的重量比混合，在温度10℃下浸泡35小时，取出后用离心机分离，离心转速为10000转/min，离心时间为5分钟，取上清液，在-35℃以下，低温冷冻干燥成含水量小于8％，得到的为结晶状产物，大致占幼虫总重量的25～28％。
实施例4 分离纯化蛋白质
将结晶状产物复溶于水配置成重量百分比浓度为50％的溶液，利用分子超滤系统(法国militon生产)进行超滤，超滤系统参数设置：筛选范围8000～80000DK；压差为2个大气压；流速500ml/小时；将分子量低于8000DK的小分子物质去除，收集截留物溶于水，-45℃真空干燥。
实施例5 定性定量
(1)取适量实施例4的冻干物样品，加入裂解液(8M Urea，10mMDTT，150mM Tris)约1ml，超声(80W)裂解，全过程在冰上完成。离心，12,000g，45分钟，取上清。
(2)取上清液使用Bio-Rad protein assay reagent定量，分装成10ug每管，置于500ul离心管中，低温保存(-80℃)。
(3)电泳：上样20ug，SDS-PAGE为12.5％的胶(15mA/胶30min，30mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5cm)。
(4)染色：考染，分析泳道内条带的光密度扫描值，计算各条带中蛋白质的含量。
(5)在胶上切下蛋白点，加入8μl 10ng/μl胰蛋白酶(Trypsin，Roche，美国)进行胶内消化，然后置于4℃冰箱放置40min使胶片完全吸收酶液，再补加10μl 25mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)，于37℃温育12h，胶内蛋白质被酶解成肽段混合物。在上述肽段混合物中加入30-50μl 5％TFA(Merk公司，德国)于40℃提取上述酶切肽段1小时一次，再用相同体积的50％CAN和2.5％TFA(Merk公司，德国)溶液于30℃提取1小时一次，最后用25μl CAN(Fischer公司，美国)超声提取一次，合并3次提取液。真空干燥，然后用4μl 0.5％三氟乙酸溶解，将0.6μl溶解物用基质辅助激光解吸离子化飞行质谱(MALDI-TOF-MS)分析，获得肽质量指纹(Peptide Mass Fingerprint，PMF)图谱，比对得到每个蛋白的序列、相对分子质量，具体如下表所示：
实施例6 活性测试
检测实施例4制得的冻干物对癌细胞生长的抑制率，所有活性测试委托中科院上海药物研究所，采用磺酰罗丹明B(sulforhoamine B，SRB)蛋白染色法，具体检测结果如下表所示：
Claims (9)
1.一种抗肿瘤组合物，由氨基酸序列在NCBI数据库中登录号分别为Gi 2148169、Gi 114236、Gi 8101742、Gi 2148175、Gi 157674463、Gi505529、Gi 157690694、Gi 116248322、Gi 156603504、Gi 8980621的蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g、蛋白h、蛋白i、蛋白j组成。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，重量百分比组成为：蛋白a 20～25％、蛋白b 20～25％、蛋白c 1～5％、蛋白d 15～20％、蛋白e 5～10％、蛋白f 10～15％、蛋白g 10～15％、蛋白h 1～5％、蛋白i 1～5％、蛋白j 1～5％。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，重量百分比组成为：蛋白a 20～22％、蛋白b 20～22％、蛋白c 2～5％、蛋白d 15～18％、蛋白e 5～7％、蛋白f 10～12％、蛋白g 10～12％、蛋白h 1～3％、蛋白i 1～3％、蛋白j 1～3％。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤组合物，其特征在于，重量百分比组成为：蛋白a 21.97％、蛋白b 21.59％、蛋白c 3.88％、蛋白d 17.26％、蛋白e 5.85％、蛋白f 10.82％、蛋白g 10.95％、蛋白h 2.19％、蛋白i 2.74％、蛋白j 2.75％。
5.一种权利要求1所述的抗肿瘤组合物的制备方法，包括：
(1)将大头金蝇消毒后驯化2代以上，得到种蝇；
(2)培养基置于培养箱内发酵3～5小时后，将种蝇放入培养箱内产卵，控制培养箱内氨气浓度为50～200ppm，卵孵化后，控制培养箱内温度26～35℃，氨气浓度为500～1000ppm，继续培养24～120小时；
(3)将幼虫清洗干净，冷冻干燥、粉碎，溶于水中，在1～15℃浸提30～40小时，10000转/分下离心5分钟，取上清液并进行超滤，去除原料粉末中分子量低于8000KD的组分，即为成品。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：卵孵化前，培养箱内一氧化碳浓度小于30ppm，氧气浓度20～21ppm，二氧化碳浓度3000～6000ppm。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：卵孵化后，培养箱内一氧化碳浓度小于10ppm。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的培养基为青蛙肉、家禽肉、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的培养基重量配比为：10～60％的淡水鱼肉、20～70％猪内脏和10～50％的青蛙肉。
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| 《细胞与分子免疫学杂志》 20051231 周思朗等 一种新的细胞计数方法－磺基罗丹明B染色法 663-664 1-9 第21卷, 第5期 2 * |
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