CN102062781B - 一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒及其应用。本发明试剂盒包含：探针，蛋白，结合缓冲液，酶标板，酶混合液Ⅰ，酶混合液Ⅱ，显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品。所述探针为5’端用生物素标记的双链DNA；所述蛋白为重组人雌激素受体；所述酶标板包被了Ser¹⁶⁷磷酸化雌激素受体单抗；所述酶混合液Ⅰ含有两种磷酸化酶。通过与雌二醇的标准剂量-效应曲线比对，确定样品中环境内分泌干扰物相对于雌二醇的累计类雌激素效应。本发明试剂盒操作简便、快速、通量高。可广泛用于环境、食品检测等领域。

Description

一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及痕量环境内分泌干扰物效应的检测应用领域，具体涉及一种基于雌激素受体介导原理的检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒及其应用。

技术背景

近年来，随着工业污染的不断加剧，环境内分泌干扰物（Endocrinedisrupting compounds，EDCs）成为继工业革命带来的煤烟污染及汽车工业发展带来的光化学烟雾污染之后的第三代环境污染物，将对人类健康产生严重影响。EDCs主要有多氯联苯类、二恶英类、烷基酚类、邻苯二甲酸酯类、农用化学品类、天然或合成的激素药物等类雌激素物质，他们可模拟体内天然的雌激素，与雌激素受体竞争性结合，阻止体内雌激素与其受体的结合，充当雌激素受体拮抗剂，从而抑制雌激素活性，发挥类雌激素作用，动物胚胎期暴露可诱导生殖系统发育畸形、功能异常以及乳腺分泌异常等。

因为环境内分泌干扰物以痕量的混合物形式存在于污水、土壤等环境中，其检测常常受到诸多限制，成为近年来研究热点之一。

目前，各国多以气相色谱（GC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）法作为检测EDCs的标准方法。但由于EDCs通常以痕量混合物的形式存在，且环境中存在着大量的天然的或人工合成的化学物，截止到2010年11月21日，在美国化学文摘社（Chemical Abstracts Service，CAS）登记的天然的或人工合成的化学物达62287480种（http://www.cas.org/cgi-bin/cas/regreport.pl.2010-11-21），面对如此多的化学物，采用传统的萃取富集、高效液相色谱/质谱/气相色谱等方法分离出单一成分并测定含量的试验方法已无法满足需求，所以必须探索通量高而又廉价的筛选方法。

1998年美国美国环保局（U.S.EPA）推出了《环境内分泌干扰物筛检程序》（U.S.EPA,1998；Federal Register,63:71542-71568.）；1997年，Gaido等建立了环境雌激素酵母测评体系（Gaido K W,et al.Toxicol ApplPharmacol,1997,143(1):205-212）；Kim等（Kim SB，et al.Anal Sci.2003,19:499-504）制备了荧光-ER的EDCs阵列玻片筛选技术，都是基于高通量的设想，但仍然存在周期长、细胞培养的不稳定性等局限，使得这些方法通量低、周期长、系统误差很大，准确性和灵敏度差，只能半定量，而且样品中的EDCs也可能被细胞降解。实际上，评估痕量混合物的综合生物学效应及累加毒性当量（TEQ）更有意义。目前基于受体配体结合的筛选方法，既可以反映EDCs的结合量，又能综合反映其类雌激素样累加毒性当量，且易于实现高通量，是最近几年EDCs高通量筛选和监测的新方向。

经典的雌激素-受体信号传导理论认为，天然雌激素通过与雌激素受体α（estrogen receptorα，ERα）中的配体结合域(LBD)结合后，受体发生变构而形成二聚体，从而暴露DNA结合区，使特异的DNA序列即雌激素效应元件(estrogen response elements，ERE)与之结合，刺激靶基因转录，从而表现出各种生理效应。在ER活化和DNA结合过程中，ERα的磷酸化起着十分重要的作用，537位酪氨酸（Tyr⁵³⁷）磷酸化位点是ERα的基本磷酸化位点，其重要作用是调控ERα的二聚体化，同时也是雌激素依赖的丝氨酸高度磷酸化以及ERα结合DNA的前提条件；而167位丝氨酸（Ser¹⁶⁷）磷酸化是雌激素依赖的。环境雌激素（即EDCs）作为配体，以与内源雌激素类似的形式与ERα结合,并和内源雌激素如雌二醇（E₂）一样，主要通过ERα介导而产生相应的生理效应。根据此分子作用机制，同时利用抗原抗体结合的特异性、生物素亲和素结合的敏感性和放大作用，本发明建立了基于ERα激活效应的ELISA检测方法，以检测和评估雌激素效应，为环境类雌激素污染的检测和应用提供一种新的快捷、高通量方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种廉价、快速、高通量的检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒及其在环境及食品类雌激素污染检测中的应用。

本发明采用的技术方案是这样的，即一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒，其特征在于其组成包括：探针，蛋白，结合缓冲液，酶标板，酶混合液Ⅰ，酶混合液Ⅱ，显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品；所述探针为5’端用生物素标记的双链DNA，该序列含有至少一个雌激素反应元件核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸，能特异结合配体-ER二聚体；所述蛋白为重组人雌激素受体；所述酶标板为一抗包被的聚苯乙烯板，所包被的一抗为167位丝氨酸磷酸化的雌激素受体的单克隆抗体（anti-phospho-Ser¹⁶⁷）；所述标准品为1×10^-6mol/L的雌二醇。

本发明的一个非限定性的实施例中,上述探针的核苷酸正链序列为SEQNo1。

上述酶混合液Ⅰ为含有Ser¹⁶⁷特异性磷酸化酶CKⅡ，Tyr⁵³⁷特异性磷酸化酶p60^c-src和ATP的TE缓冲液。

上述酶混合液Ⅱ为含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液。

10×浓缩洗涤液每升由80gNaCl、11.5g Na₂HPO₄·2H₂O、2g KH₂PO₄、2gKCl、5ml Tween-20、0.5g poly(dI:dC)及余量为去离子水组成的混合液。

显色液分为A、B两种，分别含有过氧化氢和四甲基联苯胺。

终止液为1mol/L的硫酸。

本试剂盒中蛋白保存于-70℃，探针保存于-20℃，尽量减少反复冻融，其余组分保存于4℃。

本发明利用配体-受体生物学激活效应的高效、特异性，生物素-亲和素的放大效应和辣根过氧化酶催化底物显色的灵敏性，以及ELISA操作的便捷性，构建了痕量环境内分泌干扰物累加毒性当量的快速ELISA检测试剂盒，实现痕量环境内分泌干扰物效应的廉价、快速、高通量监测。

本发明试剂盒使用方法包括以下步骤：

(1)标准品用结合缓冲液稀释为1×10^-6mol/L～1×10^-12mol/L共7个梯度；蛋白用结合缓冲液稀释为2×10^-9mol/L；10×浓缩洗涤液用去离子水稀释为1×洗涤液；

(2)受体配体体外结合：总体积100μL，其中含50μL标准品或待检样品以及50μL稀释后的蛋白，于4℃振摇孵育1小时，形成配体-受体复合物；以50μL不含样品或不含标准品的结合缓冲液作为本底对照；所有反应均做复孔；

(3)受体磷酸化及探针结合：向步骤（2）的复合物中加入20μL酶混合液Ⅰ，37℃孵育30分钟，再加入探针1μL，37℃反应10分钟，成生物素DNA探针-雌激素受体-EDC复合物；

(4)ELISA反应：将步骤（3）的复合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶标板中，室温孵育1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入50μL链亲和素标记的辣根过氧化物酶混合液，37℃孵育0.5-1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入显色液A和B各50μL，37℃孵育15分钟，加入50μL终止液；同时做ELISA的试剂空白对照；

(5)酶标仪检测：在ELISA检测仪上，以试剂空白对照调零，以630nm波长做校正，于450nm波长处，测定各孔吸光度值；

(6)结果计算：相对吸光度值=样本或标准品吸光度值-本底对照吸光度值，与以雌二醇为标准品所作的标准剂量-效应曲线作比对，确定待测样品中环境内分泌干扰物相对于雌二醇的累计类雌激素效应EEQ。

本发明试剂盒方法的优点在于：（1）操作简便、快捷，读取ELISA板的酶标仪已常规化，普通实验室即可开展，与GC、GS/MS分析法相比，本技术没有鉴定复杂混合物的困难，由于模拟类雌激素生物学过程，能够反映EDCs的综合雌激素样效应；而GC和GS/MS分析操作繁琐、技术要求高、成本昂贵；（2）与我们前期建立的ERC-PCR定量方法相比，本方法的进步在于缩短了实验周期，本试剂盒在1天内就能出具结果、试验周期极短；同时，由于酶标仪的常规化，仪器便宜，更适合基层实验室普及和开展；（3）由于利用了生物素-亲和素的放大效应，使得本试剂盒灵敏度高，检测限可达到nM～pM级，可广泛用于食品、环境检测等领域。

附图说明

附图1为以雌二醇（E2）为标准品作的标准剂量-效应曲线示意图；

附图2显示传统的液相色谱-质谱法的检测能力示意图。

附图3传统的GC/MS方法对混合样本中EDCs的检测鉴定能力示意图。

具体实施方式

下面的实施例意在说明实施本发明的现已知的一个最佳的实施方案，但是不应该认为本发明局限于这些实施例。

实施例1一抗包被的聚苯乙烯酶标板的制备

用双蒸水将聚苯乙烯酶标板润洗三次，烘干备用。用包被缓冲液将针对雌激素受体167位丝氨酸磷酸化的特异性单克隆抗体

（anti-phospho-Ser¹⁶⁷）进行1:100稀释后，取100μL加入酶标板内，封板，4℃包被过液。弃包被的抗体溶液，洗涤液洗板5次，每次3分钟。在纸巾上将酶标板拍干，每孔加入封闭液350μL，封板，4℃封闭过夜。弃封闭液，用洗涤液洗涤5次，每次3分钟，将酶标板真空干燥，密封入带干燥剂的金属箔袋内，4℃保存。其中，包被缓冲液为pH9.6的碳酸缓冲液，含有15mmol/L碳酸钠(Na₂CO₃)，35mmol/L碳酸氢钠(NaHCO₃)；封闭液为含5%BSA和0.05%吐温-20的PBS溶液；洗涤液为pH7.4的磷酸盐缓冲液：含有0.05%吐温-20，0.05mg/ml poly(dI:dC)，1.5mmol/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，8mmol/L磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，140mmol/L氯化钠(NaCl)，2.5mmol/L氯化钾。所述的雌激素受体167位丝氨酸磷酸化的特异性单克隆抗体购自美国Sigma试剂公司。

实施例2生物素标记的双链DNA探针的制备

合成5’端用生物素标记的DNA探针正链：5’-Biotin-GGCTGGCCGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGGGGTCAAGGTGACCCCCGGGGTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGGG-3’，用SEQ No1表示;合成其互补链为5’-CCCACAAACCATCCCT TTTAGACAAGTGACCCCGGGGGTCACCTTGACCCCTGCAGTGAGCCAGACCAAACTTCCACGCCAGGCCAGCC-3’,用SEQ No2表示。序列由上海生物工程有限公司标记和合成。用退火缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA，pH=8.0)溶解DNA探针正链及其互补链，使其终浓度为20～100umol/L。将二条链等摩尔混合，于94℃保温5分钟后、45℃保温5分钟，冷却至室温，SDS-PAGE纯化双链DNA探针，测定浓度后，用TE稀释探针至浓度为5ng/μL，装入1.5ml朔料离心管，-20℃保存。

实施例3标准品雌二醇的剂量-效应曲线绘制

以雌二醇E2为标准品，使用本发明试剂盒进行检测，观察雌二醇的结合能力，并绘制标准剂量-效应曲线。包括以下步骤：

(1)标准品用结合缓冲液稀释为1×10^-6mol/L～1×10^-12mol/L共7个梯度。

(2)雌激素受体蛋白用结合缓冲液稀释为2×10^-9mol/L；所述雌激素受体蛋白购自美国Sigma试剂公司。

(3)10×浓缩洗涤液用去离子水稀释为1×洗涤液。

(4)受体配体体外结合：总体积100μL，其中含50μL标准品以及50μL步骤（2）所述稀释后的雌激素受体，于4℃振摇孵育1小时，形成配体-受体复合物。

(5)受体磷酸化及探针结合：向步骤（4）的复合物中加入20μL酶混合液Ⅰ，37℃孵育30分钟，再加入实施例2所述探针10μL，37℃反应10分钟，成生物素DNA探针-雌激素受体-EDC复合物；以50μL不含样品或不含标准品的结合缓冲液作为本底对照；所有反应均做复孔。所述酶混合液Ⅰ为每毫升TE缓冲液中含有100～150国际单位的Ser¹⁶⁷特异性磷酸化酶CKⅡ，100～150国际单位的Tyr⁵³⁷特异性磷酸化酶p60^c-src，0.01毫摩尔ATP；所述Ser¹⁶⁷特异性磷酸化酶CKⅡ购自美国Calbiochem试剂公司，所述Tyr537特异性磷酸化酶p60c-src购自美国Millipore-Upstate公司。

(6)ELISA反应：将步骤（5）的复合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶标板中，室温孵育1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入50μL混合酶Ⅱ，37℃孵育0.5-1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入显色液A和B各50μL，37℃孵育15分钟，加入50μL终止液。同时做ELISA的试剂空白对照。所述混合酶Ⅱ为每毫升PBS缓冲液中含有0.5～1毫克链亲和素标记的辣根过氧化物酶。

(7)酶标仪检测：在ELISA检测仪上，以试剂空白对照调零，以630nm波长做校正，于450nm波长处，测定各孔吸光度值，也即OD值。

(8)结果计算：相对吸光度值=样本或标准品OD值-本底对照OD值。用spss13.0软件拟合以雌二醇（E2）为标准品的剂量-效应曲线，见附图1，并确定半数有效浓度EC₅₀。用待检样品与标准剂量-效应曲线作比对，即可确定待测样品中环境内分泌干扰物相对于E2的累计效应。

(9)结果：结果显示，雌二醇的结合能力好，可达nM～pM级，线性关系良好。雌二醇的半数有效浓度EC_50·E2=112pmol/L，最低检测限E2可达1×10^-11mol/L。

实施例4本发明试剂盒在环境样品中的检测应用

以池塘污水为环境样品，水样采集后，12000g，10min离心，采上清作为检测水样原液，环境水样原液浓度设为1，用去离子水2倍倍比稀释，使环境水样系列浓度为1、2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5共6个梯度。以此6个样本作为样品，按照实施例3所述步骤代替标准品进行实验，所有样本均做复孔。得到6样本的相对吸光度值，见附图2，用spss13.0软件拟合计算样品的半数有效浓度EC₅₀。

结果显示，系列环境样品的EC_50·样品=0.104，则环境水样品的类雌激素效应EEQ=EC_50·E2/EC_50·样品=1.08nmol/L。

实施例5本发明ELISA试剂盒与传统的GC/MS方法的比较

采用SHIMADZU LC-MS-2010液-质联用仪进行分析。液相色谱条件：色谱柱采用phenome gemini C18柱(2.0mm×10.0cm×3μm);流动相为80℅-20℅的乙腈，第0min时，水:乙腈为20:80（V:V），第15min时，水:乙腈为80:20（V:V），期间水和乙腈的体积比均匀变化；柱温30℃，流速1ml/min，进样量5μL。质谱条件：电喷雾接口进样，接口温度为250℃；ESI/MS采用阳离子模式，MS分析器质量扫描范围为m/z50～2000；喷雾电压为4500V，雾化器压力为0.2MPa；逆向干燥气体N₂温度为200℃，流速为1.5L/min；四级杆质量分析器质量扫描范围为m/z100～500；DC电压为5V，RF电压为150V；检测方式为正离子多离子反应监测（MRM）模式。E1、E2、E3、DES、DMP、PCB153、DBP、NP、4,4-DDT、BPA的定量离子m/z分别为271、273、289、269、195、362、269、221、355、229。

检测的样品包括：包含有E1、E2、E3、DES、DMP、PCB153、DBP、NP、4,4-DDT、BPA共10种EDCs的混合标准品，各自终浓度分1×10^-6、1×10^-8、1×10^-10、1×10^-12、1×10^-14mol/L共5个梯度的样品。

结果：利用传统的GC/MS方法，在10种EDCs中只有DMP、PCB153、4,4-DDT三种物质能在各水平恒定的检测出，见附图3；E3在1×10^-8水平检出，E1仅在1×10^-6，而E2、DES、NP、BPA及DBP在1×10^-6水平就已经无法检出。结果显示不同浓度梯度的混合标准品中传统的液相色谱-质谱联用方法虽然检出限低、灵敏度高，但在复杂混合样品中的检出能力有限，不能用统一的条件去测定混合物中各组分的含量，例如《GB5749-2006生活饮用水卫生标准》列出的半挥发性有机物指标约有30种，而相应的检测方法有近26种（见《GB/T5750-2006生活饮用水标准检验方法》）。检测方法的单一性使得完全按标准方法来进行水质全分析需要花费大量的时间和人力。

而本发明试剂盒的主要优势在于：(1)测量毒性当量：以雌二醇为标准品，定量测定环境样品中混合EDCs相对于雌二醇的含量，即相对于雌二醇的累计类雌激素效应EEQ，以此评价环境样品的可能的生物学效应；而不像LC/MS方法那样每种条件只能测一种物质而耗时费力；(2)操作简便，普通实验室即可开展；(3)实验周期短，1天即可出具检测报告；(4)成本低廉。

有关的核苷酸序列：

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒及其应用

<160>2

<170>

<210>1

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针正链

<223>根据雌激素反应元件而设计，含有一个雌激素反应元件，其5’端用生物素标记，作为结合雌激素受体的特异序列。

<400>1

5’-Biotin-

GGCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGGGGTCAAGG

TGACCCCCGGGGTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGGG-3’

<210>2

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针互补链

<223>为SEQ No1的互补链

<400>2

5’-

CCCACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTGACCCCGGGGGTCACCTTGACCCCTGCAGTGA GCCAGACCAAACTTCCACGCCAGGCCAGCC-3’

Claims (3)

1.一种检测痕量环境内分泌干扰物效应的ELISA试剂盒，其特征在于其组成包括：探针，蛋白，结合缓冲液，酶标板，酶混合液Ⅰ，酶混合液Ⅱ，显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品；所述探针为5’端用生物素标记的双链DNA，该序列含有至少一个雌激素反应元件核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸，能特异结合配体-ER二聚体；所述蛋白为重组人雌激素受体；所述酶标板为一抗包被的聚苯乙烯板，所包被的一抗为167位丝氨酸磷酸化的雌激素受体的单克隆抗体；所述标准品为1×10^-6mol/L的雌二醇；所述探针的核苷酸正链序列为SEQ No1；所述酶混合液Ⅰ为含有Ser¹⁶⁷特异性磷酸化酶CKⅡ，Tyr⁵³⁷特异性磷酸化酶p60^c-src和ATP的TE缓冲液；所述酶混合液Ⅱ为含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液；所述10×浓缩洗涤液为每升由80gNaCl、11.5g Na₂HPO₄·2H₂O、2g KH₂PO₄、2g KCl、5ml Tween-20、0.5g poly(dI:dC)及余量为去离子水组成的混合液。

2.一种采用权利要求1所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)标准品用结合缓冲液稀释为1×10^-6mol/L～1×10^-12mol/L共7个梯度；蛋白用结合缓冲液稀释为2×10^-9mol/L；10×浓缩洗涤液用去离子水稀释为1×洗涤液；

(2)受体配体体外结合：总体积100μL，其中含50μL标准品或待检样品以及50μL稀释后的蛋白，于4℃振摇孵育1小时，形成配体-受体复合物；以50μL不含样品或不含标准品的结合缓冲液作为本底对照；所有反应均做复孔；

(3)受体磷酸化及探针结合：向步骤（2）的复合物中加入20μL酶混合液Ⅰ，37℃孵育30分钟，再加入核苷酸正链序列为SEQ No1的探针1μL，37℃反应10分钟，成生物素DNA探针-雌激素受体-EDC复合物；

(4)ELISA反应：将步骤（3）的复合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶标板中，室温孵育1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入50μL酶混合液Ⅱ，37℃孵育0.5-1小时，弃上清，350μL洗涤液洗涤5次；加入显色液A和B各50μL，37℃孵育15分钟，加入50μL终止液；同时做ELISA的试剂空白对照；

(5)酶标仪检测：在ELISA检测仪上，以试剂空白对照调零，以630nm波长做校正，于450nm波长处，测定各孔吸光度值；

(6)结果计算：相对吸光度值=样本或标准品吸光度值-本底对照吸光度值，与以雌二醇为标准品所作的标准剂量-效应曲线作比对，确定待测样品中环境内分泌干扰物相对于雌二醇的累计类雌激素效应EEQ。

3.权利要求1所述试剂盒在环境及食品类雌激素污染检测中的应用。

Images