CN102021193B - 一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，该方法以葡萄球菌核酸酶为载体蛋白，将目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之间有一个半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化；然后多肽通过化学裂解技术从葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下来。本发明采用生物学方法制备多肽，产量高，成本低，环境污染少，且便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法。
背景技术
多肽是化学学科研究的一项重要内容，在生化，医药，免疫和基因科学等学科和领域都起了巨大的推动作用。长期以来，几乎所有多肽合成的研究都是以氨基酸为原料通过化学合成方法来进行的。这种方法步骤麻烦、成本较高，使得多肽类材料的应用受到限制。
随着科技的发展，生产肽的方法也在不断发展。五六十年代，主要是从动物脏器获取肽。后来又发展到液相合成法。1963年，R.B.Merrifield创立了将多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次偶联氨基酸，延长肽链、合成多肽的固相合成法。多肽固相合成技术的发明促进了肽合成的自动化，但只能用于小规模的实验室合成，并且对有些序列的多肽，如多个疏水氨基酸，连续的大侧链基团的胺基酸，合成非常困难。
随着蛋白表达技术的成熟，多肽也应用到这种技术。然而，直接在大肠杆菌中表达多肽都不能成功，主要是由于多肽是线性不折叠的小分子，在大肠杆菌中容易被降解。由于多肽分子量较小，难以通过常规的电泳技术来检测。为了解决这个问题，人们尝试着将多肽融合到一个载体蛋白的C端。这种融合多肽可以在大肠杆菌中表达、纯化，利用蛋白酶将多肽切下。但这种方法主要存在以下缺点：融合蛋白比较大，导致多肽的表达量比较低；切割时，会发生非特异性切割，由此而产生一些杂肽，增加纯化的难度；所使用的酶，价格比较贵；无法对沉淀的包涵体蛋白进行切割。由于以上缺点也造成这种技术不能得到广泛利用。为克服这些缺点，我们发明了一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的新方法。本方法产量高、成本低、易于纯化，重组多肽即使以包涵体的形式表达，也可以进行切割。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，以克服现有技术的不足，按本发明方法制备的多肽产量高，成本低，环境污染少，且易实现大规模生产。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，该方法以葡萄球菌核酸酶为载体蛋白，将目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之间有一个半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化；然后多肽通过化学裂解技术从葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下来；该方法具体包括如下步骤：
(1)基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)的碱基序列，经过双酶切该碱基序列和表达载体序列，纯化双酶切的两个序列，将碱基序列与表达载体序列进行连接，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确；
(2)转化表达载体到表达宿主细胞，并进行诱导表达重组多肽；
(3)收集、破碎细菌，纯化表达的重组多肽；
(4)以乙醇为溶剂，沉淀并收集纯化的重组多肽；
(5)将沉淀的重组多肽重溶于盐酸胍缓冲液，加入DTT和NTCB；
(6)溶液pH调至9.0-9.5进行切割；
(7)将切割混合物过柱进行纯化。
本方法的关键创新是如下3点：
(1)引入葡萄球菌核酸酶基因作为重组蛋白-多肽的载体。葡萄球菌核酸酶的表达产率非常高，纯化非常简单。只需过一次SP-Sepharose(SP琼脂糖凝胶)层析柱，就可达到95％以上的纯度。
(2)利用半胱氨酸的氰基化反应，重组蛋白-多肽的切割采用特异性化学裂解法，这种切割法具有较高的特异性.它只能特异的切割x-Cys之间的化学键，x可以为任何残基，切割产物为葡萄球菌核酸酶、少量未被切割的葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白及目的多肽。多肽可以通过过一次SP琼脂糖凝胶层析柱得到纯化。
(3)这种切割要在尿素或盐酸胍条件下进行，因此即使载体蛋白-多肽的融合蛋白以包涵体形式表达，切割也不受影响。
本发明的以上特点解决了其它方法所存在的主要问题，这是一种高产量、低成本的生产多肽方法。
在本发明中，重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括：电转化法，氯化钙法，基因枪法等。将外源重组载体导入宿主细胞的过程称为“转化”。通过培养宿主细胞，诱导所需蛋白的表达，并通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需的蛋白质。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。本发明优选的表达宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的有益效果在于：采用生物学方法结合蛋白的生物表达和化学裂解技术制备多肽，产量高，成本低，易于纯化，环境污染少。重组多肽即使以包涵体的形式表达，也可以进行切割。本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
附图说明
图1是本发明实施例2中重组多肽的诱导表达示意图，其中，1表示重组多肽表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a诱导前；2表示重组多肽表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a，0.4mM IPTG诱导4小时后。
图2是本发明实施例5中重组多肽经NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)切割为目的多肽的示意图，其中，1表示表达的重组多肽切割前；2表示表达的重组多肽切割后。
图3是本发明实施例6中切割混合物过C18柱后的示意图，其中第一个峰即为举例的多肽峰。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建表达载体
基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)的碱基序列(如SEQ ID NO：1所示的序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)；基因合成葡萄球菌核酸酶-多肽的碱基序列的方法按常规的基因合成方法，如根据葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)的碱基序列合成一组引物，分别进行PCR扩增，最后拼接为整段目的基因。之后，采用限制性内切酶位点Nde I和Xho I进行双酶切合成的碱基序列(SEQ ID NO：1)、pET21a表达载体序列(购自Novagen)，通过DNA快速连接试剂盒(GK6001)(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接两个酶切的序列，这就是构建的表达载体。将构建好的表达载体转化到DH5a菌株(购自上海捷瑞生物工程有限公司)，涂平板，37℃培养过夜。第二天挑取单菌落培养过夜，通过质粒小量制备试剂盒(离心柱型，GK2001)(购自上海捷瑞生物工程有限公司)抽提质粒，进行限制性内切酶位点Nde I和Xho I双酶切鉴定。并送双酶切检测正确的菌落到测序公司(上海美季生物技术有限公司)进行测序鉴定。
实施例2转化表达载体到表达宿主，并进行诱导表达重组多肽
通过热激法(参考分子克隆)转化表达载体到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)(购自上海捷瑞生物工程有限公司)，获得重组基因工程表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a。在37℃培养表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a至OD700nm约为1.0，加入终浓度为0.4mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，37℃诱导表达4小时，诱导表达结果见图1。
实施例3收集、破碎细菌，纯化表达的重组多肽
通过离心收集诱导表达的菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a，超声波破碎细菌，13000rpm离心20分钟。收集沉淀重悬于50mMtirs，8MUrea，pH8.0缓冲液，室温搅拌1小时，13000rpm离心20分钟。上清液过SP-sepharose(SP-琼脂糖凝胶)柱。具体步骤如下：
1，3-5倍体积50mM t irs，8M Urea，pH8.0缓冲液平衡SP-sepharose；
2，上清液上柱；
3，3-5倍体积50mM tirs，8M Urea，pH8.0缓冲液洗涤SP-sepharose；
4，0.05mM NaCl，50mM tirs，8M Urea，pH8.0缓冲液洗涤SP-sepharose；
5，0.08mM NaCl，50mM tirs，8M Urea，pH8.0缓冲液洗脱Staphlococcalnuclease-Peptid(葡萄球菌核酸酶-多肽)重组多肽。
实施例4收集纯化的重组多肽
用乙醇来沉淀纯化的重组多肽，乙醇与重组多肽溶液混合的体积比为3∶1，4℃放置过夜，13000rpm离心20分钟，收集沉淀。
实施例5切割重组多肽
将乙醇沉淀的重组多肽重悬于6M盐酸胍，50mM tris(三羟甲基氨基甲烷)，pH 8.0的溶液中，室温，搅拌重溶1小时，13000rpm离心20分钟。取上清，计算重组多肽溶液中巯基浓度，加入3倍于巯基浓度的DTT量，37℃搅拌放置1小时。再加入10倍于此时重组多肽溶液中巯基浓度(包括半胱氨酸和DTT)的NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸，购自sigma)量，37℃搅拌20分钟。将上述混合物pH值调至9.0-9.5，37℃搅拌切割16-20小时，切割结果见图2，重组多肽经NTCB切割为目的多肽。
实施例6纯化切割的重组多肽
将实施例5的切割混合物过C18柱(购自北京创新通恒科技有限公司)进行纯化，具体步骤如下：
1，5％乙腈溶液平衡C18柱(250*3.2mm)30分钟；
2，将实施例5的切割混合物过0.45um膜过滤，再上C18柱；
3，去离子水洗柱30分钟；
4，再用不同浓度的乙腈水溶液，洗脱重组多肽。
实验结果见图3，其中第一个峰即为举例的多肽峰。
序列表
<110>上海立凯德生物技术有限公司
<120>一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法
<130>NP-09-13412
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>480
<212>DNA
<213>葡萄球菌核酸酶-多肽(Staphlococcal nuclease-Peptide)
<400>1
catatggcaa cttcaacttt aattaaagcg attgatggtg atacggttaa attaatgtac 60
aaaggtcaac caatgacatt cagactatta ttggttgata cacctgaaac aaagcatcct 120
aaaaaaggtg tagagaaata tggtcctgaa gcaagtgcat ttacgaaaaa aatggtagaa 180
aatgcaaaga aaattgaagt cgagtttgac aaaggtcaaa gaactgataa atatggacgt 240
ggcttagcgt atatttatgc tgatggaaaa atggtaaacg aagctttagt tcgtcaaggc 300
ttggctaaag ttgcttatgt ttacaaacct aacaatacac atgaacaaca tttaagaaaa 360
agtgaagcac aagcgaaaaa agagaaatta aatatttggt gcaaaggcca tcagcgtgtg 420
gtgaccctgg cgcagcatat tagcgaagtg attacccagg attatacccg ttgactcgag 480
Claims (7)
1.一种结合蛋白的生物表达和化学裂解技术生产多肽的方法，其特征在于，该方法以葡萄球菌核酸酶为载体蛋白，将目的多肽融合在葡萄球菌核酸酶的C端，在葡萄球菌核酸酶和目的多肽之间有一个半胱氨酸，葡萄球菌核酸酶-多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达，并纯化；然后多肽通过化学裂解技术从葡萄球菌核酸酶-多肽融合蛋白上切割下来；该方法具体包括如下步骤：
(1)基因合成如SEQ ID NO：1所示的葡萄球菌核酸酶-多肽的碱基序列，经过双酶切该碱基序列和表达载体序列，纯化双酶切的两个序列，将碱基序列与表达载体序列进行连接，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确；
(2)转化表达载体到表达宿主细胞，并进行诱导表达重组多肽；
(3)收集、破碎细菌，纯化表达的重组多肽；
(4)以乙醇为溶剂，沉淀并收集纯化的重组多肽；
(5)将沉淀的重组多肽重溶于盐酸胍缓冲液，加入DTT和NTCB；
(6)溶液pH调至9.0-9.5进行切割；
(7)将切割混合物过柱进行纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：以葡萄球菌核酸酶为融合多肽片段的载体，采用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切合成的碱基序列、pET21a表达载体序列，通过连接试剂盒连接两个酶切的序列，这就是构建的表达载体；通过酶切、测序鉴定构建的表达载体是否准确。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)通过热激法转化表达载体到表达宿主菌BL21(DE3)；37℃培养表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a至OD700nm为1.0，加入终浓度为0.4mM IPTG，37℃诱导表达4小时；所述表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a采用如下方法获得：基因合成如SEQ ID NO：1所示的葡萄球菌核酸酶-多肽Staphlococcal nuclease-Peptide的碱基序列，采用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切合成的碱基序列SEQ ID NO：1、pET21a表达载体序列，通过连接试剂盒连接两个酶切的序列，构建表达载体SNase-peptide-pET21a，将构建好的表达载体SNase-peptide-pET21a转化到表达宿主菌BL21(DE3)，获得重组基因工程表达菌株BL21(DE3)/SNase-peptide-pET21a。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)通过超声波破碎细菌，过SP琼脂糖凝胶纯化表达的葡萄球菌核酸酶重组多肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中用乙醇来沉淀纯化的重组多肽，乙醇与重组多肽溶液混合的体积比为3：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中将乙醇沉淀的重组多肽重悬于6M盐酸胍，50mM tris，pH 8.0的溶液中，室温，搅拌重溶1小时，13000rpm离心20分钟；取上清，计算重组多肽溶液中巯基浓度，加入3倍于巯基浓度的DTT量，37℃搅拌放置1小时；再加入10倍于此时重组多肽溶液中巯基浓度的NTCB量，37℃搅拌20分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中将溶液pH值调至9.0-9.5，37℃搅拌切割16-20小时。
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| WO2004015111A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-19 | National Research Council Of Canada | Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides |
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