CN102070719A - 一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47 - Google Patents
一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，它是由人CD47蛋白胞外段即第1~142位氨基酸和TrxHis表达标签组成，表达载体是pET32a。转化大肠杆菌BL21后采取25℃低温诱导24h实现与TrxHis可溶性融合表达，用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。TrxHis-hCD47在体外可通过基因工程进行大量合成，应用于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体SIRP-α（signal regulatory protein alpha）结合，阻止白血病干细胞上的CD47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种可溶性蛋白，它是由人SIRPα的配体CD47的胞外段，和氨基末端融合的TrxHis表达标签组成的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，属于医药技术领域。
背景技术
CD47又叫整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，最初从人胎盘与整合素αVβ3共纯化及从血小板与β3整合素共免疫沉淀而为人们所认识，其功能与整合素相关，因此称其为IAP[1]。CD47是一种广泛表达的抗原，存在于所有组织的不同细胞上。它是一个50kD的膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。其胞外段即N端为以IgV样结构域，之后为高度疏水的五次跨膜区，胞浆区即C端为3～36氨基酸长度的四种不同的剪切体。CD47最初是作为整合素依赖的白细胞对细胞外基质蛋白反应的调节分子来发挥作用的，但除此之外，CD47还有许多其他的重要功能。红细胞及机体其他正常细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合可调节巨噬细胞的靶向清除作用，从而组织巨噬细胞对正常细胞的吞噬作用。CD47与血小板上的αIIbβ或αVβ3，黑素瘤细胞和卵巢肿瘤细胞上的αVβ3平滑肌细胞和血小板上的α2β1之间存在相对稳定的交互作用，促进血小板活化、聚集，肿瘤细胞和平滑肌细胞的趋化与扩散。CD47同时也是细胞外基质蛋白血小板反应素(thrombospondin，TSP)的受体，CD47与单克隆抗体及血小板反映素的结合可诱导半胱天冬酶依赖的凋亡作用。CD47是T细胞活化的共刺激因子，活化凋亡过程，诱导T细胞无反应性。CD47作为SIRPα的胞外配体，在巨噬细胞对肿瘤细胞的清除过程中发挥这重要作用。
信号调节蛋白α(SIRPα)是免疫球蛋白超家族成员，胞外区为三个免疫球蛋白样结构域；胞浆区是酪氨酸磷酸化结合位点。CD47通过与巨噬细胞上SIRP-a的相互作用，使SIRPa上的ITIM基序磷酸化，募集包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶至胞膜，抑制细胞表面肌球蛋白的聚集，从而抑制吞噬作用。包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶包括SHP-1和SHP-2，均是非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，SHP-1主要表达在造血细胞上，逆向调节许多细胞功能；SHP-2表达广泛，调节小GTP结合蛋白Ras，Rho的功能，正向 调节细胞功能。最早确定CD47在调节吞噬中的作用的证据是来源于CD47缺陷的小鼠的RBC移植入野生鼠体内后被迅速清除，RBC表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRP-a结合，传递抑制信号，与巨噬细胞表面受体与吞噬性配体结合产生的吞噬性信号相冲突，使红细胞不被吞噬。
有研究表明，对于白血病来说，巨噬细胞的吞噬作用是肿瘤免疫监视的重要调节因素，髓系，淋巴系白血病细胞及白血病干细胞上CD47表达上调，可通过与SIRPa间的相互作用，阻止白血病细胞被宿主的先天免疫系统清除。这也是白血病耐药、复发的重要原因之一。通过单克隆抗体阻断CD47/SIRPα间的作用，可以促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要的治疗意义。
本发明基于CD47在调节吞噬中的重要作用，表达了可溶性的CD47的胞外段蛋白，与白血病细胞上CD47竞争结合巨噬细胞上的SIRPα，从而促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用
发明内容
本发明的目的是提供一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，该蛋白可以结合于巨噬细胞细胞表面，有效地增强巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用。
本发明的技术方案是：一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：它是由人CD47蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中hCD47蛋白胞外段是hCD47第1-142位氨基酸。
所述的hCD47第1-142位氨基酸包含负责与SIRPα受体结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
所述氨基末端融合的TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
所述白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hCD47是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。
本发明的特点是：TrxHis-hCD47在体外可以通过基因工程进行大量生产，应 用于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体SIRP-α(signal regulatory protein alpha)结合，阻止白血病细胞及白血病干细胞上的CD47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要意义。
附图说明
图1、hCD47胞外段蛋白的结构、构建和作用模式图；
图2、目的基因(hCD47)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
图3、表达载体pET32a-hCD47的结构示意图；
图4、表达载体pET32a-hCD47的酶切鉴定图；
图5、TrxHis-hCD47融合蛋白表达的蛋白电泳图；
图6、TrxHis-hCD47融合蛋白的纯化的电泳图；Western blot定性检测：
图7、TrxHis-hCD47融合蛋白的活性检测图；
图8、荧光显微镜下计数吞入Jurkat细胞的巨噬细胞数。
具体实施方式
以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。
1、构建表达载体。图1是融合蛋白的结构、构建和作用模式图。根据hCD47的序列设计引物P1：5’-GATATCATGTGGCCCCTGGTAGCGG-3’；P2：5’-GGATCCATTTTCATTTGGAGAAAACC-3’。以人淋巴结cDNA为模板，聚合酶链反应扩增编码hCD47胞外段氨基酸的多核苷酸序列(图2)，1.5％琼脂糖电泳回收后与pMD18-T载体16℃连接2小时，热休克转化大肠杆菌XL10，扩增后将目的片段亚克隆至表达载体pET32a(+)，构建pET32a-hCD47(图3)，限制性酶切(图4)、测序鉴定。
图1、hCD47胞外段蛋白的结构、构建和作用模式图。
图2、目的基因(hCD47)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，1道(M)是分子量标志(DL2000)，箭头所指为扩增片段。
图3、表达载体pET32a-hCD47的结构示意图。
图4为表达载体pET32a-hCD47的酶切鉴定图；(质粒分别用限制性内切酶EcoRV+BamHI双酶切和EcoRI单酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。M道是marker DL2000，1-4道分别是不同克隆的酶切结果)
2、诱导表达融合蛋白。将表达载体pET32a(+)、pET32a-hCD47分别以热休克法转化大肠杆菌BL21，涂布含100μg/ml氨苄青霉素LB平板，37℃培养12小时后挑取单 克隆接种到含100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基，200rpm，37℃培养12h，以1％转接到新鲜LB(+)培养基中，200rpm，37℃培养3h后，加入终浓度1.0mM的IPTG，200rpm，25℃培养24h。
3、获得TrxHis-hCD47的包涵体蛋白。离心收集细菌，200μl/ml培养基PBS重悬细菌，超声裂菌，加入1％Triton-X100，混匀，4℃静置30分钟，4℃离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测发现，TrxHis-hCD47蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中(图5)。
图5为TrxHis-hCD47融合蛋白表达的蛋白电泳图。将质粒pET32a(+)、pET32a-hCD47分别转化大肠杆菌BL21，小体积培养后IPTG诱导融合蛋白的表达，然后取全细菌裂解物、裂解上清(可溶性组分)和裂解沉淀(即包涵体)分别进行SDS-PAGE分析。M是分子量标志(由上到下分别是170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD，25KD，15KD，10KD)
4、纯化包涵体蛋白。pET32a(+)空载体蛋白TrxHis从细菌裂解上清中纯化，TrxHis-hCD47以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)纯化包涵体蛋白，所有纯化步骤以ProBondTM纯化手册操作。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，然后用抗His标签抗体进行Western blot，见在TrxHis-hCD47可检测到大小正确的蛋白条带(图6)。
图6为TrxHis-hCD47融合蛋白的纯化及Western blot检测。从转化有质粒pET32a-hCD47的转化大肠杆菌BL21的复性上清用镍金属螯合柱纯化含有His标签的蛋白，进行SDS-PAGE分析。M道是蛋白分子量标志。下图是融合蛋白Western blot检测结果，一抗是抗His标签抗体。
5、蛋白活性测定：将小鼠巨噬细胞系RAW264.7以2×105/孔的密度接种于12孔板中，贴壁过夜。之后将Dio标记的人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞以2×104/孔的密度添加到预先接种有巨噬细胞的十二孔板中，同时添加CD47胞外段蛋白(6μg/ml)，Trx蛋白(6μg/ml)作为对照。处理组和对照组分别设三个复孔。蛋白作用2小时后荧光显微镜下计数吞噬有Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，并对结果进行统计学分析。(图7、图8)
图7为荧光显微镜下观察对照组与处理组巨噬细胞对Jurkat细胞的吞噬情况，箭头所指为吞噬了Jurkat细胞的巨噬细胞。
图8为荧光显微镜下计数吞入Jurkat细胞的巨噬细胞数，分别计数十个视野，之后 对数据进行统计学分析的结果，两样本t检验，P＜0.05，有统计学意义。
由以上可制得本发明这种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，它是由人CD47蛋白胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中hCD47蛋白胞外段是hCD47第1-142位氨基酸。
所述的hCD47第1-142位氨基酸包含负责与SIRPα受体结合的IgV样结构域；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
所述的白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hCD47具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
所述白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hCD47是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。
本发明的一种白血病干细胞靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hCD47在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可与巨噬细胞上的抑制性受体SIRP-α(signalregulatory protein alpha)结合，阻止白血病细胞及白血病干细胞上的CD47与SIRP-α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞及白血病干细胞的吞噬作用，对于白血病的治疗有着重要意义。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47
<130> 无
<160> 6
<170> PatentInversion3.3
<210> 1
<211> 331
No1：TrxHis-hCD47的氨基酸序列（说明书中所指No1序列）
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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idqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhh 120
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ptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswf 300
spnengsefelrrgacgrtrappppplrsgc 331
<210> 2
<211> 996
No2：TrxHis-hCD47的核酸序列（说明书中所指No2序列）
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcg 60
gacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcc 120
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gcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaa 996
<210> 3
<211> 142
No3：hCD47胞外段的氨基酸序列（说明书中所指No3序列）
<212> PRT
<213> Homosapiens
<400> 3
mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkf 60
kgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevtelt 120
regetiielkyrvvswfspnen 142
<210> 4
<211> 426
No4：hCD47胞外段的核酸序列（说明书中所指No4序列）
<212> DNA
<213> Homosapiens
<400> 4
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agagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttcatggttttctccaaat 420
gaaaat 426
<210> 5
<211> 163
No5：TrxHis的氨基酸序列（说明书中所指No5序列）
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvakln 60
idqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhh 120
hhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadi 163
<210> 6
<211> 489
No6：TrxHis的核酸序列（说明书中所指No6序列）
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcg 60
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ccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaac 180
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ctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttg 300
aaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcat 360
catcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaa 420
ttcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatg 480
gctgatatc 489
Claims (5)
1.一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：它是由人CD47胞外段和融合的TrxHis表达标签组成；其中CD47胞外段是指CD47第1～142位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：所述的hCD47第1～142位氨基酸包含与SIRPα结合的IgV样结构域及上游序列；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性蛋白的氨基末端，其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
No1：TrxHis-hCD47的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgipt
lllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtd
dddkamadimwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytf
dgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnengsefel
rrgacgrtrappppplrsgc
No2：TrxHis-hCD47的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatt
tctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactg
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tctccaaatgaaaatggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccact
gagatccggctgctaa。
3.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：所述的白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
No3：hCD47胞外段的氨基酸序列
mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvpt
dfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnen
No4：hCD47胞外段的核酸序列
atgtggcccctggtagcggcgctgttgctgggctcggcgtgctgcggatcagctcagctactatttaataaaacaaaatctg
tagaattcacgttttgtaatgacactgtcgtcattccatgctttgttactaatatggaggcacaaaacactactgaagtatacgt
aaagtggaaatttaaaggaagagatatttacacctttgatggagctctaaacaagtccactgtccccactgactttagtagtg
caaaaattgaagtctcacaattactaaaaggagatgcctctttgaagatggataagagtgatgctgtctcacacacaggaaa
ctacacttgtgaagtaacagaattaaccagagaaggtgaaacgatcatcgagctaaaatatcgtgttgtttcatggttttctcc
aaatgaaaat。
4.根据权利要求2所述的一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
No5：TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygir
giptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmds
pdlgtddddkamadi
No6：TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatt
tctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactg
accgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctg
ttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacct
ggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaa
ccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctg
atatc。
5.根据权利要求1所述的一种白血病干细胞靶向的可溶性蛋白TrxHis-hCD47，其特征是：所述白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47蛋白。
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