CN102016582A - 鉴别、分离和利用来自成人胰腺的内分泌祖细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

在成人胰腺细胞表面存在细胞表面标记CD 133或存在膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式这一点可用来鉴别胰腺内分泌祖细胞，并且可用于分离和浓缩方法中。分离的胰腺内分泌祖细胞可被用于胰岛素依赖型糖尿病和胰腺切除术患者的细胞疗法。

Description

鉴别、分离和利用来自成人胰腺的内分泌祖细胞的方法
背景
人类膜突结合蛋白(prominin)1(PROM1)基因编码带糖基化表位的基因产物，所述糖基化表位被称为CD133。PROM1基因产物是一个五跨膜(pentaspan transmembrane)(5-TM)糖蛋白，属于新的5-TM蛋白质分子家族。该家族包括来自多个不同的物种、包括人类、小鼠、大鼠、蝇和蠕虫的成员。5-TM结构包括细胞外N-末端、两个短细胞内环、两个大细胞外环和细胞内C-末端。PROM1最初被证明表达在原始造血干细胞和祖细胞以及成视网膜细胞瘤上，现已证明在成血管细胞和神经干细胞以及发育上皮的顶端表面突起上也有PROM1表达。人骨髓、脐带血和外周血的CD133阳性组分已被证明能够在异种移植模型中有效地移植，并已被证明含有大多数粒细胞/巨噬细胞前体、NOD/SCID种群恢复细胞和CD34+树突状细胞前体。表型上，血液和骨髓中的CD133阳性细胞是CD34亮与CD34暗、CD71亮的CD133表达阴性细胞。至今尚未发现CD133分子的天然配体，其在造血组织中的功能也未知。
发明概述
在一个实施方案中，提供了鉴别细胞样本或组织样本中人类胰腺内分泌祖细胞的方法，其包括：将细胞样本或组织样本暴露于能标记表达膜突结合蛋白1基因产物糖基化形式的细胞的至少一种可检测试剂，从而鉴别出胰腺内分泌祖细胞。在另一实施方案中，提供了鉴别细胞样本或组织样本中人类胰腺内分泌祖细胞的方法，其包括：将细胞样本或组织样本暴露于至少一种可检测试剂，后者标记表达膜突结合蛋白1基因产物糖基化表位(被称为CD133)的细胞，从而鉴别出胰腺内分泌祖细胞。在另一实施方案中，所述至少一种检测标记是：与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合且带检测标记的第一结合配偶体(binding partner)；或与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合的未标记第一结合配偶体和与未标记第一结合配偶体结合且带检测标记的第二结合配偶体的组合。所述结合配偶体可以是(作为非限制性实例)抗体或凝集素(lectin)。在另一实施方案中，所述至少一种可检测试剂是：与膜突结合蛋白-1基因糖基化表位CD133/1或CD133/2结合且带检测标记的第一抗体；或与膜突结合蛋白-1基因糖基化表位CD133/1或CD133/2结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合且带检测标记的第二抗体的组合。在另一实施方案中，第一抗体结合膜突结合蛋白-1基因产物的至少一种其它糖基化表位。在另一实施方案中，所述检测标记是荧光团。在另一实施方案中，所述带检测标记的第一抗体是藻红蛋白缀合抗CD133/1抗体或藻红蛋白缀合抗CD133/2抗体。在另一实施方案中，还检测至少一种其它标记。在另一实施方案中，所述细胞样本是胰岛制备物。在另一实施方案中，所述细胞样本是人类胰腺组织。
在又一实施方案中，提供了从细胞群中分离或富集人类胰腺内分泌皮祖细胞的方法，其包括下列步骤：鉴别其中表达糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物的细胞，然后将这种细胞与所述细胞群分开，从而分离胰腺内分泌祖细胞或富集其群体。在又一实施方案中，提供了从细胞群中分离或富集人类胰腺内分泌皮祖细胞的方法，其包括下列步骤：鉴别其中表达CD133的细胞，然后将CD133表达细胞与所述细胞群分开，从而分离胰腺内分泌祖细胞或富集其群体。上面描述了鉴别表达糖基化膜突结合蛋白1基因产物的细胞或CD133表达细胞的非限定性实施方案。在一个实施方案中，所述分离通过荧光激活细胞分选、利用抗体(非限制性范例)，包括如上所述的带检测标记的抗体来进行。在另一实施方案中，所述鉴别和分离通过利用结合了CD133结合部分的基质，从而在基质上结合混合群体中的CD133表达细胞来进行。所述CD133结合部分包括如上所述的抗体、凝集素或任一其它CD133结合配偶体。在一个这种实施方案中，磁珠结合表达CD133的细胞，分离结合了CD133表达细胞的磁珠，然后释放其上结合的CD133表达细胞，从而分离出CD133表达细胞。在另一实施方案中，还使用至少一种额外标记来进行分离或富集。在一个实施方案中，所述细胞群从胰岛制备物获得，所述制备物包括胰岛和外分泌组织的混合物。在另一实施方案中，所述细胞群从人类胰腺组织获得。在另一实施方案中，所分离或富集的人类胰腺内分泌祖细胞然后在体外被进一步扩增或培养。
在另一实施方案中，如本文所述从胰岛中分离出的表达糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物的细胞用于细胞疗法(cell basedtherapy)。在另一实施方案中，将如本文所述从胰岛中分离出的CD133表达细胞用于细胞疗法。在另一实施方案中，将CD133表达细胞用于离体(ex vivo)疗法。在另一实施方案中，将CD133表达细胞用于制备移植用组织。在另一实施方案中，所述分离细胞在上述示例性而非限制性的体外或离体应用之前经过体外培养或扩增。
在进一步的实施方案中，提供了对于需要胰腺内分泌细胞替代疗法患者的治疗方法，所述患者例如患胰岛素依赖型糖尿病患者或胰腺切除后的患者，所述方法包括：从细胞群中分离表达糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物的细胞，然后将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用于患者。在另一实施方案中，在施用前，细胞经过体外培养或扩增。在另一实施方案中，所述细胞群来自一个或多个个体的胰腺组织。在进一步实施方案中，所述细胞群得自在手术期间获得的得自同一患者的被切除的胰腺组织。
在另一实施方案中，提供了从细胞样本中分离或富集胰腺内分泌祖细胞的系统，该系统包括：用于检测其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的方法，和将表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞与细胞样本中其他细胞进行分离的方法。在进一步实施方案中，用于检测细胞的方法包括如上所述用于标记表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的可检测试剂。在另一实施方案中，提供了用于分离所述表达细胞的方法，例如，通过如上所述荧光激活细胞分选或磁珠分选。
在另一实施方案中，提供了分离的胰腺内分泌祖细胞，所述祖细胞通过包括以下程序制备：获得包含胰腺细胞的细胞群，鉴别其中表达糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物的细胞，然后将所述细胞从细胞群中分离出来；由此提供分离的胰腺内分泌祖细胞。在另一实施方案中，所述分离的胰腺内分泌祖细胞随后在体外培养或扩增。
附图简述
图1描述了在两个独立胰岛分离物的三个密度组分中，随着时间的推移CD133+细胞百分比和总数的变化。X轴表示培养天数。CD133+细胞的平均百分比(黑色阴影)和CD133+细胞的平均总数(无阴影)以第2天平均基线水平的百分比在Y轴显示。通过学生t检验确定显著性，***，P＜0.001，**，P＜0.01。每一组分对CD133+细胞总数变化的相对贡献在插图中指明。组分I(胰岛纯度高，深灰色)、组分II(中等灰色)和组分III(胰岛纯度低，浅灰色)。插图轴与大图的相同；图2A-E显示培养基组成和培养温度对CD133表达的影响。Y轴，侧向散射，培养基组成和培养天数，X轴，CD133密度和培养温度。在每一通道的门内显示CD133。A，在CMRL 1066培养基(CMRL)中第3天；B-C，CMRL培养基，分别在37℃和25℃；D-E，Miami培养基1A(MM1A)，分别在37℃和25℃；图3A-D描述随着培养时间和DAPT变化的CD133+细胞百分比变化。A.在MM1A和CMRL培养基中生长的两个独立胰岛制备物的结果，所述结果结合在一起并于Y轴以基线的百分比来表示，其中基线为第3天的平均CD133百分比，X轴显示培养天数(D3，D7)和DAPT浓度，0是仅DMSO载体。通过学生t检验确定显著性，**，P＜0.01，**，P＜0.05，*。B-C，Y轴表示标准化的mRNA水平，以基线的百分比表示，其中基线为第3天的平均水平。X轴标明随培养(D3，D7)和DAPT浓度变化的成人胰腺中的水平(P)。通过学生t检验确定显著性，***，P＜0.001，**，P＜0.01。Y轴表示培养4天的组织(D4)中和CD133富集群体(D4 CD133+)中的：B，PTF1(黑色阴影)和PDX1(灰色阴影)；C，NGN3；D，标准化mRNA水平，PTF1(黑色阴影)、PDX1(无阴影)、NGN3(灰色阴影)；图4显示随时间和N-[N-(3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰基)]-S-苯甘氨酸叔丁基酯(DAPT)变化的细胞角蛋白19(CK19)和淀粉酶(AMY)蛋白的表达。Y轴指示CK19+(黑色阴影)和AMY+(灰色阴影)的百分比。在MM1A和CMRL培养基中生长的两个独立胰岛制备物的结果结合在一起。X轴指示培养天数(D3，D7)和DAPT浓度，0是仅DMSO载体。通过学生t检验确定显著性，***，P＜0.001，*，P＜0.05，和图5显示随培养时间以及DAPT和7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素(JKL6)变化的CD133+细胞的百分比。Y轴指示CD133百分比。X轴指示培养天数(D3，D7)以及DAPT和JKL6浓度，0是仅DMSO载体。
实施方案详述
人膜突结合蛋白1(PROM1)基因产物是五跨膜(5-TM)糖蛋白分子家族的成员，在成人和胎儿组织有广泛表达。CD133是PROM1的糖基化表位；抗CD133抗体并不识别大多数的组织或分化的细胞类型中的PROM1。然而，抗CD133抗体却识别人胎神经、肾脏、肌肉、皮肤和造血干细胞中的PROM1，并且CD133是祖细胞群的标记。为寻找潜在的能够分化成胰腺内分泌组织的祖细胞，特别是能分化成胰岛素生产细胞的祖细胞，用于治疗胰岛素依赖型(1型，或青少年型)糖尿病和其他胰腺疾病(包括胰腺切除术诱发性糖尿病)，本发明人在成人胰腺和包含胰岛和外分泌组织的富集胰岛制备物中发现了CD133表达细胞。
在同种异体移植前，胰岛制备物往往要维持培养数小时至数天。在一个实施方案中，在每一制备物都有丰富的CD133+细胞，在培养48小时或少于48小时后，含量从约3％至超过30％，在培养4天后，含量超过50％。
因此，在一个实施方案中，在胰腺细胞混合群上CD133的表达可以作为从群体中鉴别、定量、定位、分离或富集这些细胞的手段，后者为胰岛素依赖型糖尿病或其他胰腺疾病的细胞疗法提供充足的材料。在另一实施方案中，在胰腺细胞混合群上膜突结合蛋白1基因产物糖基化形式的表达可以作为从群体中鉴别、定量、定位、分离或富集这些细胞的手段，后者为胰岛素依赖型糖尿病或其他胰腺疾病的细胞疗法提供充足的材料。在另一实施方案中，混合胰腺细胞群包含胰岛和外分泌组织。在另一实施方案中，所述细胞存在于胰腺外分泌组织中。
如上所提及，CD133包含膜突结合蛋白1基因产物糖基化形式的表位，本文所述方法包括了所述膜突结合蛋白1基因产物糖基化形式和所述表位的所有类型和变异体以作为祖细胞标记，所述类型和变体如等位基因变异体、剪接变异体、来自其它物种的相应基因或蛋白、差异糖基化形式、突变或改变形式，例如，来自一个物种的变异氨基酸残基在另一物种的多肽中被取代，以对应于类似基因或蛋白，就象是来自另一个物种。剪接变异体的非限定性例子在Fargeas等，J Cell Sci.2004 1 17：4301-11中有描述。祖细胞特征性的膜突结合蛋白1基因产物的替代糖基化模式也包括在本文内，其中，提供了八个N-糖基化位点的变异体，如在Fargeas等，FutureLipidology 2006，1：213-225中的讨论。变异体是指包括保留亲代蛋白相同基本特征的修饰。在一个实施方案中，与膜突结合蛋白1基因产物具有大于80％左右、优选至少90％、特别优选至少95％的同源性的蛋白质被认为是变异体。变异体可以包括在蛋白质序列中缺失、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸群。
因此，在一个实施方案中，在人胰腺细胞群体中细胞上表达的CD133的可检测性，作为群体中胰腺内分泌祖细胞存在和/或定位的标记。在另一实施方案中，在胰腺内分泌祖细胞上CD133的存在提供了分离或富集这种细胞的手段，以供在其上进行研究，包括提供细胞疗法。在一个实施方案中，细胞疗法是治疗胰岛素依赖型糖尿病。在另一实施方案中，细胞疗法是治疗由于切除了胰腺(例如治疗胰腺炎)而成为胰岛素依赖的患者。检测方法可以是定性或定量的，并提供这些细胞在特定细胞群或组织中的具体定位，或这类CD133表达细胞的相对或绝对数量。
鉴定CD133表达细胞的方法可以基于任何数目的本领域已知的方法。在各种用于检测表达特定标记之细胞的方法中，有些方法中的细胞在检测后仍保持活力，则所述方法通常用于进一步的体外研究或移植或植入到患者体内，而其它方法使经鉴别过的细胞不大适于以其活状态的进一步应用，例如，对病理样本研究或在基于细胞的研究或体内研究终止时的研究。本文的方法并非那么限定性的，保持活细胞活力的应用以及保存细胞的应用全都包括在本文中。
鉴别CD133表达细胞的方法可以基于(作为非限制性实例)对细胞表面CD133表位的定位或定量，或对胞浆或其中亚细胞区室内CD133表位的定位或定量。下面提供了上述定位或检测的示例性方法，是非限制性的。
在一个实施方案中，检测方法基于检测结合配偶体与表达糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物之细胞的结合。结合配偶体可以带检测标记，或可以是未标记的，但可进一步通过与其结合且具检测标记的另一结合配偶体而被检测。结合配偶体如抗体、包括带标记的第一抗体和带标记的凝集素的这种应用在本领域是已知的。此外，未标记的第一抗体和带标记的第二抗体的组合系统在本领域也是众所周知的。这种双系统也可以包括两种抗体、凝集素、抗生物素蛋白-生物素系统、抗标记抗体，和包括放大系统，以增强检测信号。如下面将叙述的，这类检测系统不仅在鉴别基因产物表达方面，而且在利用与基质如树脂或珠的选择性结合来分离表达这种基因产物的细胞方面，都是有用的。关于检测糖基化形式膜突结合蛋白1基因产物表达的方法，本发明并非如此限制性的，其包括所有该类方法。
基于抗体的检测法属于那些常用但不总是使用的方法，其用来识别细胞的蛋白表达或表位表达，而不考虑在检测期间或之后细胞是否需要活力。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可以遵循文献中的现成指南来制备这类特异性结合CD133或细胞表面膜突结合蛋白1基因产物其它表位的抗体，并可用于在活细胞上检测细胞表面CD133，或在细胞或组织切片样本中检测表面CD133。
在一个实施方案中，术语“抗体”包括全抗体(例如，二价IgG，五价IgM)，或在其它实施方案中包括包含抗原结合位点的抗体片段。在一个实施方案中，所述片段包括Fab、F(ab′)2、Fv和单链Fv(scFv)片段。在一个实施方案中，所述片段可包括或不包括抗体恒定区。在另一实施方案中，F(ab)′片段缺乏补体结合所需的恒定区。scFv由通过柔性接头连接的抗体轻链可变区(VL)与重链可变区(VH)组成。scFv能够结合抗原，并在细菌中快速产生。本发明包括在细菌和哺乳动物细胞培养物中产生的抗体和抗体片段。从噬菌体文库获得的抗体可以是全抗体或抗体片段。在一个实施方案中，在该文库中存在的功能区是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们一起构成Fv或scFv，在另一实施方案中，加入重链恒定功能区(CH1)和轻链恒定区(VL)。该四个区(即VH-CH1和VL-CL)构成了Fab。在一个实施方案中，一旦所需VH-VL组合已被鉴定，就可通过取代缺失的恒定区从该文库中获得全抗体。
此处所述的抗体在一个实施方案中可以是单克隆抗体(Mab)，或者在另一实施方案中可以是多克隆抗体。可用于本文所述方法中的抗体可以来自任何来源，而且可以是嵌合的。在一个实施方案中，抗体的来源可以是鸡、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、马，或在其它实施方案中来源于人。第二抗体通常是结合另一抗体的抗体，通常用与第一抗体的来源物种不同的物种来制备，因此，例如第二抗体可以是大鼠抗小鼠抗体，或山羊抗大鼠抗体，或反之亦然，如小鼠抗大鼠抗体。在某些情况下，第二抗体可以针对缀合于第一抗体上的成分，如荧光部分。在其它实施方案中，可以使用其它结合配偶体，如抗生物素蛋白和生物素。在一些实施方案中，在检测中使用可检测的第一抗体。在其它实施方案中，特别是需要放大指示CD133存在的可检测信号时，可以使用第二抗体或甚至进一步的放大技术，以增强对第一抗体结合程度的可检测性。这类放大系统在本领域是众所周知的。
此处所述检测试剂可以是被选定或设计用于特异性结合CD133聚糖结构的凝集素或凝集素组合。这些凝集素可在溶液中、具检测标记或通过第二检测抗体检测或回收，或优选地附着在可用于回收细胞的固体基质如磁珠或其它表面。
对抗体与细胞结合的检测通常需要检测标记，该标记或者直接结合到CD133结合抗体(第一抗体)本身，或者检测标记可以存在于与第一抗体结合的第二抗体上。此处包括各种检测标记，其选择是非限制性的。诸如荧光部分、放射性元素及化合物和蛋白质或其它具酶活性的实体之类的标记已经在本领域中使用，而且是众所周知的，适用于不同的检测方法。在一个实施方案中，在有用的荧光标记中有藻红蛋白。在另一实施方案中，放射性标记包括125I。
如上所述，术语“检测标记”或“带检测标记的”在一个实施方案中是指可通过光谱法、光化学、生化、免疫组织化学、电磁、放射、或化学工具(如荧光、化学荧光或化学发光)或任何其它适当方法检测的组合物或部分。在另一实施方案中，作为非限制性范例，检测标记是荧光染料分子或荧光团，如荧光素、藻红蛋白、CY3、CY5、别藻蓝蛋白、Texas Red、peridenin chlorophyll、花菁、FAM、JOE、TAMRA、TET和VIC。
例如，Miltenyi Biotec(Auburn，California)销售用于鉴别和分离CD133表达细胞的基于抗体的试剂；抗体包括克隆AC133(小鼠IgG1)、293C3(小鼠IgG2b)和AC141(小鼠IgG1)。这些抗体分别识别CD133分子上两种不同的抗原表位CD133/1(克隆AC133)和CD133/2(克隆293C3和克隆AC141)。在供替换的实施方案中，抗体可以针对膜突结合蛋白1基因产物的其它糖基化抗原表位。
因此，在一个实施方案中，与CD133/1或CD133/2结合的已标记第一抗体，或与CD133/1或CD133/2结合的未标记第一抗体和结合未标记第一抗体的已标记第二抗体的组合，可被用于识别CD133表达细胞。在另一实施方案中，使用抗CD133/1的藻红蛋白缀合(conjugated)抗体和抗CD133/2的藻红蛋白缀合抗体。利用荧光标记，如藻红蛋白(PE)，可以用荧光显微镜鉴别CD133表达细胞。在其它实施方案中，生物素标记的第一抗体和与生物素缀合的检测试剂(如荧光或酶缀合的链霉抗生物素蛋白或其它抗生物素蛋白衍生物)可用于光镜下的荧光定位、免疫组织化学定位或检测。从下文可以看出，使用藻红蛋白的优势是：它既可被检测(荧光)，又可产生针对其的抗体，抗藻红蛋白抗体可用作亲和试剂来分离藻红蛋白结合的细胞，例如，采用上述的藻红蛋白缀合CD133抗体。抗藻红蛋白抗体与抗CD133的第一抗体可以来自同一物种或不同物种。
在又一实施方案中，可以采用免疫组织化学技术进行细胞样品或组织样品中CD133表达细胞的定位，其中例如用鉴别CD133表位的试剂对整个细胞或组织薄切片进行染色，该试剂是如上所述的抗体，或者被直接标记或者通过带标记的第二抗体，所述带标记的第二抗体例如通过酶促反应，在CD133位点产生可视产物。这类免疫组织化学定位方法在本领域是众所周知的，可以很容易地应用于CD133。
本文所述方法中胰腺细胞的来源包括胰岛制备物，即从人胰岛或其它物种胰腺分离出的细胞，或从人胰腺组织制备的细胞。本文包括成人以及胎儿来源的组织。包含胰岛和外分泌组织的胰岛细胞制备物可从若干学术的和/或临床的胰岛分离纯化服务机构的任一处获得。对于为例如治疗胰腺炎而经历胰腺切除的患者，患者自身的被切除的胰腺组织可以提供细胞来源，用本文实施方案中的方法从中分离胰腺内分泌祖细胞，然后施用于同一患者或需治疗例如糖尿病的另一个患者。同样，可对一位胰腺切除患者施用来自单一不相关个体或一群个体的自体胰腺内分泌祖细胞。
在一个实施方案中，其中的胰腺内分泌祖细胞是来自成人胰腺中表达CD133的细胞。在另一实施方案中，其中的内分泌祖细胞是来自成人胰腺中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞。在另一实施方案中，其中的内分泌祖细胞是来自成人胰腺外分泌组织中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞。在另一实施方案中，其中的内分泌祖细胞是成人胰腺外分泌组织中发现的表达CD133的细胞。
上述鉴别CD133表达细胞的示例性方法，特别是不会影响细胞活力的方法，容易适用于从混合细胞群体中分离表达CD133的方法。因此，在另一实施方案中，利用各种检测细胞表面CD133表达的方法，从混合细胞群体中分离或富集CD133表达细胞。作为非限定性实例，可使用荧光激活细胞分选技术。上述可用于在胰腺组织中鉴别CD133表达细胞的各种试剂，也可用作用于从混合细胞群体中分离所述细胞、例如通过结合于固体基体或使用磁珠技术分离所述细胞的试剂。CD133抗体仅仅是利用CD133结合配偶体分离或分开CD133表达细胞的一个实例。
因此，在一个实施方案中，荧光激活细胞分选(FACS)技术可被用于分离CD133表达细胞，所述分离或者使用结合荧光部分的CD133第一抗体，或者使用未标记或非荧光标记的CD133第一抗体和与第一抗体结合的结合荧光部分或荧光试剂的第二抗体，或使用识别CD133聚糖的凝集素。也可使用其它结合对如生物素和抗生物素蛋白来对所需细胞进行同样的标记。FACS方法学在本领域是众所周知的。
在另一实施方案中，利用缀合了CD133抗体的基质或表面，使得CD133表达细胞结合到该基质或表面，而非附着细胞被洗掉，再从基质或表面洗脱CD133表达细胞，可以直接从混合群体中分离出CD133表达细胞。在一个实施方案中，可将基质如珠状琼脂糖或葡聚糖与CD133抗体缀合(conjugate)。通过使混合群体中的CD133表达细胞与基质混合或通过有基质的层析柱，使细胞暴露于基质，CD133表达细胞附着在基质上，然后冲洗基质，用高盐或低pH洗脱缓冲液，或者用干扰抗体-表位相互作用的方法，或者能够切断珠与所需细胞类型间连接的方法，将所述细胞从中洗脱出来。这些方法和所用试剂在本领域是众所周知的。在另一实施方案中，使用缀合了CD133抗体的磁珠来结合CD133表达细胞，然后基于其磁特性将这些磁珠分开，冲洗，并将CD133表达细胞从中洗脱下来。这些磁珠可以从Miltenyi Biote购买，其使用方法在生产商指南中有描述。在又一实施方案中，附着了凝集素的琼脂糖或葡聚糖珠被用于结合CD133表达细胞。通过使混合群体中的CD133表达细胞与基质混合或通过有基质的层析柱而使细胞暴露于基质，CD133表达细胞附着在基质上，然后冲洗基质，用干扰CD133-凝集素相互作用的非缀合聚糖，或者能够切断珠子与所需细胞类型间连接的方法，将所述细胞从中洗脱出来。这些方法和其中试剂在本领域是众所周知的。
在其它实施方案中，可以利用缀合到基质或磁珠的第二抗体将基质或磁珠分开，所述第二抗体针对结合CD133的第一抗体。例如，在一个实施方案中，在应用用藻红蛋白标记的能结合CD133/1或CD133/2的第一抗体后，可以用缀合了能结合藻红蛋白的抗体的磁珠或基质来结合CD133表达细胞，然后，洗涤所述磁珠，并释放CD133表达细胞。例如，Miltenyi Biotec销售缀合了抗藻红蛋白抗体的磁珠(抗-PE微珠)。或者，可使用抗第一抗体分子的第二抗体。这些方法仅仅说明亲和程序，其变化在本领域是众所周知的，并全部包括在本文中。
在从细胞群体中分离或富集CD133表达细胞的方法的实施方案中，所述细胞群体可以从胰岛制备物或人胰腺组织中获得。如上所述，胰岛细胞制备物可从若干学术的和/或临床的胰岛分离纯化服务机构的任一处获得。此中包括成人组织以及胎儿组织。
在本文叙述的任一实施方案中，所分离或富集的CD133表达细胞，在用于本文所述的任一各种用途之前，可以在体外培养或扩增；其中作为非限定性实例，以便扩大或增加细胞群体，或增加细胞群体上的CD133表达。例如，依据本文的教导富集或分离的细胞，可以在下列培养基中培养：Miami Medium 1A，或HuES培养基[KO-DMEM，1×青霉素/链霉素，1×glutamax，1×NEAA，10％KO血清替代物，0.1×2-巯基乙醇，1×N2添加物(Invitrogen)，10％Plasmanate(Bayer)，成纤维细胞生长因子2(20ng/ml)，白血病抑制因子(10ng/ml)，表皮生长因子(20ng/ml)]，或PS培养基[DMEM/F12，1×青霉素/链霉素，1×glutamax，1×N2添加物(Invitrogen)，成纤维细胞生长因子2(20ng/ml)，白血病抑制因子(10ng/ml)，表皮生长因子(20ng/ml)]，所述培养基已经通过与人类胚状体来源的细胞系SDEC过夜培养而对其进行了调节(Shamblott等，Proc Natl Acad Sci USA.2001；98：113-8)。在另一实施方案中，这些细胞的扩增通过在培养液中加入血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)而达到。因此，在一个实施方案中，通过如本文所述分离或富集CD133表达细胞，然后在培养中扩增所富集或分离的细胞，提供胰腺内分泌祖细胞扩增群体。上述培养基和条件的例子仅为范例，是非限制性的。
在本发明的又一实施方案中，提供了治疗胰岛素依赖性糖尿病患者的方法，其中，依据上述实施方案(作为非限制性实例)从细胞群体中分离CD133表达细胞，然后将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用至患者。在一个实施方案中，在使用前，先培养或扩增所述细胞，例如通过上述方法之一培养或扩增。1型糖尿病患者，也被称为青少年糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)患者，由于自身免疫或其它原因，胰岛中的胰岛素产生细胞损耗，不再产生足量水平胰岛素。通过根据饮食和血糖水平的其他波动定时施用外源性胰岛素来恢复这类患者的血糖控制，防止急性高血糖危象和避免大血管和微血管并发症的发生，但胰腺移植可恢复正常血糖量，且不需要注射胰岛素和经常监测血糖水平。不幸的是，没有足够的胰腺可供移植。本文实施方案为胰岛素依赖型糖尿病的细胞疗法提供了充足材料。
例如，依据本文实施方案分离或富集的CD133表达细胞可被直接注射入患者的肝管或相关血管系统。在另一实施方案中，注射前，细胞可经过体外培养和扩增。同样，通过直接植入或注射入血管系统，可将细胞运送到胰腺。细胞移植到肝脏或胰腺实质中，分别执行正常情况下与胰腺细胞相关的功能。此外，在植入或移植前，按本文所述获得的细胞可经过基因操作以减少或消除负责移植排斥的细胞表面分子，以产生通用的供体细胞。例如，可以通过定向缺失或破坏β-微球蛋白基因，使小鼠I类组织相容性(MHC)的基因失去功能(参见例如Zijlstra，Nature 342：435-438，1989)。这使鼠胰岛同种异体移植物可以无限期存活(参见例如Markmann，Transplantation 54：1085-1089，1992)。使II类MHC基因缺失(参见例如Cosgrove，Cell 66：1051-1066，1991)可进一步改善移植成效。TAP1分子和Ii分子分别引导MHC I类分子和II类分子的胞内转运(参见例如Toume，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1464-1469，1996)；移除这两种转运蛋白分子或其它MHC胞内转运系统也可提供减少或消除移植排斥的方法。这种技术可应用于人类细胞和相应的HLA抗原。在另一实施方案中，从其HLA与受治疗者匹配的胰腺获得细胞群体。
在又一实施方案中，提供治疗慢性胰腺炎患者的方法，其中使用按照(作为非限制性实例)上述实施方案从细胞群体分离的CD133表达细胞，然后将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用给患者。在一个实施方案中，细胞在使用前经过体外培养或扩增。慢性胰腺炎患者需要去除其胰腺以减轻疼痛。胰腺切除导致胰岛素依赖型糖尿病，除非将胰岛从切除组织中纯化出来并移植回患者体内。由于胰腺炎，被切除的胰腺通常不含足够的胰岛来使患者在移植后恢复正常血糖量，导致这类患者的血糖控制恢复需要通过根据饮食和血糖水平的其他波动定时施用外源性胰岛素，以防止急性高血糖危象和避免大血管和微血管并发症的发生。例如，依据本文实施方案分离或富集的CD133表达细胞可被直接注射入患者的肝管或相关血管系统。在另一实施方案中，注射前，细胞可经过体外培养和扩增。细胞移植入肝脏或胰腺实质，分别执行正常情况下与胰腺细胞相关的功能。在慢性胰腺炎的情况下，CD133表达细胞可以是自体的，因此移植前不需要额外的修饰以与HLA匹配。在其它实施方案中，移植物是同种异体的。
在另一实施方案中，提供了从细胞样本中分离或富集胰腺内分泌祖细胞的系统，其包括：a.用于检测其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的方法，和b.用于将其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞与细胞样本中其它细胞分离的方法。
用于检测表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的方法，可以按上述任一方法来实施，如使用标记表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式之细胞的可检测试剂。这类试剂可以包括：与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合的带标记的第一抗体；或与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合的带标记的第二抗体的组合。一般来说，标记是荧光团。一种可检测试剂可以是：与CD133/1或CD133/2表位结合的带标记的第一抗体，或与CD133/1或CD133/2结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合的带标记的第二抗体的组合。
用于分离的方法可通过荧光激活细胞分选进行，或通过应用可结合CD133表达细胞的磁珠，分离结合了CD133表达细胞的磁珠，然后释放结合在上面的CD133表达细胞，从而分离出CD133表达细胞。上文描述了用于实施所述方法的示例性方法和试剂，是非限制性的。
在另一实施方案中，描述了分离的胰腺内分泌祖细胞，所述细胞通过下述程序制备：获得包含胰腺细胞的细胞群体，检测其中的CD133表达细胞，然后从该细胞群体中分离所述检测到的CD133表达细胞；从而提供分离的胰腺内分泌祖细胞。上文描述了所述方法的示例性实施方案。在一个实施方案中，检测包括将该细胞群体暴露于可标记CD133表达细胞的至少一种可检测试剂。在另一实施方案中，所述至少一种可检测试剂是：与CD133/1或CD133/2结合且带标记的第一抗体，或与CD133/1或CD133/2结合的未标记第一抗体和与未标记第一抗体结合且带标记的第二抗体的组合。在又一实施方案中，通过荧光激活细胞分选或使用能结合CD133表达细胞的磁珠来进行分离。在另一实施方案中，带标记的第一抗体是藻红蛋白标记的抗CD133/1抗体、或藻红蛋白标记的抗CD133/2抗体，和用抗藻红蛋白抗体包被的磁珠。在另一实施方案中，所述细胞群体从胰岛制备物或人类胰腺组织获得。在另一实施方案中，CD133表达细胞的分离基于凝集素结合。在任一实施方案中，分离的胰腺内分泌祖细胞可在体外培养以扩增群体。
从人胰腺组织制备胰岛的方法在本领域是已知的，例如，Ricordi C，Pancreatic Islet Cell Transplantation(胰岛细胞移植)，Austin R.G.Landes Co.，1992：99-112。这类技术可应用于人类供体材料以提供移植用细胞。已在通常分离的所有3个组分中鉴别出CD133阳性细胞。在Miami Media 1A中培养约一个星期后，CD133+细胞的百分比增加，到培养两个星期时逐渐减少。通常在胰岛移植指南的标准操作程序中描述了培养周期和培养基。因此，可以从临床级胰岛制备物中有效地分离出CD133免疫活性细胞。
实施例
下列实施例用于说明但不限制本发明。尽管它们是典型的可使用方法，但也可使用本领域已知的其它程序。
实施例1
研究设计和方法
胰岛培养。将重悬浮在添加了0.01g/L谷胱甘肽的MiamiMedia 1(Mediatech，Herndon，VA)或添加了10％胎牛血清的CMRL-1066(Invitrogen)培养基中的胰岛制备物组织，于37℃或25℃铺板于低粘附盘中。每2-3天更换一次培养基。通过用0.25mg/ml双硫腙染色评估胰岛纯度。通过每日添加在DMSO中制备的DAPT(N-[N-(3，5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯甘氨酸叔丁酯)或JKL6(7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素)来抑制γ-分泌酶。每日添加溴脱氧尿苷(BrdU)至10μM。
逆转录酶聚合酶链反应(RTPCR)。cDNA的合成通过在标准的逆转录反应中使用寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))引物来进行。分别利用
Figure G2007800490827D00181
基因表达分析方法Hs00172878_m1、Hs00603586_g1、Hs00426216_m1、Hs00360700_g1和Hs99999904_m1，确定HES 1、PTF1、PDX1、NGN3和CYCLOPHILLIN A的水平。以CYCLOPHILLINA的平均水平将感兴趣基因的平均水平(3-6次读数/样本)标准化。用双尾异方差学生t检验确定显著性。商业性制备了成人和胎儿胰腺RNA。
免疫化学。用含1-4％甲醛的Dulbecco磷酸缓冲液盐溶液(DPBS)固定正常成人胰腺(2个个体)和胰岛制备物组织的5微米冰冻切片5分钟，用含50mM甘氨酸的DPBS淬灭5分钟，然后用含5-10％血清、1％BSA的DPBS室温下封闭30分钟。对于细胞质和细胞核抗原，加入0.2％Triton-X100，除了NGN3/CD133、PDX1/CD133和NGN3/CA19.9共染色外，所述共染色在没有Triton-X100时进行。用封闭缓冲液稀释第一抗体：非缀合的和缀合藻红蛋白的小鼠抗CD133/1和CD133/2(Miltenyi Biotec，Aubern，CA，1∶10)、缀合异硫氰酸荧光素的小鼠抗人CD31(BD Biosciences，SanJose，CA，1∶10)、小鼠抗CK19(Chemicon，Temecula，CA，1∶300)、小鼠抗CA19.9(US Biological，Swampscott，MA，1∶300)、豚鼠抗猪胰岛素(Dako，Capinteria，CA，1∶500)、兔抗PDX1(Chemicon 1∶250)、山羊抗AMY(Santa Cruz，1∶300)、小鼠抗小鼠NGN3(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank，Iowa City，IA，非浓缩杂交瘤条件培养基，1∶10)。用试剂盒(BD Bioscience)进行BrdU检测。AMY和CK19表达的定量分析通过对每个处理组超过600个细胞核进行成像来进行。NGN3表达定量分析通过对每个处理组超过800个细胞核进行成像来进行。
电子显微镜。10％明胶中的甲醛固定组织在含2.3M蔗糖的20％聚乙烯吡咯烷酮中在4℃过夜低温保护。用含10％胎牛血清的DPBS封闭超薄切片30分钟，然后在如上稀释的缀合于磁珠(直径约50nm)的抗CA19.9和抗CD133/1中温育。使用12nm直径胶体金山羊抗小鼠IgMμ链(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，1∶20)温育1小时来检测CA19.9。直接检测CD133/1。对照是在2％甲基纤维素和0.3％乙酸双氧铀中4℃温育10分钟。
FACS、Cytospin和磁珠分离。用无钙/镁DPBS冲洗组织，并通过在0.05％胰蛋白酶/EDTA中37℃温育5分钟进行解离。中和胰蛋白酶，用在0.1％BSA、1mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.6％柠檬酸钠溶液中制备的120单位/ml DNA酶在室温下温育2分钟以清除DNA，然后以200×g离心5分钟收集单细胞。将细胞重悬浮于在无钙/镁DPBS中制备的脱气0.5％BSA、2mM EDTA中，并用Nucleocounter(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)计数。对于流式细胞仪分析，第一抗体是缀合了藻红蛋白的CD133/1和CD133/2(IgG2b，Miltenyi Biotec)。同种型阴性对照抗体是IgG1-PE和IgG2b-PE(BD Bioscience)。用缀合于磁珠(Miltenyi Biotec)的CD133/1纯化CD133表达细胞。用缀合了藻红蛋白的CD133/2染色来确定纯化效率。用Cytospin以8500rpm旋转4分钟，使未聚集细胞粘贴到载玻片。
培养时间进程和计数。对于每一时间点，从10ml培养物中取出1.5ml组织用于FACS和组织学分析。不改变体积，但加入培养基根据蒸发情况进行调整。通过三次重复从平行胰岛制备物取出和解离来确定细胞数量变化。CD133细胞数按照总细胞数×CD133+百分比来计算。
培养CD133富集细胞。将组织打散，利用免疫磁珠分离出CD133+细胞至超过90％的纯度。以200×g离心5分钟，将1.5×104 CD133+细胞铺板于包被50mcg/ml I型牛胶原的48孔板中，在DMEM/F12培养基中生长，该培养基添加了：1％胎牛血清、100U/ml青霉素、100mcg/ml链霉素、40ng/ml人重组白血病抑制因子、50ng/ml重组人表皮生长因子和50mcg/ml硫酸GeneticinTM。每3天更换一次培养基。根据超过400个细胞总数的4个随机视野计算铺板效率。通过对10个随机视野的分离集落中总共约300个4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞核进行计数，计算细胞增殖。
实施例2
CD133在成人胰腺和纯化胰岛制备物中表达
在成人胰腺中，主要由表达CK19的导管上皮细胞表达CD133。可鉴别共表达CA19.9的细胞，但这两种抗原有不同的表达模式。未检出CD133或CD31(血管内皮细胞标记物)和胰岛素的共表达，观察到极少量胰岛内CD133染色表达。在大部分切片中明显有其它斑点状(punctuate)免疫活性区，可能是由于腺泡细胞或胰腺间充质表达所致。
含有胰岛和共纯化外分泌和胆管组织混合物的人胰岛制备物，根据最初器官消化(此处指定为第0天，D0)后的培养时间以及用胰岛百分比表示的纯度，来进行分类。在用于维持同种异体移植用胰岛的标准条件下培养制备物。到第4天，胰岛制备物包含CD133+、CA19.9+和CD133+/CA19.9+细胞。在第7天，用电子显微镜分析该胰岛制备物(50％胰岛)，显示整个组织有零星低水平染色和导管腔内衬的上皮细胞强染色。在管腔内，CD133只在微绒毛上表达，而CA19.9在微绒毛和顶部(apical domain)的平面区域都有表达。CD133和CA19.9在表达这两种糖蛋白的细胞上有重叠的亚细胞定位。在第7天，约45％的细胞是CD133+(404/901细胞核)，约57％的细胞是CA19.9+(510/901细胞核)，约63％的CA19.9+细胞是CD133+(321/510细胞核)。
实施例3
在培养物中CD133+细胞的百分比和总数增加
在第2、7和14天，检测了两个独立胰岛分离物的三个Ficoll密度组分中CD133的表达。在第2天，第一胰岛制备物的Ficoll组分I(超过95％胰岛)、组分II(65％胰岛)和组分III(25％胰岛)的CD133表达细胞的百分比分别为2.9、13.2和12.6。第二胰岛制备物各组分分别有90％胰岛、60％胰岛和30％胰岛。到第7天时，与第2天相比，CD133+细胞的平均百分比和平均总数显著增加，分别为2.7倍(P＜0.001)和3.3倍(P＜0.01)(图1)。虽然CD133+细胞的总数在所有三个组分中都有增加，但组分I的百分比增加最多(约5倍)，这是由于其在第2天时的水平低(图1插图)。组分I的CD133+细胞总数一直低于其它组分。在第7天和第14天间，CD133总数显著下降(5.1倍，P＜0.01)。在这段时间内，CD133百分比没有显著下降。
实施例4
CD133+细胞百分比的增加不是由于CD133+细胞增殖
通过免疫组织化学检测的从第2天至第7天CD133表达的增加，与FACS的结果一致，同时也揭示了CD133亚细胞定位的不同。在第2天，CD133的表达主要限于腔表面，而在第7天有扩大的模式，其中包括在其它细胞膜表面和/或细胞质的表达。在第7天检测到极少量BrdU的掺入，在FR I、II和III的切片中，分别有1％(9/893)、1.7％(14/800)和2.8％(30/1049)的细胞核染色阳性。没有CD133+细胞被BrdU+标记。与此相反，在相同剂量的快速增殖人类细胞对照培养物中，几乎100％的细胞被BrdU标记；确保了不会因BrdU半衰期短而遗漏CD133+细胞的任何增殖(数据未显示)。与在完整胰腺中胰岛内CD133表达不足相比，在第7天，在培养物(开始时有超过95％胰岛)的胰岛素表达区域内观察到许多CD133的表达实例。
将胰岛制备物组织在37℃常规地培养于无血清MiamiMedia 1A(MM1A)。移植前，常用可供选择的条件使用添加血清的CMRL 1066(CMRL)和于25℃培养。在第3天(65％胰岛)，培养物有24.6％CD133+。在所有条件下，CD133表达细胞的组分增加至1.5-1.8倍(图2)。
实施例5
CD133+群体在ADM背景下增加且通过抑制Notch激活而得到增强
在MM1A和CMRL培养基中培养第3至7天间的两个独立胰岛制备物(70％和85％胰岛)中，研究了CD133、CK19、腺泡细胞标记淀粉酶(AMY)和Notch调控基因的表达。在第3天，在这两个制备物中分别有24.6％和6.4％的细胞是CD133+细胞。当将在两种培养基类型的两个制备物的数据结合在一起时，CD133+细胞的百分比在第7天增加到第3天值的144±14.1％(图3A)。在第3天，分别有35.5±7.3％和36.1±9.6％的细胞表达AMY和CK 19。到第7天，AMY+细胞显著下降到3.9±6.9％(9.1倍，P＜0.001)，而CK19表达细胞的百分比显著上升到61.6±9.3％(1.7倍，P＜0.001)(图4)。
为了确定在这些培养物的CD133+细胞累积中Notch信号是否有作用，我们用仅DMSO载体、2μM或20μMγ-分泌酶抑制剂DAPT(Dovey HF等，Functional gamma-secretase inhibitors reducebeta-amyloid peptide levels in brain.(功能性γ-分泌酶抑制剂减少大脑中β-淀粉样肽水平)J Neurochem 76：173-181，2001)处理组织。CD133+细胞的平均百分比，在2μM DAPT组(1.3倍，P＜0.05)和20μMDAPT组(1.4倍，P＜0.01)中显著高于仅载体组(图3A)。AMY表达从仅载体组的2.9±3.8％到20μM DAPT组的17.5±17.1％，有统计学显著性增加(6.0倍，P＜0.05)。在DAPT组中，CK19表达细胞的百分比没有显著性差异(图4)。
为了确认Notch信号有活性并且被DAPT特异性抑制，研究了Notch靶基因茸毛和分裂增强子1(Hairy and Enhancer of Split1，HES1)的mRNA表达。与仅载体组相比，HES1 mRNA水平显著性下降，在2μM DAPT组和20μM DAPT组分别下降至1/1.9(P＜0.001)和1/2.0(P＜0.01)。HES 1 mRNA表达在培养基类型间没有显著性差异。为了确定CD133+细胞百分比的增加是由于Notch活性被抑制、而不是γ-分泌酶抑制的其他非特异性影响所致，用在MM1A中培养的75％胰岛纯度的制备物进行了独立的重复实验。除DAPT外，还使用了JKL6，其是不抑制Notch途径的γ-分泌酶抑制剂(Petit A等，JLK isocoumarin inhibitors：selective gamma-secretaseinhibitors that do not interfere with notch pathway in vitro or in vivo.(JLK异香豆素抑制剂：在体外或体内不干扰notch途径的选择性γ-分泌酶抑制剂)J Neurosci Res 74：370-377，2003)。在仅MM1A组，在第3至第7天间，CD133+细胞百分比从23.1％增加到39.4％(图5)。随着DAPT浓度的增加，CD133+细胞百分比从载体组的40.8％增加到10μM DAPT组的最大值54.8％。在用JKL6处理的培养物中，没有观察到CD133+百分比的增加(图5)，但是，与仅载体对照组比较，标准化的HES1 mRNA水平值在0.1μM JKL6组有轻微增加(1.1倍)，在10μM JKL6组有轻微下降(1.1倍)。
在超过15个独立培养物中已经观察到随时间和对DAPT应答，CD133+细胞增加。但是，在两个案例中，培养物没有CD133+细胞的增加或应答DAPT。
实施例6
Notch信号抑制PTF1和NGN3 mRNA水平
胰腺特异性转录因子1a(PTF1)在鼠外分泌和内分泌胰腺的形成和空间组织结构中起着关键作用(Krapp A等，The bHLHprotein PTF1-p48 is essential for the formation of the exocrine and thecorrect spatial organization of the endocrine pancreas.(bHLH蛋白PTF1-p48对胰腺外分泌的形成和胰腺内分泌的正确空间组织结构是必不可少的)Genes Dev 12：3752-3763，1998)，并且标记产生所有外分泌细胞和大多数内分泌细胞的前体细胞(Kawaguchi Y等，The role of thetranscriptional regulator Pft1a in converting intestinal to pancreaticprogenitors.(转录调节子Pft1a在将肠祖细胞转换为胰腺祖细胞中的作用)Nat Genet 32：128-134，2002)。在小鼠(Fukuda A等，Ectopicpancreas formation in Hes1-knockout mice reveals plasticity ofendodermal progenitors of the gut，bile duct，and pancreas.(在Hes1-基因敲除小鼠中异位胰腺形成显示肠道、胆管和胰腺的内胚层祖细胞的可塑性)J Clin Invest 116：1484-1493，2006)和斑马鱼(Esni F等，Notchinhibits Ptf1 function and acinar cell differentiation in developing mouseand zebrafish pancreas.(在发育的小鼠和斑马鱼胰腺中Notch抑制Ptf1功能和腺泡细胞分化)Development 131：4213-4224，2004)，PTF受HES1负调节。在培养于MM1A和CMRL两种培养基的两个独立胰岛制备物中，研究了培养和Notch信号抑制对人类PTF1 mRNA表达水平的影响。第3天的胰岛制备物材料中的PTF1 mRNA表达水平显著性高于完整成人胰腺中所述mRNA的表达水平(2.3倍，P＜0.001)。到第7天，与第3天水平比较，PTF1 mRNA水平显著下降(3.3倍，P＜0.001)。与载体组相比，PTF1 mRNA水平在2μM DAPT组和20μM DAPT组有显著增加，分别为2.3倍(P＜0.001)和3.0倍(P＜0.001)。
与PTF1相似，胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)在胰腺发育中发挥早期的和必要的作用，并且是维持功能所必需的，但不知道是否直接受Notch调节。在这两个独立的胰岛制备物中，在第3天和第7天间，PDX1 mRNA表达显著增加(2.3倍，P＜0.001)，但不被DAPT显著影响(图3B)。
神经发生蛋白(neurogenin)3(NGN3)定义了能产生内分泌细胞、在发育过程中对驱动胰岛形成是必要和充分的祖细胞亚组(LeeJC等，Regulation of the pancreatic pro-endocrine gene neurogenin 3.(胰腺前内分泌基因神经发生蛋白3的调节)Diabetes 50：928-936，2001)。NGN3受HES1负调节。在成人胰腺中检测到极低水平的NGN3 mRNA(第3天的0.05％)。在第3天，NGN3 mRNA水平是人胎胰腺阳性对照RNA的约1/2.7。我们的培养物在第3天和第7天间，NGN3 mRNA水平显著增加(1.7倍，P＜0.001)。与仅载体组相比，NGN3 mRNA表达水平在2μM DAPT组和20μM DAPT组有增加，分别为2.1倍(P＜0.001)和5.2倍(P＜0.001)。在培养基间，NGN3mRNA表达水平无显著性差异。在仅载体组中，NGN3 mRNA水平在CMRL培养基中高于在MM1A中(2.1倍，P＜0.001)。但是，在2μM DAPT和20μM DAPT存在下，NGN3 mRNA水平在MM1A培养基中高于在CMRL中，分别为1.7倍(P＜0.05)和1.9倍(P＜0.001)。
实施例7
CD133+细胞表达NGN3
在用免疫磁珠在D4胰岛制备物(40％胰岛纯度)中富集CD133后，与非富集群体(约25％CD133+)相比，在CD133富集群体(超过98％CD133+)中，NGN3 mRNA水平显著升高(7.5倍，P＜0.001)，而且是人胎胰腺中的11.6倍。与非富集群体相比，该CD133富集群体表达显著低水平的PTF1 mRNA(＜1/1500，P＜0.001)和PDX1 mRNA(1/12.7，P＜0.001)(图3D)。对D4组织中PDX1的免疫组化染色表明，在CD133+细胞中PDX1水平非常低，低至不可检出。在D7组织中也是如此。在培养于或者MM1A或者CMRL培养基中的D7组织中，没有观察到明确的CA19.9/NGN3共表达，然而，有20μM DAPT存在时，在两种培养基条件下都观察到CA19.9/NGN3共表达。
为了确定培养和γ-分泌酶的抑制对NGN3蛋白表达的影响，以及CD133+细胞表达NGN3蛋白的程度，用抗CD133/2和NGN3的抗体对来自所述两个独立胰岛分离物的组织冰冻切片进行染色。在完整成人胰腺对照或D3培养物中未检出NGN3蛋白表达。D7时，分别在MM1A和CMRL培养基中的23.4±6.3％和37.9±8.5％细胞的细胞核中检测到NGN3蛋白。有20μM DAPT存在时，在MM1A和CMRL培养基中，表达NGN3蛋白的细胞的百分比分别为37.8±8.3和43.0±9.9。在从D3至D7于MM1A中培养的第3个独立胰岛分离物(45％胰岛)中，在无DAPT存在和有20μM DAPT存在时，分别有15.4±8.7％和26.3+8.3％细胞核在D7时是NGN3+。虽然在DAPT存在时，NGN3+细胞平均百分比一直较高，但这种差异仅在来自第1个实验系列的MM1A培养基中有统计学显著性(P＜0.01)。在无DAPT存在和有20μM DAPT存在时，在D7鉴别到共表达NGN3和CD133的细胞。在所有处理条件下，都检测到NGN3+/CD133-和NGN3-/CD133+细胞。同种型阴性对照未见高于背景的染色。
为了评价所分离CD133+细胞的体外增殖能力，将D3胰岛制备物(45％胰岛)打散，用免疫磁珠富集CD133表达细胞，并以低细胞密度铺板于用来支持来自大鼠外分泌组织的β细胞体外新生的培养基制剂(Baeyens L等，In vitro generation of insulin-producing betacells from adult exocrine pancreatic cells.(来自成人胰腺外分泌细胞的产胰岛素β细胞的体外培养)Diabetologia 48：49-57，2005)中。在这些培养条件下，12小时后有38.8±5.9％细胞发生贴壁。在接下来的8天，单细胞增殖形成平均细胞数为13.3±7.3(3.7群体倍增)的集落，然后停止分裂。在这一刻，几乎所有的细胞都表达NGN3。未检出胰岛素和胰岛素C-肽的表达。
此外，来自这些培养物的CD133+细胞显示在体外形成球状的能力，这是其它CD133表达祖细胞群体的特征。这些球状很容易在改良HuES培养基[KO-DMEM，1×青霉素/链霉素，1×glutamax，1×NEAA，10％KO血清替代物，0.1×2-巯基乙醇，1×N2补充物(Invitrogen)，10％Plasmanate(Bayer)，成纤维细胞生长因子2(20ng/ml)，白血病抑制因子(10ng/ml)，表皮生长因子(20ng/ml)]或在PS培养基[DMEM/F12，1×青霉素/链霉素，1×glutamax，1×N2补充物(Invitrogen)，成纤维细胞生长因子2(20ng/ml)，白血病抑制因子(10ng/ml)，表皮生长因子(20ng/ml)]中形成，所述培养基已经通过与人胚状体衍生细胞系SDEC过夜培养而对其进行了调节(Shamblott等，Proc Natl Acad Sci USA.2001；98：113-8)。在这些细胞的增殖中显示早期效应的额外生长因子是20ng/ml的血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)。因此，NGN3的表达和对DAPT的应答进一步证明了本文鉴别和利用的CD133+细胞的内分泌祖细胞性质。
实施例8
CD133+细胞的植入
从接受急性胰腺炎手术治疗患者获得胰腺组织，将其用于制备再植用的胰腺内分泌祖细胞。用结合了抗CD133抗体的磁珠，从由人类胰腺组织解离出的胰腺细胞群体中分离出CD133+细胞，如实施例1和实施例2中所描述。用Miami Medium 1A扩增这些细胞。经过7天的培养后，将所扩增的祖细胞群体通过静脉注射施用入患者血管内，以提供胰腺内分泌细胞功能的替代物。
虽然本文已说明和描述了本发明的某些特征，本领域普通技术人员可以想到许多改进、替换、更改和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明精神实质内的所有这些改进和变化。

Claims (21)

1.在细胞样本或组织样本中鉴别胰腺内分泌祖细胞的方法，其包括：将细胞样本或组织样本暴露于与表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞结合的至少一种可检测试剂，由此从样本中鉴别出胰腺内分泌祖细胞。
2.权利要求1的方法，其中，所述至少一种可检测试剂是：与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合且带可检测标记的第一结合配偶体；或者与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合的未标记第一结合配偶体和与未标记第一结合配偶体结合且带可检测标记的第二结合配偶体的组合。
3.权利要求1的方法，其中，所述至少一种可检测试剂包括：能结合膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式、结合CD133、结合CD133/1表位或结合CD133/2表位的至少一种抗体或凝集素。
4.权利要求1的方法，其中，所述细胞样本是胰岛制备物。
5.权利要求1的方法，其中，所述细胞样本是人类胰腺组织。
6.从细胞群体中分离胰腺内分泌祖细胞的方法，其包括：鉴别其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞，将所述细胞与细胞群体分开，从而分离胰腺内分泌祖细胞。
7.权利要求6的方法，其中，所述鉴别包括：将细胞群体暴露于能标记表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的至少一种可检测试剂。
8.权利要求7的方法，其中，所述至少一种可检测试剂是：与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合且带可检测标记的第一结合配偶体；或者与膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式结合的未标记第一结合配偶体和与未标记第一结合配偶体结合且带可检测标记的第二结合配偶体的组合。
9.权利要求8的方法，其中，所述至少一种可检测试剂包括能结合膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式、结合CD133、结合CD133/1表位、或结合CD133/2表位的至少一种抗体或凝集素。
10.权利要求6的方法，其中，所述分离通过荧光激活细胞分选技术进行。
11.权利要求6的方法，其中，所述分离通过下述步骤进行：应用能结合表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的磁珠，分离出结合了所述细胞的磁珠，然后释放其上结合的所述细胞，从而分离出胰腺内分泌祖细胞。
12.权利要求6的方法，其中，所述细胞群体从胰岛制备物中获得。
13.权利要求6的方法，其中，所述细胞群体从人胰腺组织中获得。
14.治疗需要胰腺内分泌替代疗法的患者的方法，其包括：依据权利要求6从细胞群体中分离胰腺内分泌祖细胞，然后将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用于所述患者。
15.权利要求14的方法，其中，所述患者患有胰岛素依赖性糖尿病或胰腺手术后胰岛素缺乏。
16.权利要求14的方法，其中，所述细胞群体从其HLA与受治疗者匹配的胰腺中获得。
17.权利要求14的方法，其中，所述分离的胰腺内分泌祖细胞在施用前先进行体外培养或扩增。
18.权利要求15的方法，其中，所述胰腺内分泌祖细胞由从同一胰腺手术后患者获得的胰腺组织分离。
19.从细胞样本中分离或富集胰腺内分泌祖细胞的系统，其包括：
a.用于检测其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞的方法，和
b.用于将其中所述表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞与细胞样本中其它细胞分开的方法。
20.治疗需要胰腺内分泌替代疗法的患者的方法，包括：依据权利要求19系统从细胞群体中分离或富集胰腺内分泌祖细胞，然后将所分离的胰腺内分泌祖细胞施用至所述患者。
21.胰腺内分泌祖细胞，其通过下述程序制备：获得包含胰腺细胞的细胞群体，鉴别其中表达膜突结合蛋白-1基因产物糖基化形式的细胞，然后将所述细胞与该细胞群体分开；由此，提供分离的胰腺内分泌祖细胞。
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