CN102030628A - 十八碳共轭多烯脂肪酸的新型合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及十八碳共轭多烯脂肪酸的新型合成方法，属于营养化学领域。十八碳共轭多烯脂肪酸具有抗癌、降血脂、抗动脉粥样硬化、增加免疫力和减肥等诸多有益的生理活性。该发明是以亚油酸或富含亚油酸的植物油为原料，经甲酯化、溴化、脱溴三步骤后，得到三种十八碳共轭多烯脂肪酸的混合物。依次经低温重结晶、柱层析分离后，分别得到十八碳共轭二烯脂肪酸、共轭三烯脂肪酸和共轭四烯脂肪酸。和之前的合成方法相比，本发明步骤少，条件温和，成本低廉，产率及纯度高，尤其适用于合成活性更强的高共轭脂肪酸。更为重要的是，本发明通过一条合成路线可同时得到十八碳共轭二烯、三烯、四烯脂肪酸这三类活性成分，因而具有更高的经济价值和应用前景。

Description

十八碳共轭多烯脂肪酸的新型合成方法

技术领域

本发明属于营养化学领域，涉及共轭多烯脂肪酸的合成方法。

背景技术

十八碳共轭多烯脂肪酸是指分子中含有二个、三个、四个等多个共轭双键的一类不饱和脂肪酸。近年来的研究表明，此类共轭多烯脂肪酸大多具有一些非常重要的生物活性，如抗癌、降血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、增加免疫力、防治糖尿病、降低甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量、减肥等[1，2]。十八碳共轭多烯脂肪酸目前已经成为在生物化学、食品营养、保健品及药物开发等领域的热点，引发了世界范围内的研究热潮。

根据共轭程度的高低，十八碳共轭多烯脂肪酸可分为共轭二烯、共轭三烯、共轭四烯、共轭五烯、共轭六烯等几大类。研究表明共轭程度越高，活性越强[3，4]。例如，共轭亚麻酸(十八碳共轭三烯脂肪酸，CLnA)比共轭亚油酸(十八碳共轭二烯脂肪酸，CLA)多了一个共轭双键，其活性就比CLA高。而共轭程度更高的十八碳共轭四烯酸(PnA)则具有比CLA，CLnA更强的抗癌活性，因而引起了化学家、生物医学专家、营养学家等的极大兴趣，目前有关PnA的生物活性的研究才刚刚兴起[5]。

十八碳共轭多烯脂肪酸在自然界含量较低，通过合成才能满足日益增长的需要。目前合成十八碳共轭多烯脂肪酸的方法主要有：碱异构化法、脱水法、炔键加成法、氧化-脱水法、醛酯链引伸法、钠汞齐催化消去法、交叉偶联法、溴化-脱溴化氢法等，这些方法各有优缺点。其中，碱异构化法是利用不同浓度的碱溶液催化异构多不饱和脂肪酸，脱水法是利用DBU(1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7)或氢氧化钾催化脱水含羟基的脂肪酸[6-8]。这两类方法步骤简单，成本较低廉，已经实现工业化。但它们主要适合于共轭二烯脂肪酸的合成。

对于十八碳共轭三烯脂肪酸的合成，文献报导的主要有炔键加成法和氧化-脱水法[9，10]。这些方法都存在反应步骤多、试剂昂贵、产率低等缺点。对于十八碳共轭四烯脂肪酸的合成，主要有醛酯链引伸法、钠汞齐催化消去法、交叉偶联法、溴化-脱溴化氢法等方法[11-15]。这些方法步骤复杂、试剂昂贵，涉及到氘代铝锂、KN[Si(CH3)₂]₂、三苯基膦、二异丁基氢化铝、正丁基锂、钠汞齐、三甲基硅锂乙炔、联乙炔、氰化钠、CuCN、(E)-1-丁烯基硼酸等。药物残留高且产率偏低。2004年Kuklev等亦用溴化-脱溴化氢法合成了十八碳共轭四烯酸的四种异构体[16]。该法是先将非共轭的十八碳三烯酸(亚麻酸)溴化，以DBU催化脱溴化氢之后得到十八碳共轭四烯酸。尽管该法步骤较为简单，但利用强氧化性的液溴作为溴化剂会导致大部分亚麻酸发生氧化变质。此外昂贵的催化剂DBU也使得该法成本过高，难于工业化。

总之，现有的合成方法均存在步骤复杂，反应条件剧烈、试剂昂贵、产率较低且不适合共轭程度高的多烯脂肪酸的合成等缺点。此外，这些合成方法均只能得到一类共轭多烯脂肪酸产品。目前仍然缺乏共轭程度更高的多烯脂肪酸的有效合成方法。有鉴于此，探索出一种步骤少，条件温和，产率高、适合多类高共轭脂肪酸的高效合成方法，对共轭多烯脂肪酸的研究和生产是非常必要的，具有很高的经济价值和应用前景。

专利内容

本发明的目的在于：提供十八碳共轭多烯脂肪酸的新型合成方法。

本发明的主要内容如下：以亚油酸或者富含亚油酸的植物油为原料，经甲酯化、溴化、脱溴反应之后，合成含有多种十八碳共轭多烯脂肪酸的粗产物。利用低温重结晶法除去未反应原料物后，得到仅含多种十八碳共轭多烯脂肪酸的混合物。再利用硅胶柱层析法对该混合物进行分离，分别得到十八碳共轭二烯脂肪酸以及更高共轭程度的十八碳共轭三烯脂肪酸和十八碳共轭四烯脂肪酸。

十八碳共轭多烯脂肪酸的具体合成步骤如下：

(1)甲酯化：氮气保护下将原料油与1.0mol/L的H₂SO₄/CH₃OH溶液在40～80℃温度下

反应30～60分钟，加入饱和食盐水分层后，分液得到不饱和脂肪酸甲酯。

(2)溴化：氮气保护下于30-80℃温度间，将上述不饱和脂肪酸甲酯与一定比例的溴化剂在有机溶剂中混合搅拌1-20小时，发生溴化反应。减压蒸发除去有机相，得到不饱和脂肪酸的溴化物。

(3)脱溴：氮气保护下，将上述不饱和脂肪酸的溴化物与1.5-4.5mol/LNaOH/CH₃CH₂OH溶液在30-80℃温度下反应1-5h，酸化至PH值为1-3。得到含有十八碳共轭多烯脂肪酸的粗产物。

(4)纯化：将粗产物溶于甲醇、乙醇、正己烷、石油醚等溶剂中，在-20～10℃之间经低温重结晶法除去未反应的原料物，得到仅含有多种十八碳共轭多烯脂肪酸的混合产物。该混合产物经柱层析法再次提纯，分别得到十八碳共轭二烯脂肪酸以及共轭三烯脂肪酸、共轭四烯脂肪酸。

本合成方法的溴化步骤中，溴化剂可以为溴化铜、溴化氢、N-溴代丁二酰亚胺、溴化钠、溴化四乙铵、溴化钾、溴化铵、溴化十六烷基三甲胺、溴化异戊基镁、溴化苯基镁、氯化溴、溴化甲氧烯丙三甲铵、溴化二甲基溴代硫等。所用的有机溶剂可以是四氯化碳、氯仿、石油醚、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲酸或上述几种溶剂的混合溶剂。经低温重结晶法得到的混合产物，在利用柱层析法进行再次提纯时，所用的流动相为氯仿、乙酸乙酯、甲酸或苯甲酸(比例为590-620∶10-30∶0.5-1)。

利用气相色谱法、紫外光谱法等技术对所得到的产物进行了分离分析。和标准品色谱图比对后发现，原料物经甲酯化、溴化、脱溴反应之后，得到十八碳共轭二烯脂肪酸、十八碳共轭三烯脂肪酸和十八碳共轭四烯脂肪酸的混合物，十八碳共轭多烯脂肪酸的总产率达到60％以上。依次利用低温重结晶法和硅胶柱层析法对该混合物进行分离，分别得到十八碳共轭二烯脂肪酸、十八碳共轭三烯脂肪酸、十八碳共轭四烯脂肪酸。这些共轭多烯脂肪酸各自的产率均达到10％以上，纯度在80％以上。

与之前的合成方法相比较，本发明的优点在于原料价廉，反应步骤较少，操作简单，总产率以及产物纯度较高。最为重要的是，本方法尤其适合于共轭程度较高的脂肪酸，如十八碳共轭三烯脂肪酸以及十八碳共轭四烯脂肪酸的合成，且能够通过一条合成路线同时得到三类共轭多烯脂肪酸，经济高效，弥补了国内外研究的空白。由于共轭程度较高的多烯脂肪酸具有更强的生物活性，因而本发明具有很高的经济价值和应用前景。

附图说明

图1是本发明具体实施例经溴化-脱溴法合成的粗产物的紫外光谱图。

图2是本发明具体实施例溴化-脱溴法的原料物、粗产物、三种标准品的气相色谱图。其中：

图2(a)代表原料物亚油酸的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，2代表亚油酸的色谱峰。

图2(b)代表溴化-脱溴粗产物的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，2代表粗产物的色谱峰。

图2(c)代表十八碳共轭二烯脂肪酸(CLA)标准品的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，3代表CLA标准品的色谱峰。

图2(d)代表十八碳共轭三烯脂肪酸标准品(CLnA)的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，4代表CLnA标准品的色谱峰。

图2(e)代表十八碳共轭四烯脂肪酸标准品的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，5代表十八碳共轭四烯脂肪酸标准品的色谱峰。

图3是本发明具体实施例经提纯后的十八碳共轭多烯脂肪酸的气相色谱图。其中：

图3(a)代表提纯后的十八碳共轭二烯脂肪酸的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，2代表提纯后的十八碳共轭二烯脂肪酸的色谱峰。

图3(b)代表提纯后的十八碳共轭三烯脂肪酸的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，3代表提纯后的十八碳共轭三烯脂肪酸的色谱峰。

图3(c)代表提纯后的十八碳共轭四烯脂肪酸的气相色谱图。1代表内标物十七碳饱和脂肪酸的色谱峰，4代表提纯后的十八碳共轭四烯脂肪酸的色谱峰。

具体实施例

三种十八碳共轭多烯脂肪酸的合成

(1).甲酯化：准确称取3克亚油酸(LA)，加入50mL的1.0mol/L的H₂SO₄/CH₃OH溶液，氮气保护下在40℃温度下反应30分钟。反应结束后加入20毫升饱和食盐水，分层后收集上层油相。反复洗涤三次，得到3.1克亚油酸甲酯。

(2).溴化：氮气保护下，往玉米油脂肪酸甲酯中加入3.94克溴化二甲基溴代硫以及50mL四氯化碳溶液，在50℃下反应4h。抽滤后收集滤液，减压蒸馏得到3.76克玉米油脂肪酸甲酯的溴化产物。

(3).脱溴：氮气保护下，将溴化物溶于30mL 1.6mol/L的NaOH/CH₃CH₂OH溶液中，45℃反应2h，得到含十八碳共轭多烯脂肪酸盐的混合物。加入50℃的去离子水200mL，充分搅拌得到黄色溶液。用6mol/l的HCL溶液酸化至PH值为1。待溶液分层后收集上层油相，去离子水反复洗涤三次，得到2.8克粗产物。其紫外光谱如图1所示。原料物亚油酸以及粗产物的气相色谱图如图2(a)，(b)所示。紫外光谱表明产物主要包括十八碳共轭二烯酸、十八碳共轭三烯酸和十八碳共轭四烯酸。气相色谱定量分析结果表明，共轭多烯脂肪酸的总产率达到72.3％。

(4).提纯：将2.8克粗产物溶于10mL石油醚中，在5℃下静置24h，抽滤并收集滤渣。反复重结晶三次，得到2.07g仅含十八碳共轭多烯脂肪酸的混合产物。采用硅胶柱层析法，以氯仿、乙酸乙酯、甲酸(比例为600∶15∶0.5)为展开剂分离上述初级产物，分别得到纯度为90.5％的十八碳共轭二烯脂肪酸0.37g，产率12.3％，纯度为90.8％的十八碳共轭三烯脂肪酸0.42g，产率13.9％以及纯度为92.3％的十八碳共轭四烯脂肪酸0.33g，产率10.9％。它们的气相色谱分别如图3(a)，(b)，(c)所示。

(5).表征：本发明主要利用紫外光谱以及气相色谱法表征所合成到的三种十八碳共轭多烯脂肪酸。根据文献报导，十八碳共轭二烯脂肪酸、十八碳共轭三烯脂肪酸以及十八碳共轭四烯脂肪酸分别在233nm、268-273nm、305-315nm处有特征吸收[17，18]。粗产物的紫外光谱表明其分别在233，273，285，304，318nm处有紫外吸收，和文献值吻合(图1)。这初步证明本方法合成得到了十八碳共轭二烯、共轭三烯和共轭四烯脂肪酸。为进一步表征这三类脂肪酸，我们又进行了气相色谱分析。比较原料物亚油酸(图2a)和粗产物(图2b)的气相色谱，可以发现大部分原料亚油酸转变成了产物1，产物2和产物3，其保留时间分别为31.5、32.9min；33.9、34.6、36.4min；37.6、38.4min。在相同的色谱条件之下，我们分别测定了一系列标准品的气相色谱。包括十八碳共轭二烯酸两种异构体(9t，11t-CLA、9c，11t-CLA)、十八碳共轭三烯脂肪酸三种异构体(β-桐酸、α-桐酸、石榴酸)和十八碳共轭四烯脂肪酸两种异构体(t-帕里拉油烯酸、c-帕里拉油烯酸)。其保留时间分别在32.7和33.1min(图2c)，33.9、34.7和36.5min(图2d)和37.6和38.5min(图2e)。与粗产物的气相色谱(图2b)对比，发现产物1，2，3分别和上述标准品的保留时间相近。结合紫外光谱图，可以得出结论：产物1即为十八碳共轭二烯脂肪酸；产物2即为十八碳共轭三烯脂肪酸；产物3即为十八碳共轭四烯脂肪酸。

(6).定量分析：气相色谱分析表明，得到的十八碳共轭多烯脂肪酸总产率达到72.3％。粗产物中十八碳共轭二烯酸、十八碳共轭三烯酸、十八碳共轭四烯酸的含量分别为22.5％、26.9％和22.1％。依次经低温重结晶和柱层析法提纯之后，得到了三种高纯度的十八碳共轭多烯脂肪酸。分别是十八碳共轭二烯脂肪酸：纯度90.5％，产率12.3％(图3a)；十八碳共轭三烯脂肪酸：纯度90.8％，产率13.9％(图3b)；十八碳共轭四烯脂肪酸：纯度92.3％，产率10.9％(图3c)。

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Claims (7)

1.一种十八碳共轭多烯脂肪酸的合成方法，其特征在于：以亚油酸或富含亚油酸的植物油为原料，经甲酯化、溴化、脱溴反应之后，合成得到含有三种十八碳共轭多烯脂肪酸的粗产物。依次采用低温重结晶及硅胶柱层析两种方法进行分离后，分别得到十八碳共轭二烯脂肪酸以及共轭程度更高的十八碳共轭三烯脂肪酸和十八碳共轭四烯脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成方法，其特征在于所用原料为亚油酸或富含亚油酸的各种植物油，包括玉米油、葵花籽油、大豆油、红花油、碱蓬籽油等。

3.根据权利要求1所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成方法，其特征在于其合成步骤如下：

(1)甲酯化：氮气保护下将亚油酸或原料油与1.0mol/L的H₂SO₄/CH₃OH溶液在40～80℃温度下反应30～60分钟，得到不饱和脂肪酸甲酯。

(2)溴化：氮气保护下于30-80℃温度间，将上述不饱和脂肪酸甲酯与一定比例的溴化剂在有机溶剂中搅拌1-20小时，发生溴化反应，得到不饱和脂肪酸的溴化物。

(3)脱溴：氮气保护下，将上述不饱和脂肪酸的溴化物与1.5-4.5mol/L NaOH/CH₃CH₂OH溶液在30-80℃温度下反应1-5小时后，酸化至PH值为1-3，得到十八碳共轭多烯脂肪酸粗产物。

(4)纯化：将粗产物溶于甲醇、乙醇、正己烷、石油醚等溶剂中，在-20～10℃之间经低温重结晶法除去未反应的原料物，得到仅含十八碳共轭多烯脂肪酸的混合产物。该混合产物经柱层析法再次提纯，分别得到十八碳共轭二烯以及共轭三烯、共轭四烯脂肪酸。

4.根据权利要求3所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成步骤，其特征在于：溴化剂可以为溴化铜、溴化氢、N-溴代丁二酰亚胺、溴化钠、溴化四乙铵、溴化钾、溴化铵、溴化十六烷基三甲胺、溴化异戊基镁、溴化苯基镁、氯化溴、溴化甲氧烯丙三甲铵、溴化二甲基溴代硫等。

5.根据权利要求3所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成步骤，其特征在于：所用的有机溶剂可以是氯仿、石油醚、乙醇、四氯化碳、正己烷、乙酸乙酯、甲酸或上述几种溶剂的混合溶剂。

6.根据权利要求3所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成步骤，其特征在于：混合产物经柱层析法提纯时，所用的流动相为氯仿、乙酸乙酯、甲酸或苯甲酸的混合溶液，其比例介于590～620∶10～30∶0.5～1之间。

7.根据权利要求1所述的十八碳共轭多烯脂肪酸的合成方法，其特征在于：经该方法得到的十八碳共轭多烯脂肪酸，包括十八碳共轭二烯脂肪酸、十八碳共轭三烯脂肪酸和十八碳共轭四烯脂肪酸。

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