CN102076352B - 与血管有关的fgf-9和它的用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了调控血管形成和/或稳定的组合物，其包含编码FGF-9多肽的第一分离的核酸分子以及任选地编码另一血管生成多肽的一种或多种分离的核酸分子。提供了用于调控血管形成和/或稳定的组合物，其包含分离物。本文提供的组合物可以用于调控血管生成(angiogenesis)和/或血管发生(vasculogenesis)。

Description

与血管有关的FGF-9和它的用途

发明领域

本发明涉及调控血管的形成和/或稳定。更具体地，本发明涉及FGF-9分子调控血管的形成和/或稳定的用途。

发明背景

新血管的发生(血管生成)不但在胚胎发生期是基本的，而且在缺血的成体组织中还作为保护反应。为了富有成效，衬内皮的血管形成后通常是血管周细胞的募集(recruitment)。该成熟过程产生了功能性血管，其随着时间持续并对生理刺激作出反应。成熟血管的产生在治疗缺血性疾病中具有治疗重要性。然而，在刺激成体的成熟微血管形成中却几乎没有成功。

血管生成是涉及新血管从先存在的血管生长的生理过程。血管生成需要内皮细胞的增殖和迁移以形成不成熟的血管网络。也存在需要募集间充质细胞(mesenchymalcell)的血管生成的成熟期，所述间充质细胞包括周细胞(pericytes)和/或平滑肌细胞(SMCs)，其包裹新形成的血管以稳定它们。这被称为血管生成成熟。这种血管生成成熟可以是最近的血管生成事件过程，或者包括通过在发育和出生后的任一点的血管生成产生的血管的成熟、维持和稳定。血管生成成熟还可以包括通过血管发生过程产生的血管的成熟、支持和稳定，所述血管发生定义为合适的干细胞、祖细胞或更分化的细胞类型从头凝聚成管状血管。

已知通常称为血管生成蛋白的许多蛋白促进血管生成。这种血管生成蛋白包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管内皮生长因子(VEGF)家族、血小板衍生的生长因子(PDGF)家族或胰岛素样生长因子(IGF)家族的成员。例如，某些FGF和VEGF家族成员已经被公认为生长和发育期血管生成的调节剂。已经研究了它们在促进成体动物血管生成中的作用。

血管生成蛋白，诸如FGF家族成员已经在许多专利文件中公开，例如美国第4,956,455号专利(题目为“Bovinefibroblastgrowthfactor(牛成纤维细胞生长因子)”，1990年9月11日授权)，美国第5,155,214号专利(题目为“Basicfibroblastgrowthfactor(碱性成纤维细胞生长因子)”，1992年10月13日授权)，美国第5,302,702号专利(题目为“Chimericfibroblastgrowthfactors(嵌合成纤维细胞生长因子)”，1994年4月12日授权)，美国第5,314,872号专利(题目为“Glucansulfate，stabilizedfibroblastgrowthfactorcomposition(葡聚糖硫酸酯，稳定的成纤维细胞生长因子组合物)”，1994年5月24日授权)，美国第5,352,589号专利(题目为“Deletionmutantofbasicfibroblastgrowthfactorandproductionthereof(碱性成纤维细胞生长因子的缺失突变及其制备)”，1994年10月4日授权)，美国第5,371,206号专利(题目为“DNAencodingchimericfibroblastgrowthfactors(DNA编码的嵌合成纤维细胞生长因子)”，1994年12月6日授权)，美国第5,387,673号专利(题目为“Activefragmentsoffibroblastgrowthfactor(成纤维细胞生长因子的活性片段)”，1995年2月7日授权)，美国第5,439,818号专利(题目为“DNAencodinghumanrecombinantbasicfibroblastgrowthfactor(DNA编码的人重组碱性成纤维细胞生长因子)”，1995年8月8号授权)，美国第5,491,220号专利(题目为“Surfaceloopstructuralanaloguesoffibroblastgrowthfactors(成纤维细胞生长因子的表面环结构类似物)”，1996年2月13日授权)，美国第5,514,566号专利(题目为“Methodsofproducingrecombinantfibroblastgrowthfactors(制备重组成纤维细胞生长因子的方法)”，1996年5月7日授权)，美国第5,604,293号专利(题目为“Recombinanthumanbasicfibroblastgrowthfactor(重组的人碱性成纤维细胞生长因子)”，1997年2月18日授权)。

成纤维细胞生长因子(FGF)是至少23个结构相关的多肽(称为FGF1至FGF23)家族，其特征在于对蛋白聚糖，诸如肝素具有高度亲和力。不同FGF分子的大小在15-23kD范围，并在正常和恶性条件下显示出宽范围的生物学活性。已被表征的FGF分子的活性包括神经细胞粘附和分化、伤口愈合、作为朝向许多中胚层和外胚层细胞类型的有丝分裂原、作为营养因子、作为分化诱导或抑制因子和作为血管生成因子。例如，PCT公布WO98/50079(题目为“TechniquesAndCompositionsForTreatingHeartFailureAndVentricularRemodelingByInVivoDeliveryOfAngiogenicTransgenes(通过体内递送血管生成转基因治疗心衰和心室重塑的技术和组合物)”，2004年12月30号公布)描述了FGF2，FGF4或FGF5在心衰动物模型中减缓局部心肌收缩障碍的用途。给出的治疗的作用机制是血管生成。

血管生成需要已有血管系统的内皮细胞的增殖和迁移，以便产生新血管。这些新生的血管是不完整的，因为它们缺乏成熟平滑肌细胞(SMCs)的支持层。因此，由于内皮细胞缩回以及最终发生凋亡，不成熟血管床易于退化。新形成或先前形成的血管经由通过SMCs的血管生成成熟的稳定既防止退化，同时又赋予调节血压的必要能力。尽管已经鉴定了在发育过程中刺激SMCs募集到血管的许多因子，但对于这些通路与出生后的血管生成的关系理解甚少。

目前，通过确立的可溶性血管生成细胞因子体内或体外刺激的血管形成是短期的，由于它们缺少支持性SMC的完整层的事实，因此治疗或实验价值有限。

发明概述

本发明提供了促进血管生成成熟和稳定的组合物和方法。本文第一次表明，包含FGF-9和一种或多种另外的血管生成多肽的组合物能够体外和体内使用以促进、调控和稳定血管形成。这包括改善现有血管的血管状态。这样，本发明作为用于细胞和/或组织体外培养的培养补充物具有广泛的应用和功效。本发明还在临床环境中具有广泛的治疗性应用，其中血管生成对提供稳定的血管是必需的或有益的。在本发明的任一实施方案中，本发明提供了用于全身或局部给药的组合物，有或没有载体或载体基质。

按照本发明的一方面，提供了在需要血管形成的患者体内缺氧或缺血组织中促进血管形成的方法，包括将所述组织与包含FGF-9多肽和一种或多种另外的分离的血管生成多肽的组合物接触。

按照本发明的另一方面，提供了通过促进血管生成治疗顺从治疗的疾病状态的方法，所述方法包括给予有需要的个体一定量的FGF-9多肽组合物，以有效促进所述个体的血管生成，所述组合物包含FGF-9和一种或多种另外的血管生成多肽。

按照本发明的另一方面，提供了改善血管状态的方法，这种改善包括内皮细胞的增殖和迁移以形成不成熟的血管网络、以及募集包括周细胞和/或平滑肌细胞(SMCs)在内的间充质细胞以包裹血管来稳定它们并由此改善它们的状态，该方法包括将血管与包含FGF-9和一种或多种另外的血管生成因子的组合物接触。

在一方面，提供了用于调控血管形成和/或稳定的组合物，其包含编码FGF-9多肽的第一分离的核酸分子，以及任选地，编码另一血管生成多肽的第二分离的核酸分子。在多方面，核酸分子能够是单链或双链的DNA、RNA。

在另一方面，提供了用于调控血管形成和/或稳定的组合物，其包含分离的FGF-9多肽以及任选地一种或多种另外的血管生成多肽。

在另一方面，提供了用于稳定需要这种治疗的现有血管的组合物，所述组合物包含分离的FGF-9多肽和一种或多种血管生成多肽。

在另一方面，提供了用于调控血管形成和/或稳定的组合物，其包含产生分离的FGF-9多肽的重组细胞以及任选地另一分离的血管生成多肽。

在另一方面，提供了用于促进动物治疗性血管生成的组合物，其包含编码FGF-9多肽的第一分离的核酸分子和编码血管生成多肽的第二分离的核酸分子。

仍在另一方面，提供了用于促进动物治疗性血管生成的组合物，其包含分离的FGF-9多肽和另一血管生成多肽。

仍在另一方面，提供了用于促进动物治疗性血管生成的组合物，其包含产生分离的FGF-9多肽的重组细胞和另一分离的血管生成多肽。

在另一方面，提供了促进个体内成熟血管形成的方法，其包括给予所述个体有效量的FGF-9。

在另一方面，提供了治疗个体缺血的方法，其包括给予所述个体有效量的FGF-9。

在另一方面，提供了FGF-9用于制备药物的用途。

在另一方面，提供了FGF-9用于制备促进个体内成熟血管形成或改善现有血管状态的药物的用途。

在另一方面，提供了FGF-9用于制备治疗个体缺血的药物的用途。

在另一方面，提供了FGF-9用于促进个体内成熟血管形成的用途。

在另一方面，提供了FGF-9用于治疗个体缺血的用途。

在另一方面，提供包含FGF-9和基质材料以及准备体外血管发生测定的说明书的试剂盒。

按照另一方面，提供了包含含有FGF-9的组合物和基质材料以及用于准备体外血管生成测定法的使用说明书的试剂盒。

在另一方面，提供了体外血管发生测定法，包含基质材料、FGF-9、内皮细胞、平滑肌细胞以及用于支持细胞生长和增殖的基质材料。

在另一方面，提供了FGF-9用于稳定体外或体内血管的用途。

在本发明的另一方面，提供了包含FGF-9的组合物，用于促进体外或体内血管的血管生成成熟。

在另一方面，提供了FGF-9用于治疗癌症的用途。

本发明的其他特征和优势会通过下面详细说明中变得显而易见。然而，应该理解，尽管指出了本发明的实施方案，但详细说明和具体实施例仅通过示例的方式给出，因为对本领域技术人员而言，在本发明精神和范围内的各种变化和修饰从所述详细说明中都会变得显而易见。

附图简述

通过本文给出的详细说明以及附图，本发明会更容易被充分理解，详述和附图仅通过示例的方式给出，但并不限制本文描述的本发明在其各种实施方案的目的范围。

图1显示了哺乳动物FGF-9的mRNA编码区序列和对应的氨基酸序列，A)智人(Homosapiens)(NCBIgi：391718)，B)小家鼠(Musmusculus)(NCBIgi：1161346)，C)褐家鼠(Rattusnorvegicus)(NCBIgi：391852)；

图2显示了人、小鼠、大鼠和猪的FGF-9氨基酸序列的多序列比对；

图3显示了高通量筛选SMCs获得特化功能时分泌的因子的步骤；

图4显示了当SMCs获得特化功能时，FGF-9上调；

图5显示了FGF-9在小鼠皮下植入的基质胶(matrigel)中不启动血管生成过程。

图6显示了FGF-9在血管生成期间刺激表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞(muralcell)到新生微血管的募集；

图7显示了FGF-9刺激表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞沿着血管连续长度的募集；

图8显示了FGF-9刺激SMα-肌动蛋白的附壁细胞对血管的圆周包裹；

图9A-C显示了FGF-9修饰的微血管应答血管活性刺激物并且能够进行血管收缩和血管舒张；

图10显示了FGF-9刺激的包裹可以依赖于PDGFR-β的上调；

图11显示了在体外基质胶测定中的血管发生与内皮细胞和平滑肌细胞；

图12显示了FGF-9稳定新生血管结构；

图13显示了FGF-9刺激神经到新生血管结构的募集；

图14显示了FGF-9刺激的包裹依赖于PDGFR-β的上调；

图15显示了FGF-9介导的PDGFR-β的上调和血管成熟需要SonicHedgehog信号传导；

图16显示了FGF-9对培养中的SMCs的体外直接作用；

图17显示了提出的FGF-9在血管生成中的作用机制；

图18显示了利用肾癌细胞系的癌症模型以证实血管的“收紧”预防原发肿瘤到远侧部位的转移。

图19显示了利用FGF-9的体外共培养和小管形成；以及

图20显示了FGF-9导致了SMCs与内皮管增加的结合。

实施方案的详述

出于方便，对本发明进行进一步描述前，此处提供了说明书、实施例和随附的权利要求书中使用的某些术语。这些定义应该结合本公开内容的其他部分来阅读并如本领域技术人员那样去理解。此外，本文使用的术语“包括”(及其变体)、“诸如”、“例如”不是限制性的，而是仅用于说明目的。冠词“a”和“an”用于本文指该冠词的语法对象的一个或多个(即至少一个)。例如，“元素(anelement)”指一种元素或多种元素。术语“血管生成”是本领域公认的术语，指从现有血管形成新血管的过程和产生。术语“再狭窄(restenosis)”指血管的再变窄(re-narrowing)，由此限制血流。这种再变窄可以由例如血管对球囊血管成形术造成的损伤的反应导致的。术语“缺氧组织”指具有不足氧量的组织。术语“缺血组织”指具有不足血流的组织。

本文提及的所有出版物和专利，包括列在下文的那些条目，在此都通过引用的方式以其整体并入，如同每篇单独的出版物或专利被特别和单独地指出通过引用的方式并入。

本文描述了用于调控血管的形成和/或稳定的方法和组合物。更具体地，本文描述了用于调控血管生成和/或血管发生的方法和组合物。

血管生成是涉及新血管从已有血管生长的生理过程。血管生成的一方面需要内皮细胞的增殖和迁移以形成不成熟的血管网络。血管生成的另一方面是需要间充质细胞募集的成熟期，所述间充质细胞包括包裹血管以稳定它们的周细胞和/或平滑肌细胞(SMCs)。这被称为血管生成成熟。这种血管生成成熟可以是最近血管生成事件的过程，或者包括由发育中或出生后的任一点的血管生成产生的血管的成熟、维持和稳定。因此，血管生成成熟的发生可以独立于与新生或不成熟血管的形成有关的血管生成方面，并因此可以在稳定任何血管(新生的或其他)中是有益的。例如，通过血管生成成熟过程能够稳定成体动物中表现血管渗漏或具有表现血管渗漏的风险的现有血管。血管生成成熟还可以包括成熟过程，支持和稳定由体外和/或体内血管发生过程产生的血管。血管发生包括适当干细胞、祖细胞或更分化的细胞类型从头凝聚成管状血管。

血管生成分子意在包括核酸、多肽、小分子化合物或能够用于调控血管生成至少一方面的任何其他分子。例如，血管生成多肽是能够用于调控血管生成至少一方面的多肽。血管生成多肽已经从多种天然存在的来源被鉴定，其变体也已被产生和表征。这种血管生成多肽包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族(例如，FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-9)、血管内皮生长因子(VEGF)家族(例如，VEGF-121，VEGF-145，VEGF-165，VEGF-167，VEGF-186，VEGF-189，VEGF-206或VEGF-C)、血小板衍生的生长因子(PDGF)家族(例如，PDGF-α或PDGF-β)或胰岛素样生长因子(IGF)家族的成员。血管生成肽的其他非限定性的实例包括PIGF、Hedgehog家族成员(Sonic，Indian和Desert)和SDF-1。

血管生成分子可以用于制备预防对调控血管生成的至少一方面有用的组合物。这种组合物可以用于体内或体外的任一方法，其中血管形成和/或稳定是理想的。血管的稳定可以用于形成或维持血管，例如，通过降低新生血管的衰退，维持或赋予对血管活性刺激物的反应性，降低血管渗漏或形成紧密连接。血管的稳定可以用于血管生成或血管发生。

本文描述的组合物和方法会包含FGF分子，更通常的是FGF多肽。

在一个实施方案中，提供了包含FGF-9分子的组合物。

不希望受理论约束，FGF-9被认为调控血管的稳定和/或形成，或者通过影响间充质细胞到血管的迁移调控血管生成和/或血管发生。间充质细胞能够通过物理接触以及更具体地通过对血管的圆周包裹提供对血管的稳定性。血管可以是新生的或者可以是发育或成熟的任一水平。

包含FGF-9分子的组合物可以用于调控血管生成。包含FGF-9分子的组合物可以用于在血管生成过程促进血管成熟。包含FGF-9分子的组合物还可以用于在血管生成过程促进功能血管的形成。包含FGF-9分子的组合物还可以用于在血管生成过程将平滑肌α-肌动蛋白阳性细胞募集到新生血管。包含FGF-9分子的组合物还可以用于在附壁细胞前体中诱导平滑肌α-肌动蛋白的表达。

包含FGF-9分子的组合物还可以用于在血管发生过程促进功能血管的形成和/或成熟和/或稳定，包括刺激血管的神经再分布。包含FGF-9分子的组合物还可以用于治疗性血管生成，例如在治疗缺血时，通过刺激新功能血管在缺血器官、组织或部分产生以增加到达这些区域的富氧血的水平。

包含FGF-9分子的组合物可以用于治疗任何疾病或疾病症状，其中新血管的形成在缺乏现有细胞外结构时提供了预防和/或治疗益处。因此，调控个体血管生成的方法包括给予下述组合物：包含FGF-9分子和另一血管生成剂，其与作为治疗性生物材料的天然的或合成的或天然-合成组合的细胞外基质结合。在另一个实施例中，用于治疗个体缺血的方法包括给予包含FGF-9分子的组合物。FGF-9分子可以全身给药或区域局部给药，其中需要治疗性血管生成以有助于在合适的细胞外结构内的血管生成，这对于治疗性组织工程是必需的。

包含FGF-9分子的组合物可以用于治疗任何疾病或疾病症状，其中新血管的形成提供了预防和/或治疗益处。因此，调控个体血管生成的方法包括给予包含FGF-9分子的组合物。在另一个实施例中，用于治疗个体缺血的方法包括给予包含FGF-9分子的组合物。FGF-9分子可以全身给药或区域局部给药，其中需要治疗性血管生成来治疗缺血。

缺血可以被描述为身体部分血流不足，这是由供应它的血管的收缩或泄漏导致的，结果是身体该部分的损害或功能失调。缺血是心脏病、暂时缺血发作、脑血管事件、破裂的动静脉畸形和外周动脉闭塞疾病的已知的特征。心脏、肾脏和脑是对血液供应不足最敏感的器官。脑组织缺血，例如由于中风或脑外伤，导致释放出的缺血级联反应过程，其中蛋白水解酶、活性氧分子和其他有害的化学物损害并可能最终杀死脑组织。心脏缺血能够导致心绞痛(CIP)，其有时使人非常虚弱，并难以用目前的治疗方式治疗。心脏缺血还能够导致心肌损伤和肌肉死亡(心肌梗塞)。

下肢缺血在糖尿病是常见的，并能够导致难治性下肢疼痛(跛行)，以及导致坏疽和截肢。

包含FGF-9分子的组合物可以用于治疗任何疾病或疾病状态，其中现有血管的稳定或血管生成成熟提供了预防和/或治疗益处。因此，调控个体血管生成的方法包括给予包含FGF-9分子的组合物。在另一实施方案中，用于治疗个体血管渗漏的方法包含给予包含FGF-9分子的组合物。FGF-9分子可以全身给药或区域局部给药，其中治疗性血管生成成熟对于治疗患者或减轻风险是需要的。

血管渗漏被描述为分子诸如蛋白、毒素和氧化的分子从血液运动到附近的组织的上调。这种渗漏能够导致局部细胞的损伤和死亡。这是糖尿病肾病的显著特征，其可以导致失明。它还是神经病症诸如LouGehrig’s疾病和Alzheimer’s疾病的特征。当严重的血管渗漏伴随着红血细胞和其他循环细胞的溢出。这被称为出血。小血管的出血对诸如脑和眼的组织能够具有严重的后果。

在本发明另外的实施方案中，本文描述的组合物在癌症领域具有治疗癌症的功效。本发明的FGF-9组合物的给药可以用于稳定肿瘤的血管生成，并且有效地导致癌症的局部化和较少的转移，这样可以使肿瘤更易从患者中切除。在这一方面，随着本发明包含FGF-9的组合物的局部给药可以直接靶向肿瘤。任选地，本发明包含FGF-9的组合物可以全身和/或局部给药以降低癌细胞的全身转移。预期这样治疗的肿瘤更易从患者切除，肿瘤转移的几率较小。

包含FGF-9分子和另一血管生成分子的组合物可以与血管内皮细胞和血管平滑肌细胞组合使用，有或无合适的其他细胞类型以在体外生成单独的稳定的血管、稳定的血管的系统或网络。在这种情形下，稳定的血管的存在对于研究和开发目的、潜在的治疗性化合物的评价是有益的，或者在评价修饰的细胞在血管形成或血管生成中的活性以用于实验目的是有益的。因此，用于调控体外血管生成的方法包括给予一定范围浓度的包含FGF-9分子和另一血管生成分子的组合物，该组合物适于与合适的培养基诱导血管形成和成熟。

在另一非限定性实施例中，体外生成用于所述目的的稳定的血管的这种方法可以得益于3维结构的形成。因此，对于这种3维血管结构的生成，这种培养基可以包括在合适浓度的FGF-9和另一血管生成分子的组合物，以生成稳定的血管；细胞外基质，其可以包括但不限于诸如纤维蛋白、基质胶(Matrigel)、胶原蛋白、透明质酸、蛋白聚糖、其衍生物或合成的结构剂；以及可以或可以不包含天然的或合成的交联剂以生成三维结构。

不希望局限于理论，FGF-9分子通过影响平滑肌细胞的收缩表型和刺激它们到新生血管的募集看起来促进功能血管的形成。血管平滑肌细胞的基本特征是它们能够在不成熟、增殖表型和成熟的收缩表型间转化。需要这种可塑性的一个过程是血管生成，其中平滑肌细胞必须增殖并迁移到新生微血管。然后平滑肌细胞必须包裹在这些微血管周围，并重获得收缩的能力以便稳定新生血管结构。利用在不成熟和成熟表型之间可逆转化的独特的平滑肌细胞系，已经鉴定了可以调节新血管稳定性的分泌的因子。成熟平滑肌细胞的高密度微阵列分析显示，只有27种分泌的因子被上调，其中FGF-9上调最明显。相比之下，其他FGFs随着平滑肌细胞的成熟没有显示出变化(FGF-7、-11、-12、-14、-18)或者被下调(FGF-7、-2、-5)。

没有限制，FGF-9分子可以是全长天然存在的多肽或其变体，或者可以是编码FGF-9多肽或其变体的核酸分子。此外，提供了产生FGF-9分子的重组细胞。

可以通过任何途径或方法提供FGF-9多肽，例如，天然分离的或重组的或合成来源的或其合适的组合。FGF-9多肽对个体的给药可以用于调控血管生成，以及更具体地用于促进血管生成期间平滑肌细胞的募集。FGF-9多肽可以是任意长度的，只要它维持血管生成活性。FGF-9多肽的序列可以基于完整的或部分天然存在的氨基酸序列。FGF-9多肽可以单独或与其他多肽(血管生成的或其他的)联合用于制备调控血管生成的组合物。多肽指具有生物学功能的氨基酸链，例如，肽、寡肽或蛋白，并不指链的具体长度。

分离的FGF-9多肽是已经被鉴定并与其天然环境中的至少一种组分分离和/或从其天然环境中的至少一种组分回收的多肽。该分离的多肽通常已经通过至少一个纯化步骤被纯化，以及在某些实施方案中，纯化可以实现(1)通过利用顺序分析仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)通过利用考马斯蓝或优选的银染在非还原或还原条件下的SDS-PAGE实现同质性。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为FGF-9多肽天然环境中的至少一种组分不会存在。分离的多肽可以通过合成或重组技术来制备，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress所描述的。重组技术产生的分离的多肽可以称为重组多肽。

编码FGF-9多肽的核酸可以是例如cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的任一核酸分子或其合适的组合。编码GF-9多肽的核酸对个体的给药可以用于调控血管生成，以及更具体地，用于促进血管生成期间平滑肌细胞的募集。核酸可以为任意长度，只要编码的FGF-9多肽维持血管生成活性。编码FGF-9多肽的核酸序列可以基于完整的或部分天然存在的核酸序列。编码FGF-9多肽的核酸序列可以单独或与另外的核酸序列(编码血管生成多肽或编码任何另外的期望的多肽)联合用于制备调控血管生成的组合物。

编码FGF-9多肽的分离的核酸分子是从至少一种污染的核酸分子鉴定和分离的核酸分子，其通常在核酸的天然来源中与该污染的核酸分子结合。这种分离的核酸分子不是其天然存在的形式或处于其天然存在的环境。因此分离的核酸分子与天然细胞中存在的核酸分子是有区别的。编码FGF-9多肽的分离的核酸分子包括包含在通常表达FGF-9多肽的细胞内的编码FGF-9多肽的核酸分子，其中例如，核酸分子位于染色体或染色体外的位置，不同于在天然细胞的位置。分离的核酸分子可以称为重组的核酸分子，其中分离的核酸分子已被利用重组技术操纵，例如，如在J.Sambrook，E.F.Fritsch，andT.Maniatis，1989，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress所描述的。

变体包括但不限于类似物、衍生物、片段、截短体、剪切变体、突变体、删除、取代、插入、融合等。

FGF-9多肽或编码FGF-9多肽的核酸可以以任何所需的方式(例如，任何数目的删除、插入或取代或组合)突变或变化或衍生化以产生对应的变体。考虑使用这些变体调控血管生成，以及这种变体核酸或变体多肽可以以任何分别相比于天然存在的核酸或多肽序列的方式被突变或变化或衍生化，只要其维持血管生成活性。类似地，与对应的天然存在的核酸或多肽序列具有不同程度序列一致性的核酸或多肽可以被耐受，而没有消除血管生成活性。例如，组合物可以包含FGF-9多肽，其具有与天然存在形式的FGF-9多肽或其变体相同的序列，所述变体与天然存在形式的FGF-9多肽至少80％相同。作为另一实例，组合物可以包含具有编码序列的核酸分子，该编码序列与天然存在形式的编码序列或其变体相同，所述变体具有与天然存在形式的编码序列至少70％相同的序列。通过计算机方法确定蛋白和核酸的序列一致性，以及利用高严紧条件的核酸杂交技术用于确定或鉴定共享高序列一致性(例如，至少70％)的核酸序列对本领域技术人员是已知的。

杂交反应的严紧性很容易被本领域技术人员确定，通常是经验计算，依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度。通常，较长的探针需要用于适当退火的较高温度，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于变性DNA再退火的能力，当互补链存在于低于熔融温度的环境中时。探针和可杂交序列间的序列一致性程度越高，可以使用的相对温度越高。本领域技术人员可以确定高严紧条件：(1)应用低离子强度和高温度用于洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交期间应用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺含0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，含有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)应用50％甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt′s溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，以及42℃的洗液，在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和55℃的50％甲酰胺，随后是由55℃的含有EDTA的0.1xSSC组成的高严紧洗涤液。杂交和洗涤时间应该足以实现平衡。

关于FGF-9多肽和编码FGF-9多肽的核酸序列的氨基酸或核酸序列的序列一致性百分比(％)是候选序列中与FGF-9多肽氨基酸序列或编码FGF-9多肽的核酸序列相同的残基的百分比，根据具体情况而定，比对序列并引入空位后进行(如果需要的话)从而实现最大的序列一致性百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比或核酸序列一致性百分比目的的比对可以通过本领域技术人员已知的多种方式实现，例如，利用公众可获得的计算机软件诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括实现期望的长度序列的最大比对所需的任何算法，所述长度例如至少20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190或200个残基或甚至被比较的序列的全长。

当考虑FGF-9多肽或其变体时，变体FGF-9多肽通常具有的氨基酸序列与对应的FGF-9多肽至少80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％或98％一致。

当考虑编码FGF-9多肽或其变体的核酸序列时，变体核酸序列通常与对应的编码FGF-9多肽的核酸至少70％，72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％或98％一致。用于制备变体的技术或策略是本领域已知的。在一个实施例中，关于多肽，FGF-9多肽可以在体内或体外通过糖基化、酰胺化、磷酸化、羧基化、截短、片段化、取代等修饰，而不消除血管生成活性。在另一实施例中，关于核酸，可以在编码FGF-9多肽的核酸中进行取代突变以使特定的密码子被变更为编码不同的氨基酸的密码子。可以进行这种取代突变以非保守的方式(即，通过将该密码子从属于具有特定大小或特征的一组氨基酸的氨基酸变更为属于另一组的氨基酸)或者以保守的方式(即，通过将该密码子从属于具有特定大小或特征的一组氨基酸的氨基酸变更为属于同一组的氨基酸)改变得到的蛋白中的氨基酸。这种保守性变化通常导致得到的蛋白的结构和功能的较少变化。非保守性变化更可能改变得到的蛋白的结构、活性或功能。氨基酸的分组对本领域技术人员是已知的。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。只要血管生成效应不消除，可以耐受许多这种取代或任何其他类型的改变(例如，删除或插入)或修饰。

包含FGF-9多肽或编码FGF-9多肽的核酸序列的重组细胞可以用于调控血管生成。重组的细胞类型可以包括与目的个体的生理相容的任何细胞类型，用于治疗性血管生成或用于产生血管生成、血管发生的体外模型或者应用完整和稳定的血管的任何其他体外模型的应用。

细胞可以被改变或修饰以包含不在细胞中天然存在的核酸序列，这样细胞会被视为重组的。在其他实施例中，可以改变或修饰细胞以包含天然存在于细胞的核酸序列的额外拷贝，这样的细胞也被视为重组的。如本领域技术人员所理解的，利用任何已知的技术，例如，微注射、电穿孔、病毒转染、脂质体转染、磷酸钙沉淀等，可以将编码FGF-9多肽的核酸导入细胞。在某些非限定性实例中，可以通过导入编码FGF-9多肽的核酸来修饰干细胞，然后可以将该修饰的细胞给予个体。在某些其他实施例中，可以将编码FGF-9多肽的核酸并入合适的构建体或载体，例如病毒构建体，并给予个体，从而将编码FGF-9多肽的核酸分子导入并在个体的至少一部分细胞中表达。

可以将编码FGF-9多肽的核酸可操作地连接到调控序列，通常在合适载体的情形下。有用的调控序列可以是任一核酸元件，其对于核酸序列的编码序列的表达是必需的或有利的。对于编码FGF-9多肽的核酸序列而言，每一调控序列可以是天然的或外源的。这种调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷化序列、前肽序列、启动子、信号序列或转录终止子。本领域技术人员容易获得用于并入调控序列的替代方法。例如，编码FGF-9多肽的核酸可以在内源性上游启动子的调控下，或者它可以置于异源性上游启动子的调控下。用于指导细菌宿主中的修饰的核苷酸序列诸如PS4核酸转录的合适启动子的实例包括大肠杆菌的乳糖操纵子启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶(agarase)基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)xylA和xylB基因启动子、枯草芽孢杆菌aprE基因启动子和来自乳球菌属(Lactococcussp.)-衍生的启动子的启动子包括P170启动子。当编码PS4变体多肽的基因在细菌种类诸如大肠杆菌中表达时，可以从例如噬菌体启动子包括T7启动子和噬菌体λ启动子中选择合适的启动子。

对于在真菌种类中的转录，有用的启动子的实例是衍生自编码米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶的基因的那些。

用于在酵母种类中表达的合适的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的GaI1和GaI10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)AOX1或AOX2启动子。

本领域技术人员还可获得另外合适的启动子，例如，巨细胞病毒、劳氏肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)、合成的痘病毒启动子、痘(pox)合成的晚期启动子1、痘合成的晚期启动子2早期启动子2、痘OIL启动子、痘14L启动子、痘13L启动子、痘12L启动子、痘HL启动子、痘DI0R启动子、PRVgX、HSV-Iα4、鸡β-肌动蛋白启动子、HCMV立早、MDVgA、MDVgB、MDVgD、ILTgB、BHV-1.1VP8和ILTgD以及内部核糖体进入位点启动子。

合适的载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够并入编码FGF-9多肽的核酸序列和任何所需的调控序列，并且能够导致核酸序列的表达。载体的选择通常依赖于载体与载体被导入的宿主细胞的相容性。在特定的实例中，载体可以作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、迷你染色体或人工染色体。在其他实例中，载体可以是当导入宿主细胞时被整合进基因组并与其被整合进的染色体一起复制的载体。其他载体以及操纵载体的技术是已知的，对本领域技术人员而言是显而易见的。

重组细胞可以包含FGF-9多肽或编码FGF-9多肽的核酸序列，其单独地或分别与所需的另外多肽或核酸分子联合例如以优化或增强功效。此外，核酸序列在导入所需的细胞前可以突变或改变，例如用于密码子优化用于特定细胞类型的表达。此外，可以改变核酸序列以在应用中编码FGF-9多肽与一个或多个另外所需多肽的融合物，例如，与靶向多肽或载体多肽的融合物。

本领域技术人员会认识到，本文描述的关于FGF-9分子的变体和包含FGF-9分子的细胞可以等同地应用于与FGF-9分子以及包含FGF-9分子的细胞联用的另外多肽、核酸分子和细胞。在某些实例中，血管生成多肽、编码血管生成多肽的核酸分子或产生血管生成多肽的细胞可以与FGF-9分子或产生FGF-9分子的细胞联用。这种血管生成多肽包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族的其他成员、血管内皮生长因子(VEGF)家族、血小板衍生的生长因子(PDGF)家族或胰岛素样生长因子(IGF)家族。在某些实例中，FGF-9分子与FGF-2联用。在某些实施例中，与FGF-9分子和包含FGF-9分子的细胞联用的其他多肽、核酸分子或细胞可以包括适当的细胞外基质蛋白以包含体外3维结构或用于治疗目的的生物材料。这些细胞外基质蛋白可以包括但不限于天然存在的分子诸如胶原蛋白、纤维蛋白或蛋白聚糖。

如本领域技术人员所理解的，多肽、核酸分子或细胞能够以多种方式和其组合给药。例如，可以进行肌内、皮下、静脉内、鼻内、皮内、囊内、卵内、经眼、经口、气管内或支气管内给药，以及这些方式的组合。剂量可以随着目的个体的大小而变化。给药的方法对本领域技术人员是已知的，例如，U.S.Pat.Nos.5,693,622；5,589,466；5,580,859；和5,566,064。制备组合物所需的多肽、核酸序列或重组细胞的量是本领域技术人员熟知的。

本文所描述的多肽、核酸或重组细胞可以与药学土可接受的载体联合用于制备调控血管生成的组合物。药学上可接受的载体对本领域技术人员是已知的，包括但不限于蛋白、糖等。这种合适的载体的一个实例是生理学上平衡的培养基，其包含一种或多种稳定剂诸如水解的蛋白、乳糖等。可接受载体的另一实例是0.01-0.1M、优选0.05M的磷酸缓冲液或0.8％的盐水。可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液或乳状液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体的实例是水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。防腐剂和用于药物组合物的其他添加剂也是本领域技术人员熟知的，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、有机酸等。这种合适载体的另一实例是包含天然或合成的细胞外基质材料的生物材料。

短语“胃肠外给药”和“经胃肠外给药”是本领域公知的术语，包括除肠道和局部给药的给药方式，诸如注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内和胸骨内注射和输注。

术语“治疗”是本领域公知的术语，其包括治愈以及缓解任何疾病状态或疾病的至少一种症状。

短语“药学上可接受的”是本领域公知的。在某些实施方案中，该术语包括组合物、聚合物和其他材料和/或剂型，其在正确的医疗判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、变态反应，或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

短语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，包括，例如，药学上可接受的物质、组合物或溶媒，诸如液体或固体的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，与携带或运输任意主题组合物从身体的一个器官或部分到身体的另一器官或部分有关。从与主题组合物的其他成分兼容以及对患者无害的角度，每种载体必须都是“可接受的”。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无致热原的。可以作为药学上可接受的载体的物质的一些实例包括(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，诸如羧基甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)凝胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可油和栓蜡；(9)油类，诸如花生油、棉花籽油，葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多羟基化合物类，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲溶液；以及(21)应用于药物制剂的其他无毒性相容物质。

术语“药学上可接受的盐”是本领域公知的，包括本发明组合物相对无毒的、无机和有机酸加成盐，包括但不限于治疗剂、赋形剂、其他物质等。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸和硫酸的那些，以及那些衍生自有机酸诸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的那些。用于形成盐的合适的无机碱的实例包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。还可以用合适的有机碱形成盐，包括无毒并足够强以形成所述盐的那些有机碱。出于示例的目的，这类有机碱可以包括单-、双-和三烷基胺诸如甲胺、二甲胺、和三乙胺；单-、双-或三羟基烷基胺诸如单-、双-或三乙醇胺；氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺(methylglucosamine)；N-甲基葡萄胺(methylglucamine)；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啡；乙撑二胺；N-苄基苯乙胺；(三羟基甲基)氨基乙烷等。参见，例如J.Pharm.ScL，66：1-19(1977)。

被主题方法治疗的“患者”、“个体”或“宿主”可以指人或非人动物，诸如，灵长类，哺乳动物和脊椎动物。

术语“预防或治疗性”治疗是本领域公知的，包括给予宿主一种或多种主题组合物。如果它在有害的疾病状态(即疾病或宿主动物的其他有害状态)的临床表现前给药，则治疗是预防性的，即它防止宿主发展为有害的疾病状态；如果它是在有害疾病状态表现后给药，则治疗是治疗性的(即，它的目的是消除、缓解或稳定已存在的有害疾病状态或其副作用)。

短语“全身给药(systemicadministration)”、“全身给药(administeredsystemically)”、“外周给药(peripheraladministration)”和“外周给药(administeredperipherally)”是本领域公知的，包括主题组合物或其他物质除外直接进入中枢神经系统的给药，例如通过皮下给药，这样它进入患者的系统，并由此进行代谢和其他类似的过程。

短语“治疗有效量”是本领域公知的术语。在某些实施方案中，该术语指治疗剂的量当单独使用或与本发明的合适基质联用时，以适用于任何医疗的合理的效益/风险比产生了某些所需的效应。在某些实施方案中，该术语指调控血管形成和/或稳定所需的量或足以调控血管形成和/或稳定的量。有效量可以依赖于诸如下述的因素变化：治疗的疾病或疾病状态、给药的特定靶向构建体、个体的大小或者疾病或疾病状态的严重度。本领域技术人员可以根据经验确定特定化合物的有效量，而不需要过度的实验。准确的制剂、本文公开的组合物和药物组合物的给药途径和剂量可以由个别医师根据患者的疾病状态来选择(参见，例如Fingletal.1975，in″ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(治疗的药理学基础)″，第1章，其整体通过引用的方式并入本文)。根据患者需要，剂量可以是单一剂量或者是一天或多天疗程给予的一系列的两次或多次剂量。如果没有确立人剂量，合适的人剂量可以从ED₅₀或ID₅₀值或来自体外或体内研究的其他合适的值推导出，如通过动物的毒性研究和功效研究所限定的。剂量区间还可以利用MEC值确定。应该利用维持血浆水平高于MEC约10％至约90％的时间的方案给予组合物，优选约30％至约90％，最优选约50％至约90％。

需要给药以提供治疗效应的本发明的FGF-9组合物的量根据本领域技术人员的理解变化，并且可以依赖于本发明的实施方案而变化，在体外、体内全身、体内局部，与生物材料结合，以体内延长的释放模式使用。因此，在某些方面，剂量可以为约0.1ng/ml至100ng/ml。在其他方面，剂量可以多达约500ng/ml。仍在其他方面，量可以从高达1mg/kg至约100mg/kg范围变化。本领域技术人员可以理解，本发明的FGF-9组合物的量可以选自本文描述的治疗剂量的任一亚范围：高达0.01ng/ml，高达500ng/ml。通过重量表示的剂量还可以涵盖高达约1mg/kg至约1000mg/kg范围，诸如例如但不限于：1mg/kg-500mg/kg；1mg/kg-250mg/kg；1mg/kg-200mg/kg；1mg/kg-150mg/kg；1mg/kg-75mg/kg；1mg/kg-50mg/kg；和1mg/kg-25mg/kg以及这些范围的任一个的亚范围。同样，量大于1000mg/kg以及在某些方面低于1mg/kg也是可能的。

在一个实施方案中，本文提供的药物FGF-9组合物可以配制为控释组合物，即其中FGF-9和另外血管生成多肽在给药后的一段时间内释放的组合物。控释-或缓释的组合物包括亲脂性贮存库(例如，脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另外的实施方案中，组合物是即刻释放的组合物，即其中所有的FGF-9和另外的血管生成多肽在给药后立即释放的组合物。

在另外的实施方案中，本发明的药物组合物可以在控释系统中递送。例如，包含血管生成多肽的FGF-9组合物可以利用静脉输注、可植入的渗透泵、透皮贴、脂质体或其他给药方式来给药。在一个实施方案中，可以使用泵(参见，Langer，同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwaldetal.，Surgery88：507(1980)；Saudeketal.，N.Engl.J.Med.321：574(1989)。在另外的实施方案中，可以使用聚合材料。在另外的实施方案中，可以将控释系统置于接近治疗靶标处，即脑，由此仅需要一部分的全身剂量(参见，例如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease(控释的医疗应用)，同上，vol.2，pp.115-138(1984))。Langer(Science249：1527-1533(1990)的综述中讨论了其他控释系统。本发明的组合物还包括将FGF-9活性并入诸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的聚合化合物的颗粒制剂内或上，或者脂质体、微乳胶、微胞、单层或多层脂囊、红细胞影或原生质球上。这类组合物会影响生理状态、溶解性、稳定性、体外释放率和体内清除率。

本发明还包括包被有聚合物的颗粒组合物(例如，泊洛沙姆(poloxamers)或poloxamines)以及与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶联的化合物，或者与组织特异性受体的配体偶联的化合物。

本发明还包括FGF-9化合物，其被共价连接的水溶性聚合物改性，诸如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶烷酮或聚脯氨酸。已知改性的化合物静脉注射后显示比对应的未改性的化合物明显更长的在血液中的半衰期(Abuchowskietal.，1981；Newmarketal.，1982；andKatreetal.，1987)。这种改性还可以增加水溶液中化合物的溶解性、消除聚集、增加化合物的生理和化学稳定性，并大大降低了化合物的免疫原性和反应性。因此，理想的体内生物学活性可以通过比未改性化合物低的频率、小的剂量给药这种聚合物-化合物结合物(abducts)来实现。

在非限定性实施方案中，局部医疗装置或生物可降解的植入物可以用于包括本发明的组合物的时间-过程释放的功能性。医疗装置可以由具有内部凝胶样流体的实心罩(solidcasing)组成，所述流体包含本发明的FGF-9组合物。凝胶样流体可以是冷沉淀物(cryoprecipitate)、给药基质或适于组合物缓释的多种聚合物的组合物。生物可降解的植入物包含生物可降解的递送装置或载体以及本发明的FGF-9组合物。可以选择载体以在长时间保留在植入部位内并缓慢释放其中包含的血管生成因子到外周环境。这种递送模式允许本发明的FGF-9组合物长时间内在该部位内保持治疗有效量。

上述公开内容总体描述了本发明。通过参考下述的具体实施例可以获得更详尽的理解。描述这些实施例仅用于示例的目的，并不意图限定本发明的范围。包括形式的变化以及等同物的取代，因为情况可以提示或提供达到目的的方法。尽管本文应用了具体的术语，这些术语是说明性的，并不是出于限定的目的。

实施例

实施例1：FGF-9变体

FGF-9序列和其变体可以衍生自多种天然存在的来源。例如，图1显示了从GenBank检索到的编码人、小鼠和大鼠FGF-9的核酸序列。作为另一实例，图2显示了人、小鼠、大鼠和猪FGF-9氨基酸序列的多重序列比对。利用JalView2.3比对了从GenBank检索到的FGF-9种属特异性氨基酸序列。可以观察到该氨基酸序列的高度保守性。

图1或2显示的FGF-9序列的变体可以利用诸如SambrookJetal.2000.MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)(第三版)中描述的那些的已知方法来制备。可以测试变体包裹和/或稳定血管的能力。

实施例2：高通量筛选SMCs获得特化功能时分泌的因子

人SMC进行血清饥饿8天。该过程将SMCs转化为借此它们以特化模式迁移的状态。获得这种特化表型的SMCs通常具有包裹和稳定血管的能力。第0天和第8天收获的RNA随后进行利用AffymetrixU133阵列的高密度微阵列分析。进行三次生物学重复。

微阵列数据分析表明，在SMCs表达的1087种分泌的因子中，只有27种在SMCs获得特化表型时呈现统计学上的上调。在这27种上调的基因中，FGF-9上调最明显。在如图3所示的蛋白水平证实了FGF-9的上调。

实施例3：FGF-9在SMCs获得特化功能时上调

人SMCs进行血清饥饿8天。该过程将SMCs转化为借此它们以特化模式迁移的状态。获得这种特化表型的SMCs通常具有包裹和稳定血管的能力。第0天和第8天收获的RNA随后进行高密度微阵列分析。

如图4所示，没有检测到FGF-3，6，8，10，13，17，19，20，22和FGFR-4的表达。检测到了FGF-7，11，12，14，18和FGFR-1，2和3的表达，但这些表达没有在应答血清撤走时未发生变化。FGF-1，2和5在应答血清撤走时下调，而FGF-9在SMCs获得特化表型时上调。

实施例4：FGF-9不在小鼠皮下植入的基质胶中启动血管生成过 程

基质胶栓(Matrigelplug)与500ng/mLFGF-9、500ng/mLFGF-2或者500ng/mLFGF-2和200ng/mLFGF-9混合，并经皮下注射入3个月龄C57/B16小鼠中。植入后8天，处死小鼠并收获基质胶栓，进行针对CD31的免疫染色(褐色)以鉴定衬有内皮细胞的微血管。

图5显示了该实验的结果。单独的FGF-9并不诱导血管生成，如基质胶内缺乏CD31免疫反应性所表明的(图5A)。FGF-2(图5B)和FGF-2+FGF-9(图5C)都诱导基质胶中的血管生成，如CD31免疫反应性(褐色)所表明的。

定量了图5B和5C中免疫染色的CD31阳性的微血管。如图5D所示的CD31阳性微血管面积的图示表明，同等水平的血管生成发生在含有FGF-2(Fig.5B)和FGF-2+FGF-9(图5C)的基质胶栓中。5EFGF-9刺激可灌注血管的形成。携带含有FGF-2或FGF-2+FGF-9的基质胶栓7天的小鼠被处死，用microfil灌注，并进行三维(3D)显微计算机断层扫描(微CT)。该图表明可灌注血管穿入基质胶栓的深度，证实了在含有FGF-2+FGF-9的基质胶中形成的血管与单独的FGF-2相比功能更强并且具有更高程度的灌注。

实施例5：FGF-9刺激表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞在血管生成 期间向新生微血管的募集

植入C57/B16小鼠后8天收获的基质胶栓的8μm厚切片进行CD31(褐色)和平滑肌α-肌动蛋白(红色)免疫染色的显微照片，以及受平滑肌(SM)α-肌动蛋白阳性细胞支持的微血管的百分比的定量。

FGF-9诱导平滑肌α-肌动蛋白阳性细胞募集到CD31-阳性微血管周围的程度明显大于单独的FGF-2。如图6中的图所示，由SMα-肌动蛋白阳性细胞覆盖的新生血管的量化证实了，FGF-9刺激平滑肌到微血管周围募集的程度明显大于单独的FGF-2(83±7.7％vs.37±5.4％P＜0.05)。

实施例6：FGF-9刺激表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞沿血管连续 长度募集

植入后8天收获的基质胶栓切成200μm厚的切片并进行CD31(左图)和SMα-肌动蛋白(中央的图)免疫染色的显微照片，以及CD31-阳性管的SMα-肌动蛋白覆盖范围的定量。

FGF-9诱导SMα-肌动蛋白阳性细胞沿着新生微血管的大长度结合。如图7中的图所示，CD31新生血管的SMα-肌动蛋白阳性细胞覆盖范围的定量显示，FGF-9比FGF-2诱导明显更大的覆盖范围(45.4±5.3％vs.7.2±1.8％P＜0.05)。

实施例7：FGF-9刺激表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞对血管的圆 周包裹

植入后8天收获的FGF-2+FGF-9基质胶栓进行共焦显微镜检查。采集沿z-轴的1μm厚的连续图像以获得描绘血管的90μm厚的z-stack。

图8A显示CD31-阳性内皮细胞(左图)和SMα-肌动蛋白附壁细胞(中央的图)的正交视图。图8B显示了由1μm厚的图像组成的90μm厚的z-stack的三维重建。

正交视图描绘了内皮细胞和沿着血管长度的支持性SMα-肌动蛋白附壁细胞之间的紧密结合。该血管的完整z-stack的三维重建举例说明了肌动蛋白阳性的附壁细胞沿圆周包裹在血管周围，如同体内存在的结构。这强调了表达SMα-肌动蛋白的附壁细胞与血管密切且结构上粘附的结合，暗示了生理学上的稳定。

实施例8：FGF-9-修饰的微血管应答血管活性刺激物并能够进行 血管扩张和血管收缩

基质胶注射后14天，将小鼠进行麻醉，通过外科手术去除覆盖在基质胶上方的皮肤并将递送药物的导管缝合在栓区。通过尾静脉注射FITC-标记的葡聚糖，利用倒置的荧光显微镜观察基质胶栓中血管的直径。应用图9中所示的血管收缩剂的剂量，并捕获5分钟的血管的图像。

图9显示了单独的小鼠应答苯肾上腺素(PE)和KCl时随时间变化的血管直径的代表性示踪。FGF-9修饰的微血管相比于FGF-2诱导的微血管显示了应答PE和KCl的较大收缩。

图9B的示踪描绘了应答苯肾上腺素和KCl处理时血管直径的变化。KCl会使SMCs去极化并导致受体非依赖性收缩，如果它们存在于血管上的话。FGF-2诱导的血管显示了缓和的对血管收缩剂的应答(如果有的话)，而FGF-9血管的直径减少了高达它们初始直径的65％。

在单独的实验中，将在血管收缩剂PE剂量后的血管舒张剂应用到基质胶栓中的血管。C中的显微照片证实了在含有FGF-2+FGF-9的基质胶栓中的血管应答PE时收缩，应答SNP时舒张。

实施例9：FGF-9-刺激的包裹依赖于PDGFR-β的上调

小鼠皮肤成纤维细胞用如图11A所示的FGF-2或FGF-9的剂量刺激24小时后收集。细胞蛋白通过SDS-PAGE分离，以及通过蛋白免疫印迹分析评价PDGFR-β的丰度。如图11A所示，FGF-9诱导PDGFR-β蛋白在小鼠皮肤成纤维细胞中的上调。

含有FGF-2或FGF-2+FGF-9的基质胶栓在植入后8天收获并针对PDGFR-β进行免疫染色。如图11B所示，PDGFR-β的表达在含有FGF-2+FGF-9的基质胶栓中比单独的FGF-2显著增加。

在存在PDGFR-β阻断抗体的情况下，含有FGF-2或FGF-2+FGF-9的基质胶栓在植入后8天收获。通过针对CD31和SMα-肌动蛋白的免疫染色来评价血管上的SMα-肌动蛋白阳性附壁细胞的结合。图11C中的图显示，与对照抗体相比，PDGFR-β的阻断减弱了FGF-9-介导的SMα-肌动蛋白阳性附壁细胞到新生血管的募集(18±4.4％vs.87±4.3％p＜0.05)。

实施例10：FGF-9在体外以及体内上调SMC募集蛋白

在培养中筛选了与血管生成相关的多种因子以试图鉴定FGF-9作用的介导物。包括Vegf和TGF-β1的几种因子不受FGF-9处理或过表达的影响。相比之下，PDGFR-β，一种SMC向内皮细胞的归巢的介导物，通过FGF-9处理和过表达在人平滑肌细胞和小鼠皮肤成纤维细胞中上调(图11A-C)。

SonicHedgehog信号传导中的组分在mRNA水平也被上调，所述SonicHedgehog信号传导对于斑马鱼的动脉形成是必需的。通过免疫组化证实了体内血管生成过程中FGF-9引起的PDGFR-β的上调(图11B)。也检测了PDGFR-β阻断抗体对SMC到体内新生血管募集的影响。

实施例11：2-和3-维血管发生分析

人SMCs用增加剂量的FGF-9处理24小时。表达eGFP(绿色荧光蛋白)的人脐带内皮细胞接种在低生长因子基质胶包被的培养皿中，密度为1.5x10⁴细胞/cm²。4小时后，以1.5x10⁴细胞/cm²密度添加表达mRFP(红色荧光蛋白)的人平滑肌细胞，并且通过显微镜追踪SMCs到内皮管的迁移24小时，任选地在存在100ng/mLFGF-9的情况下。荧光显微照片显示了添加SMCs后10小时，表达mRFP的SMCs与表达eGFP的内皮管的结合(图12)。

随后，利用本领域技术人员已知的方法学(例如，如ScaffoldinginTissueEngineering(组织工程学支架)(eds.Ma，P.X.andEliseeff，J)，2006CRCPress，BocaRaton，FL所描述的)，将内皮细胞和人SMCs在基质胶上、或基质胶内或等同的基质内共培养，以分别产生2维和3维培养物。测定培养物中血管的形成、活性和稳定性。多种优化浓度的FGF2和FGF9以及组合添加在这些培养物中。随着时间推移，通过延时显微镜检查(timelapsemicroscopy)追踪血管的聚集和血管发生的程度，并通过共焦显微镜检查评价性能。通过本文已经描述的方法评价这些血管的反应性。

实施例12：FGF-9稳定新生血管结构以及血管稳定性随着时间持 续

A植入后1年收获的基质胶栓(图12)进行CD31免疫染色(褐色)的显微照片。12B评价为含有CD31阳性微血管的面积的血管生成的定量。含有FGF-2+FGF-9的基质胶栓在植入后1年具有显著更多的血管，特别是直径大于15μM的血管。

实施例13：FGF-9刺激神经到新生血管结构的募集

A.植入后28天收获的含有FGF-2或FGF-2+FGF-9的基质胶栓进行针对神经丝蛋白标志物NF-200的免疫染色的显微照片(图13)，以检测血管相关神经的存在。B.该图显示了植入后14和28天神经相关性血管的百分比。

实施例14：FGF-9刺激的包裹依赖于PDGFR-B的上调

A.用增加浓度的重组FGF-9刺激24小时的人主动脉SMCs的RT-PCR(图14)。评价了与血管生成有关的多个基因。只有PDGFR-β被上调。B，过表达编码GFP或FGF-9的cDNA的人主动脉SMCs的RT-PCR。C.用FGF-2或FGF-9处理24小时的C57/B16皮肤成纤维细胞的蛋白免疫印迹。

小鼠皮肤成纤维细胞用图15C所示的FGF-2或FGF-9的剂量刺激24小时，然后将其收获。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白，并且通过蛋白免疫印迹分析评价PDGFR-β的丰度。如图14B所示，与FGF-2相比，FGF-9在小鼠皮肤成纤维细胞中诱导PDGFR-β蛋白的上调。

植入后8天收获的含有FGF-2+FGF-9与对照IgG或PDGFR-β阻断抗体的基质胶栓进行针对CD31(褐色)和smα-肌动蛋白(红色)免疫双染的显微照片。PDGFR-β阻断抗体的存在减弱了FGF-9诱导的smα-肌动蛋白阳性细胞到新血管的募集。E小鼠中CD31-阳性血管的SMα-肌动蛋白覆盖范围的定量，所述小鼠携带FGF-2或FGF-2+FGF-9与对照IgG或PDGFR-β阻断抗体。图11E中的图显示了于对照抗体相比，PDGFR-β的阻断减弱了FGF-9介导的SMα-肌动蛋白阳性附壁细胞向新生血管的募集(18±4.4％vs.87±4.3％p＜0.05)。

实施例15：FGF-9介导的PDGFR-β上调以及血管成熟需要Sonic Hedgehog信号传导

图15A.用增加浓度的重组FGF-9刺激24小时的人主动脉SMCs的RT-PCR。15B.过表达编码GFP或FGF-9的cDNA的人主动脉SMCs的RT-PCR。15C，用DMSO或500nM环巴胺(cyclopamine)预处理并随后用溶媒或FGF-9刺激24小时的C57/B16皮肤成纤维细胞的蛋白免疫印迹。15D.带有DMSO或环巴胺的含FGF-2和FGF-9的基质胶栓进行针对CD31(褐色)和smα-肌动蛋白(红色)免疫双染的显微照片。E代表6只小鼠的CD31-阳性血管的SMα-肌动蛋白覆盖范围的定量，所述小鼠携带FGF-2或FGF-2+FGF-9与溶媒或500nM环巴胺(79±4vs38±4.8，p＜0.05)。

实施例16：对培养中的SMCs的体外直接作用

图16A.将表达GFP或FGF-9的SMCs的裂解液进行蛋白免疫印迹分析以评价平滑肌细胞标志物的水平。表达FGF-9的SMCs与表达GFP的培养物相比显示出更原始和可塑的表型，如通过降低水平的平滑肌α-肌动蛋白和钙调蛋白所示。16B.表达GFP或FGF-9的SMCs用膜联蛋白(Annexin)染色以检测凋亡细胞并进行流式细胞计数。表达FGF-9的SMC培养物是较少凋亡的，如膜联蛋白阳性细胞的较小比例所示。C.表达GFP或FGF-9的SMCs被连续培养并计数以确定它们的累积群体倍增值(cumulativepopulationdoubling)，以及将来自每一代的DNA分离并进行实时PCR分析以评价端粒损耗率。该图显示了表达FGF-9的SMCs的培养物经历了与对照SMCs相比降低速率的端粒衰退(telomeredecay)。

实施例17：提出的FGF-9在血管生成中的作用机制示意图

FGF-9向间充质前体细胞和/或不成熟的干细胞池发出信号以促进它们的存活、阻止衰老。通过相同或不相关的通路，FGF-9激活SonicHedghog信号传导以诱导PDGFR-β受体在这些间充质细胞的上调。这增加了该细胞池向该受体的配体PDGF-bb迁移的能力，所述配体由形成新血管的内皮细胞分泌。间充质细胞到血管的募集导致它们向SMC细胞的成熟，所述SMC细胞能够稳定新生微血管结构，并赋予血管反应性(图17)。

实施例18：转移的正位肾癌模型

生成转移癌的动物模型。给予小鼠单独的FGF-9或任选地与另一种血管生成分子联合的FGF-9以证实治疗癌症的功效。已经确定，血管生成促进肿瘤生长，在肿瘤中形成的血管缺乏支持性附壁细胞并有渗漏的倾向。已经确定，在人结直肠癌中血管覆盖范围与转移以及低存活率成负相关。最近的研究已经在功能上证实了肿瘤血管的包裹能够限制肿瘤细胞转移。

在雌性Balb/c小鼠左肾的包膜下间隙内注射5x10⁵个表达GFP或FGF-9的RENCA细胞，所述细胞悬浮在低生长因子基质胶中。14天后，两侧肾都被切除，以及肺也被切除和评价。图18A.来自Balb/c小鼠的切除的肺的照片，所述小鼠携带源自表达GFP或FGF-9的RENCA细胞的肾脏肿瘤。表面转移可以被鉴定为肺表面上的不规则的半透明的凸起/膨胀/突起(箭头)，并且在GFP-RENCA携带小鼠中更为普遍。18B.肾脏重量的量化，其表明表达GFP的RENCA细胞与表达FGF-9的RENCA细胞相比，左肾原发性肿瘤的体积没有差异(514.9mg+114.6vs.536.2mg±95.4n＝6GFPvs.FGF-9)。图18C.该图显示了Balb/c小鼠的肺上的表面转移的平均数目，在携带源自表达FGF-9的RENCA细胞的肿瘤的小鼠中，转移的趋势下降(74±43vs2±4.3n＝6)。

实施例19：体外共培养

表达EGFP的HUVECs接种在低生长因子基质胶上并允许贴壁4小时，然后加入表达mRFP的HITC6SMCs，用所示剂量的FGF-9预处理16小时，并随后在10小时后捕获荧光图像，箭头指示沿着GFP阳性内皮管排列的RFP-阳性SMCs(图19)。在对照条件下，几乎没有RFP-阳性细胞与GFP-阳性内皮管结合，而增加浓度的FGF-9引起SMCs与内皮管增加的结合。

实施例20：体外内皮管

表达EGFP的HUVECs接种在低生长因子基质胶上并被允许贴壁4小时，随后添加表达mRFP的HITC6SMC，用所示剂量的FGF-9预处理16小时，并随后在10小时后捕获荧光图像，箭头指示沿着GFP阳性内皮管排列的RFP-阳性SMCs(图20)。在对照条件下，几乎没有RFP-阳性细胞与GFP-阳性内皮管结合，而增加浓度的FGF-9引起SMCs与内皮管增加的结合。这与图16B和16C中的结果一起表明较好的细胞存活导致血管形成。

上述实施方案用于示例，本领域技术人员可以实施其变形和修饰形式，而没有背离所附权利要求书所限定的本发明的范围。

Claims (28)

1.用于促进动物内成熟血管形成的组合物，其包含编码FGF-9多肽的第一分离的核酸分子，以及编码FGF2多肽的第二分离的核酸分子。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述FGF-9多肽由选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。

3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述第一分离的核酸分子包含在载体内。

4.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述第一分离的核酸分子包含在重组细胞内。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述第一分离的核酸分子整合在所述重组细胞的染色体内。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述第一分离的核酸分子在所述重组细胞的染色体外。

7.如权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述重组细胞是干细胞。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述动物是哺乳动物。

9.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述动物是选自小鼠、猪、狗、大鼠和人的哺乳动物。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。

11.分离的FGF-9多肽以及FGF2多肽在制备用于促进动物内成熟血管形成的药物中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述FGF-9多肽由选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述FGF-9多肽由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。

14.如权利要求11-13中任一项所述的用途，其中所述动物是哺乳动物。

15.如权利要求11-13中任一项所述的用途，其中所述动物是选自小鼠、猪、狗、大鼠和人的哺乳动物。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

17.用于促进动物内成熟血管形成的组合物，其包含产生分离的FGF-9多肽的重组细胞和FGF2多肽。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述FGF-9多肽由选自SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述FGF-9多肽由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。

20.如权利要求17-19中任一项所述的组合物，其中所述动物是哺乳动物。

21.如权利要求17-19中任一项所述的组合物，其中所述动物是选自小鼠、猪、狗、大鼠和人的哺乳动物。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述哺乳动物是人。

23.如权利要求17-22中任一项所述的组合物，其中所述重组细胞是干细胞。

24.如权利要求1-10和17-23中任一项所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。

25.如权利要求1-10和17-23中任一项所述的组合物，还包含螯合剂。

26.如权利要求1-10和17-23中任一项所述的组合物，还包含防腐剂。

27.权利要求1-10和17-26中任一项所述的组合物用于制备促进个体内成熟血管形成的药物的用途。

28.试剂盒，包含权利要求1-10和17-26中任一项所述的组合物以及用于将所述组合物给予个体以促进成熟血管形成的说明书。