CN102033126B - 一步法制备微流诊断芯片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流诊断芯片的制作方法，包含在芯片模具表面定点固定生物大分子的步骤，其特征在于在所述定点固定步骤中，首先利用防粘涂料涂覆在芯片模具表面；再将生物大分子溶液点样于特定区域；然后浇铸PDMS；待PDMS浇注层固化后进行脱模，同时揭下所固定的生物分子。如此，通过一步法实现芯片制备与生物分子固定的同步完成，快速高效地缩短工艺流程所需时间，降低了制造微流诊断芯片的成本。
Description
技术领域
本发明涉及微流诊断芯片技术领域，具体地说涉及的是一种在芯片内表面定点固定生物分子以制作微流诊断芯片的方法。
背景技术
经过十几年的发展，微流诊断芯片已经在生化分析领域得到了广泛应用，其中微量多元诊断芯片已成为未来临床诊断中的一个新的发展方向。制作微流诊断芯片材料主要有PDMS(聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsi loxane)等高分子材料，其具有加工成型方便、价格便宜，可以廉价的大批量生产的优点。
微流诊断芯片除了制作微管道结构用于反应，往往还需要将生物大分子固定在管道内部，以便后续的捕获、分离及抗原抗体(核酸杂交)等生物反应的进行。制作过程通常分为两个步骤，首先是高分子材料芯片的制作，然后是芯片表面的改性和生物分子的固定。生物分子在高分子材料表面的有效固定是构建诊断芯片的核心步骤，目前常用的方法主要是对高分子材料表面进行改性，赋予高分子材料的疏水表面以亲水性，进而有效固定特异抗体分子，较少非特异性吸附。经过对现有文献进行检索，2009年Peng Li等在Microfluid and Nanofluid发表文章中(Peng Li，Assem Abolmaaty，ChristineD’Amore，etal，Development of an ultrafast quantitativeheterogeneous immunoassay on pre-functionalized poly(dimethylsiloxane)microfluidic chips for the next-generationimmunosensors)利用蛋白A对PDMS进行表面修饰，在PDMS流道内表面固定牛IgG，制备免疫反应芯片。而新加坡Ling Yu等人在文章中(Ling Yu，Chang Ming Li，Yingshuai Liu，etal，Flow-through functionalized PDMSmicrofluidic channels with dextran derivative for ELISAs.Lab Chip，2009，9，1243-1247)提出利用葡聚糖修饰PDMS芯片表面，共价固定兔IgG抗体，制作检测兔IgG的ELISA芯片。但上述这些方法步骤多，成本高，制备速度慢，最大的问题是很难在芯片内特定的位置进行生物分子的固定，极大限制了微流诊断芯片的廉价大批量生产。法国学者Kevin A.Heyries等发表文章提出新的方法(Kevin A.Heyries，Céline A.Mandon，LauraCeriotti，etal，“Macromolecules to PDMS transfer”as a general routefor PDMS biochips.Biosensors and Bioelectronics 24(2009)1146-1152)，在Teflon 3D模具上点样CRP等生物分子，然后浇铸PDMS，利用直接转印法将CRP等生物分子的固定与PDMS反应池制作一步法完成，大大简化了生物分子在PDMS表面的固定困难。但上述方法中所得的固定有生物分子的PDMS芯片为平面结构，而反应池是通过另外加工的基于SU-8的微管道芯片与其相键合形成，这样还需后续的管道结构加工，工序复杂，如果能将微流诊断芯片制作和生物大分子固定一步完成，将极大简化目前工艺流程，加快微流诊断芯片的制作过程，促进诊断芯片早日走向市场。
因此，有必要开发一种新的在芯片内表面进行生物分子定点固化以便快速制作微流诊断芯片的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种微流诊断芯片结构制作的方法，尤其涉及一种一步法制备微流诊断芯片的方法。
本发明方法在保持高分子材料对模具图形复制好、易脱模的优点同时，使蛋白抗体等生物分子的特异地固定与芯片制作同时完成，从而快速制作微流诊断芯片。
本发明是通过以下技术方案实现的，首先制作微流诊断芯片的阳版模具，在模具表面涂覆防粘涂层，例如Teflon层，再将蛋白抗体溶液喷点于芯片模具表面特定的位置，随后浇铸PDMS，热烘后脱模，与玻片键合，使微流诊断芯片制作与蛋白抗体固定同步完成，大大缩短工艺流程所需时间。
本发明方法包括如下步骤：
第一步，首先是制作阳版模具，可采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具，或在基底片上旋涂光刻胶，通过光刻显影后形成光刻胶模具；也可通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具等。
第二步，在阳版模具表面均匀滴加Teflon溶液，甩涂机适当转速进行甩涂。
第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具进行热烘，自然冷却。
第四步，利用点样仪在芯片特定位置喷点蛋白抗体溶液，形成阵列。
第五步，将PDMS的预聚体与固化剂混合，经超声、搅拌、真空脱气等步骤后浇铸在阳版模具上，适当温度热烘，自然冷却。
第六步，PDMS芯片从模具上揭下来进行键合，经过表面封闭处理后就得到了已固定蛋白抗体的微流控诊断芯片。
本发明和传统的两步法制备相比，具有成本低(无需复杂昂贵的表面修饰试剂)、制备时间短(一步法完成，完全省略了固定蛋白抗体之前繁复的表面改性步骤)、蛋白抗体固定效果好、非特异性吸附小、可即做即用的优点，因此具有广泛的应用前景。
附图说明
图1本发明的工艺路线示意图，其中显示了根据本发明的方法制作的微流控芯片在各个步骤中的剖面结构。
图2为实施例1中检测人IgG的荧光显微镜图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明方法的具体实施例作详细说明。
图1的示意图显示了根据本发明的方法制作的微流控芯片在各个步骤中的剖面结构。如图1所示，根据本发明的方法主要包括如下步骤：
第一步，首先是制作阳版模具，可采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具，或在基底片上旋涂光刻胶，通过光刻显影后形成光刻胶模具；也可通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具等。
第二步，在阳版模具表面均匀滴加Teflon溶液，甩涂机适当转速进行甩涂。
第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具进行热烘，自然冷却。
第四步，利用点样仪在芯片特定位置喷点蛋白抗体溶液，形成阵列。
第五步，将PDMS的预聚体与固化剂混合，经超声、搅拌、真空脱气等步骤后浇铸在阳版模具上，适当温度热烘，自然冷却。
第六步，PDMS芯片从模具上揭下来进行键合，经过表面封闭处理后就得到了已固定蛋白抗体的微流诊断芯片。
实施例1：一步法制备人IgG微流诊断芯片
(1)光刻胶模板的制备
首先采用SU-8-100型负性光刻胶(美国Micro Chem公司)，以2500r/min的转速在单面抛光的硅片上甩胶，获得厚度为80μm的光刻胶。前烘条件为10min从室温升至65℃，保温10min，然后30min升至95℃，并保温35min，随炉冷。曝光采用德国Karl Suss公司MA6型光刻机，曝光时间为60s。后烘条件为30min从室温升至90℃，并保温10min，随炉冷。采用Micro Chem公司专用的SU-8显影液，显影时间为6min，显影后用异丙醇清洗，氮气吹干，即获得所需的光刻胶模板。
(2)模板表面Teflon处理
把光刻胶模板置于甩涂机上(美国Micro Chem公司)，均匀滴加Teflon溶液，200rpm预转10s，500rpm转30s。
(3)Teflon处理后热烘
把Teflon处理后的光刻胶模板置于烘箱内，180℃热烘2小时，自然冷却。
(4)蛋白抗体的喷点
兔抗人IgG抗体用PBS(1X)稀释成1mg/ml，利用Biodot AD1500工作站进行蛋白喷点，喷点阵列为3*3，间距0.75mm，喷点量20nl。37℃适当干燥。
(5)PDMS浇铸
PDMS前体与固化剂(牌号：sygard 184，美国道康宁公司的产品)按10∶1质量比进行物理混合，充分搅拌，真空脱气20min后浇铸在阳版模具上，90℃热烘20min，自然冷却。
(6)PDMS芯片键合与封闭
将PDMS芯片从模具上揭下，与洁净玻片加压键合。在芯片内注入封闭液(1X PBS含1％BSA，0.1％Tween-20)，37℃湿盒内孵育20min，取出后用1X PBS适当冲洗就得到了人IgG微流诊断芯片。
(7)夹心法检测人IgG
将各浓度人IgG与荧光标记的山羊抗人IgG注入芯片，37℃湿盒内孵育20min，PBST(含Tween-200.1％)冲洗15min，PBS冲洗5min后在荧光显微镜下进行定量检测，结果如图2所示。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (2)
1.一种微流诊断芯片的制备方法，包含在芯片模具表面定点固定生物大分子的步骤，其特征在于，在所述定点固定步骤中，首先利用防粘涂料涂覆在芯片模具表面；再将生物大分子溶液点样于特定区域；然后浇铸PDMS；待PDMS浇注层固化后进行脱模，同时揭下所固定的生物分子；
其中，所述防粘涂料为Teflon材料，所述生物大分子为蛋白抗体；
所述芯片模具采用微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅模具，或在基底片上旋涂光刻胶，通过光刻显影后形成光刻胶模具；或通过激光加工、精机械加工的方法制作金属模具。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中经过防粘处理的芯片模具表面点样生物分子采用手工点样，或机械点样；所述点样类型为接触式点样，半接触式点样或非接触点样。
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