CN102014623A - 使用聚酮化物合酶制备生物燃料 - Google Patents

使用聚酮化物合酶制备生物燃料 Download PDF

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CN102014623A CN200980115223XA CN200980115223A CN102014623A CN 102014623 A CN102014623 A CN 102014623A CN 200980115223X A CN200980115223X A CN 200980115223XA CN 200980115223 A CN200980115223 A CN 200980115223A CN 102014623 A CN102014623 A CN 102014623A
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莱昂纳德·卡茨
杰弗里·L·福特曼
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Abstract

本发明提供能够合成羧酸或内酯的非天然存在的聚酮化物合酶(PKS)、以及包含这种羧酸或内酯的组合物。羧酸或内酯、或其衍生物用作生物燃料。本发明还提供编码这种PKS的重组核酸或载体、和还具有这种重组核酸或载体的宿主细胞。本发明还提供使用这种PKS制备这种羧酸或内酯的方法。

Description

使用聚酮化物合酶制备生物燃料
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年4月29日提交的美国临时专利申请序列号61/048,817的优先权，其通过引用的方式并入本文中。
政府支持声明
本文中描述和要求的发明是在合同No.DE-AC02-05CH11231下部分使用由美国能源部提供的资金进行的。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及使用聚酮化物合酶制备生物燃料。
背景技术
石油衍生的燃料在一百多年来是主要的能源。然而，石油是本质上经过百万年而形成，并且是不可再生能源。对于替代燃料的大量研究已经进行了几十年。在该领域内，已经深入研究了醇类作为汽油替代品，并且近年来越来越多地使用醇作为运输燃料(Gray et al.，Curr Opin Chem Biol 2006，10：141)。然而，醇作为燃料的效率仍处于争议中(Pimentel，Natural Resources Research 2005，14：65；Farrell et al.，Science2006，311：506)。人们有兴趣设计除了可生物合成地制备的醇以外的几种潜在的可替换燃料分子，并且开发生物合成途径以使用合成生物学来增强目标燃料分子的制备。
本发明包括使用聚酮化物合酶(PKS)来生物合成羧酸和内酯，它们可以是可再生燃料的来源。
发明内容
本发明提供由聚酮化物合酶(PKS)制备的羧酸或内酯。这些羧酸或内酯可以是一个或多个酮化物单元、或2、3、4、5或6或更多个酮化物单元的聚酮化物。羧酸包含一个或多个甲基和/或乙基官能团。内酯是包含一个或多个甲基和/或乙基官能团的偶数内酯环。
本发明提供具有下列化学结构的羧酸：
Figure BPA00001251085600021
其中R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3；或R2和R3各自为H，并且R1为H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。在本发明的一些实施方案中，R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3。在本发明的其他实施方案中，R2和R3各自为H，并且R1为H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。在本发明的特定实施方案中，R2和R3各自为H，并且R1为-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。
本发明提供具有下列化学结构的内酯：
Figure BPA00001251085600022
其中R4是H或-CH3；R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3；并且m是1、3、5、7或9；前提条件是当m是1时，R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3，并且当m是3、5、7或9时，R4是H或-CH3，R5和R6各自为H。
本发明提供能够合成羧酸或内酯的聚酮化物合酶(PKS)。这种羧酸或内酯包括本发明的羧酸和内酯。这种羧酸或内酯包括表1和2中所述的羧酸和表3-7中所述的内酯。
本发明提供编码本发明的聚酮化物合酶(PKS)的重组核酸。本发明还提供包含本发明的重组核酸的载体或表达载体。本发明提供包含本发明的重组核酸和/或PKS中的任一种的宿主细胞。
本发明提供一种制备例如表1和2中所述羧酸的羧酸的方法，包括：提供本发明的宿主细胞；以及在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述羧酸。所述方法还可包括从宿主细胞和/或培养基分离所述羧酸。所述方法还可包括使所述分离的羧酸和醇反应以制备酯。
本发明提供制备羧酸的方法，例如选自由化合物1至53构成的组中的羧酸，包括：提供本发明的宿主细胞；以及在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述羧酸。所述方法还可包括从宿主细胞和/或培养基分离所述羧酸。所述方法还可包括使所述分离的羧酸和醇反应以制备酯。
本发明提供制备内酯的方法，例如表3-7中所述的内酯，包括：提供本发明的宿主细胞；以及在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述内酯。所述方法还可包括从宿主细胞和/或培养基分离所述内酯。
本发明提供包含羧酸或内酯、或衍生自所述羧酸的酯、所述宿主细胞和/或培养基的痕迹残渣和/或污染物的组合物，其分离自制备羧酸或内酯的宿主细胞和/或培养基。
本发明的羧酸或内酯或其衍生物用作生物燃料。
附图简要说明
在结合附图阅读时，本领域技术人员将从下列示意性实施方案的描述中容易地意识到前面的方面和其他方面。
图1示出用于引入聚酮化物链中的使用的模块和对应的前体的类型。加载模块表示为S1和S2。其余化合物表示使用延长剂模块A-J引入生长的聚酮化物链中的结构。虚线表示通过Claisen缩合形成的C-C键；键右边的原子和在虚线左边的碳原子表示由使用的模块确定的结构。R基表示在通过模块确定的引入之前存在的酰基链。缩写为：ave，阿维菌素；ery，红霉素；FK，子囊霉素(FK520)；LM，加载模块；Mod，模块；nys，制霉菌素；olm，寡霉素；pik，苦霉素；srm，螺旋霉素，tyl，泰乐菌素。提议产生的结构和使用的模块用蓝色强调。
图2示出含有6-13个碳原子的还原的短和中链聚酮化物(脂肪酸)。
图3示出β-内酰胺酶抑制剂的结构。数字1-6是指分别通过模块1-6引入的原子。
图4示出从脂肪酸硫酯酶-定向形成内酯。
图5示出在各缩合(和还原)循环的末端的pik PKS的域组织和建议的中间体的结构。线性多肽(Pik AI-AIV)示出为空箭头；模块被示出；域示出为球。彩色编码表示对应于用于编程的模块和域的初期聚酮化物链的链段。缩写：ACP，酰基载体蛋白；AT，酰基转移酶；DH，脱水酶；ER，烯酰还原酶；KR，β-酮还原酶；KS，β-酮酰基-ACP合酶；KSQ；缺少缩合活性但保持脱羧基活性的KS域；TE，硫酯酶。
图6示出用于合成内酯化合物26、27、29和30的示例性PKS。
图7示出用于合成内酯化合物32、35、37和38的示例性PKS。
图8示出用于合成化合物51、52和53的示例性PKS。
具体实施方式
在描述本发明之前，应理解本发明并不限于所述特定实施方案，当然其可以变化。还应理解本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案，并且并非旨在限定，因为本发明的范围只受所附的权利要求书的限定。
在提供数值范围的情况下，应理解在该范围上下限之间的每个插入数值(除非文中另有明确规定，该插入数值到下限单位的十分之一)也特定地包括在内。所述范围中任何规定的数值或插入数值以及所述范围中任何其它规定数值或插入数值之间各较小的范围均包括在本发明内。以在规定的范围内任何具体的排它性限制为条件，这些较小范围的上下限可独立地包括在该小范围内或排除在外，并且包括或不包括上下限或包括其中之一的范围也包括于本发明。在规定的范围包括上下限之一或两者时，排除包括上下限之一或两者的范围也包括在本发明内。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意思相同。虽然任何类似或等同于文中所描述的方法和材料均可用于实践或测试本发明，现在将描述优选的方法和材料。文中提及的所有出版物均纳入本文作为参考来披露和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。
必须注意的是，除非文中另有明确规定，本文中使用和所附的权利要求中的单数形式“一个”、“和”与“该”均包括复数对象。因此，例如，“羧酸”指包括多种这样的羧酸等。
在本说明书和所附权利要求中将引用多个术语，所述术语将定义具有下列意思：
术语“表达载体”或“载体”是指可通过任何合适的方法(包括但不限于转导、转化、转染、感染、电穿孔、结合等)引入宿主细胞中的化合物和/或组合物，从而使细胞表达除了所述细胞天然的核酸和/或蛋白之外或对于所述细胞而言非天然的方式的核酸和/或蛋白。“表达载体”含有待被宿主细胞表达的核酸序列(通常是RNA或DNA)。任选地，表达载体还包含有助于使核酸进入宿主细胞中的材料，例如病毒、脂质体、蛋白被覆等。预期用在本发明中的表达载体包括可插入核酸序列和任何优选或需要的可操作的元件的那些。另外，表达载体必须是可转移到宿主细胞中并在其中复制的表达载体。优选的表达载体是质粒，特别是限制位点已经被文献公开、并且含有对于核酸序列的转录而言优选或需要的可操作的元件。这些质粒以及其他表达载体是本领域普通技术人员所熟知的。
术语“分离的”是指材料基本上或实质上没有通常以天然状态伴随其的组分。
如本文中所使用的，术语“核酸序列”、“核酸的序列”及其变体形式应该通用于多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、任何其他类型的多核苷酸(其是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷)、和含有非核苷酸骨架的其他高分子，前提条件是高分子含有这样配置的核酸碱基，使得碱基配对和碱基堆叠，如在DNA和RNA中发现的那样。
术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子)和第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
在阅读下面更充分地描述的本发明的细节后，本发明的这些和其他目的、优点和特征对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
羧酸(脂肪酸)
本发明提供包含一个或多个甲基和/或乙基官能团的羧酸，其中羧酸通过PKS制备。
本发明提供具有下列化学结构的羧酸：
Figure BPA00001251085600071
其中R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3；或R2和R3各自为H，并且R1为H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。在本发明的一些实施方案中，R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3。在本发明的其他实施方案中，R2和R3各自为H，并且R1为H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。在本发明的特定实施方案中，R2和R3各自为H，并且R1为-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。本发明提供具有如表1和2以及图8中所示的化学结构的羧酸。
内酯
本发明提供具有偶数内酯环的内酯，其包含一个或多个甲基和/或乙基官能团，其中所述内酯由PKS制备。
本发明提供具有下列化学结构的内酯：
其中R4是H或-CH3；R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3；并且m是1、3、5、7或9；前提条件是当m是1时，R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3，并且当m是3、5、7或9时，R4是H或-CH3，R5和R6各自为H。本发明提供具有表3-7中所示的化学结构的内酯。
本发明提供具有下列化学结构的六元内酯：
Figure BPA00001251085600082
其中R1是H或-CH3；R2和R3各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3。本发明提供具有表3中所示的化学结构的六元内酯。
本发明提供具有下列化学结构的八元内酯：
Figure BPA00001251085600083
其中R是H或-CH3。本发明提供具有表4中所示的化学结构的八元内酯。
本发明提供具有下列化学结构的十元内酯：
Figure BPA00001251085600091
其中R是H或-CH3。本发明提供具有表5中所示的化学结构的十元内酯。
本发明提供具有下列化学结构的十二元内酯：
Figure BPA00001251085600092
其中R是H或-CH3。本发明提供具有表6中所示的化学结构的十二元内酯。
本发明提供具有下列化学结构的十四元内酯：
Figure BPA00001251085600093
其中R是H或-CH3。本发明提供具有表7中所示的化学结构的十四元内酯。
聚酮化物合酶(PKS)
本发明提供能够合成羧酸或内酯的聚酮化物合酶(PKS)。这些羧酸或内酯包括本发明的羧酸和内酯。这些羧酸或内酯包括表1和2与化合物51-53中所述的羧酸、以及表3-7中所述的内酯。足以用于合成本发明的各特定羧酸或内酯的PKS模块在表1-7中有所描述。PKS是非天然存在的。在一些实施方案中，PKS是包含天然存在的模块的组合的杂交PKS(其本质上是在该组合中未发现的)。
PKS可以在宿主细胞中，或被分离或纯化。PKS可体内(在宿主细胞中)或体外(在细胞提取物中，或在提供所有必需的化学组分或起始材料之处)合成羧酸或内酯。本发明提供使用这些体内或体外方式中的任一种来制备羧酸或内酯的方法。例如，可使用包含模块S1(srm LM)、D(nys Mod5或olm Mod3)和D(nys Mod5或olm Mod3)的PKS合成羧酸化合物1(参见表1和图1)。例如，可使用包含模块S1(srm LM)、B(ave Mod4或ave Mod5)和D(nys Mod5或olm Mod3)的PKS合成内酯化合物26(参见表3和图1)。
该项目的目标是使用类型I、模块聚酮化物合酶(PKS)来制备多种选择的短链和中链脂肪酸(或它们对应的内酯)。这些分子可以用作转化为生物燃料的起始材料。通常，具有多种化学结构的短链和中链聚酮化物可产生自模块PKS，但转化为生物燃料的最佳化合物是最多地还原的那些。因此，在该提议中将只考虑高度还原的分子。将不描述含有双键或酮基的化合物。含有单一羟基的化合物可形成内酯，因此将对它们进行综述。
聚酮化物合酶通过酰基单元(由短链脂肪酸(CoA的形式)构成)的脱羧Claisen缩合来制备聚酮化物。和脂肪酸合酶(使用乙酰基CoA作为引子并且使用丙二酰基CoA作为延长剂单元)不同，PKS可以使用多种不同的引子(例如乙酰基CoA、丙酰基CoA)和延长剂，它们中的一些含有立体特异性甲基或乙基侧链。为了该提议的目的，将不考虑所述化合物中甲基或乙基侧链的手性。另外，PKS并不总是还原由缩合形成的3-羰基，而是可以使其未还原(酮)、部分还原(羟基，2，3-烯)或完全还原(3-亚甲基)。α-碳和β-羰基的结构(和手性)由在各特定步骤中的增长链的合成中使用的PKS模块决定。图1示出多种模块，所述模块被用于导致形成可能的结构和被用于引入初期酰基(聚酮化物)链中的各模块利用的前体的范围。
链长度由发生的缩合的数量决定，其反过来又由使用的模块数量决定。所有链的生长都使用由加载模块确定的引子，典型地对酰基链的总长度贡献两个(S1)或三个(S2)碳原子。各延长剂模块不仅对骨架贡献两个碳，而且还贡献另外的碳作为侧链。因此，单一缩合可产生少至具有4个碳原子的分子(模块S1和D)和多至具有7个碳原子的分子(模块S2和J)。取决于使用的模块，两次缩合产生含有6-11个碳的分子，而不是6或7个碳的骨架。类似地，三次缩合将产生具有8-14个碳的骨架的分子。
还原水平也由使用的模块来确定。通常，如果期望更多还原的分子，应该使用模块D、J或H组中的之一。如果期望羟基能够内部形成内酯，应该使用来自B或F组的模块。如果PKS硫酯酶域(例如eryTE)置于末端外部模块紧邻下游处，则发生内酯形成。
对生物燃料的兴趣促使使用产生还原的脂肪酸的PKS模块(参见图1，模块S1、S2、B、D、F、H和J)。示出24种这样的完全还原的脂肪酸，其由6-13个碳原子构成。化合物1-6、8-10、12-16和18-20从加载模块和两个延长剂模块产生为三酮化物。它们如表1中所述那样制备。剩余分子使用加载域和三个或更多延长剂模块。它们可使用模块从下列物质制备：涉及β-内酰胺酶抑制剂合成的Ize PKS(图3，化合物25)、从Micromonospora chalcea subsp.izumensis分离的还原的聚酮化物。
表1.用于合成还原的三酮化物脂肪酸的模块。所述模块在图1中描述。
  化合物   加载   1   2
  1   S1   D   D
  2   S2   D   D
  3   S1   D   H
  4   S1   H   D
  5   S2   D   H
  6   S2   H   D
  8   S1   H   H
  9   S1   D   J
  10   S1   J   D
  12   S1   H   J
  13   S1   J   H
  14   S2   H   H
  15   S2   D   J
  16   S2   J   D
  18   S1   J   J
  19   S2   J   H
  20   S2   H   J
  22   S2   J   J
化合物7、11、17、21、23和24可以通过下列方式制备：通过IzePKS的5(取决于期望分子的尺寸)，结合加载模块S1或S2和模块2，如表2中所列出的。Ize模块2至6预计模拟模块D，但彼此足以不同以合适的形式共存，但不经历类似的重组。
表2.短链和中链未支化的脂肪酸的制备
  化合物   建议的构建方法
  7   S1+Ize模块2-4
  11   S2+Ize模块2-4
  17   S1+Ize模块2-5
  21   S2+Ize模块2-5
  23   S1+Ize模块2-6
  24   S2+Ize模块2-6
含有偶数的环原子(最少6个)的内酯可从PKS通过羟基(相对于末端羰基官能团的位置)的策略取代而制备，如图4所示。如果TE(硫酯酶)域在构建的PKS中在末端模块的3′取代，则细胞内形成内酯。内酯环的尺寸将由羟基和羰基的相对位置来决定。能够制备表3-7中所述的内酯的PKS全部还包含TE(硫酯酶)域，并且置于PKS中的末端模块的3′。
尽管可以制备多种另外的化合物作为六元内酯，但是我们将仅考虑形成化合物26-37。这些通过加载域和两个模块的装配而产生，如表3中所列出的。模块1含有酮还原酶域以能够制备用于形成内酯所必需的羟基。制备32的可选择的方法使用spinosyn PKS的天然存在的加载域和第一两个模块。
表3.六元内酯环的制备
含有8个或更多个原子(38-45)的内酯可通过引子模块(S1或S2)和三个或多个连续的延长剂模块的装配而制备。这些分子可通过下列方式来制备：使用模块1和具有加载域S1或S2的Ize PKS的下游相邻模块，如表4-7中所述。
表4.八元内酯环的制备
Figure BPA00001251085600141
表5.十元内酯环的制备
Figure BPA00001251085600142
表6.十二元内酯环的制备
Figure BPA00001251085600143
表7.十四元内酯环的制备
Figure BPA00001251085600151
聚酮化物合酶(PKS)在Claisen缩合反应中使用短链脂肪酰基CoA来制备聚酮化物。和脂肪酸合酶(使用乙酰基CoA作为引子并且使用丙二酰基CoA作为延长剂单元，和迭代地使用单一模块以制备初期酰基链)不同，PKS由离散的模块构成，其分别催化单一步骤的链生长。组成中的模块可彼此不同，使得总的来说，可以引入一些不同的引子(例如乙酰基CoA、丙酰基CoA)和延长剂，它们中的一些含有立体特异性甲基(或乙基)侧链。另外，PKS模块并不总是还原由缩合形成的3-羰基，而是可使其未还原(酮)、部分还原(羟基、2，3-烯)或全部还原(3-亚甲基)。多种聚酮化物合酶使用丙二酰基CoA或[S]-2-甲基丙二酰基CoA作为引子以用于聚酮化物合成。在这样的情况下，末端羧基通常通过存在于PKS的相应加载域的N-末端处的脱羧酶域而除去。简言之，α-碳和β-羰基的结构(和手性)由在各特定步骤中生长链的合成中使用的PKS的模块来确定。由于合成中使用的模块和制备的聚酮化物的结构之间的相应性，因此通过聚酮化物合酶的选择和基因操纵可以编程所述合成以制备具有期望结构的化合物。图1示出多种模块和各模块利用的前体以引入到相应的初期酰基(聚酮化物)链中，从而导致目标化合物的范围。图1还提供各模块的PKS源。各PKS源对本领域的普通技术人员来说是熟知的，并且容易获得。另外，对于图1中教导的各模块，可以是除了可使用的其他PKS之外的其他模块。
所有的延长剂模块携带：β-酰基ACP合酶(通常称为酮合酶或KS)域，其在延长剂和生长聚酮化物链之间进行脱羧缩合步骤；和酰基载体蛋白(ACP)域，其携带生长酰基链并使其存在至同源还原域以还原β-羰基。组成中的模块可彼此不同，使得可以引入一些不同的引子和延长剂单元，它们中的一些含有立体特异性侧链(例如甲基、乙基、亚丙基)。各模块的酰基转移酶(AT)域确定引入的延长剂单元(例如丙二酰基CoA、甲基丙二酰基CoA等)。另外，PKS模块并不总是还原由缩合形成的β-羰基，而是可使其未还原(酮)、部分还原(羟基、2，3-烯)或全部还原(3-亚甲基)，如图1中所示。酮还原酶(KR)域将酮还原成OH官能团(立体特异性)；脱水酶(DH)域从α和β的碳除去水，并且导致α，β反式双键；烯酰还原酶(ER)域将双键还原成β-亚甲基中心；因此，β-羰基的还原性状态由相应的模块中的存在的功能性还原性域而决定。很少发现模块含有另外的C-甲基化域(从而产生另外的α-甲基侧链，如埃博霉素中那样)。因此，PKS的构成确定了引入的引子和延长剂酰基单元的选择、在各缩合步骤中还原的程度、和加入链的单元的总数。自然中见到的聚酮化物的结构的较广的多样性归因于PKS组成的多样性。抗菌素苦霉素的配基组分(narbonolide)的PKS-定向合成示于图5中。pik PKS使用6个模块(加载域在模块1的N-末端处)；加载域和模块1、3、4、5和6使用前体[S]-2-甲基丙二酰基CoA，模块2使用丙二酰基CoA。(然而在引入后，三个侧链通过仍未完全地理解的过程而反转。)在各缩合循环后还原的各种程度由在各模块中存在相应的还原性域决定。PKS产物的循环性质是由于在ACP6的末端硫酯键上在第一缩合循环后产生的OH的TE域-催化的亲核性攻击。因此，聚酮化物narbonolide的结构由pik PKS来编程。
工程化聚酮化物合酶
本发明提供编码本发明的聚酮化物合酶(PKS)的重组核酸。重组核酸可以是双链或单链DNA或RNA。重组核酸可以编码本发明的PKS的可读框(ORF)。重组核酸还可以包含用于在合适的宿主细胞中转录ORF的启动子序列。重组核酸还可以包含足以具有在宿主细胞中稳定地复制的重组核酸的序列。重组核酸可以是在宿主细胞中能够稳定保持的复制子。在一些实施方案中，复制子是质粒。本发明还提供包含本发明的重组核酸的载体或表达载体。
本领域的普通技术人员将意识到多种重组载体可用在本发明的方面的实施中。如本文中所使用的，“载体”是指用于将重组核酸引入细胞中以进行表达或复制的多核苷酸元件。这种载体的选择和使用在本领域中是常规的。“表达载体”包括能够表达这样的DNA的载体，所述DNA和调节序列(例如启动子区域)操作性连接。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体(其在引入合适的宿主细胞中后导致克隆的DNA的表达)。合适的表达载体是本领域普通技术人员所熟知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些、和保持附加性的那些或整合到宿主细胞基因组中的那些。
载体可被选择，从而含有以这样的方式和所得编码序列操作性连接的控制序列，该方式为编码序列的表达可在合适的宿主中实施。合适的控制序列包括在真核和原核宿主细胞中发挥作用的那些。如果克隆载体(其被用于获得编码衍生的PKS缺失控制序列的PKS基因以进行表达)和编码核苷酸序列操作性连接，核苷酸序列被插入合适的表达载体中。这可单独完成，或使用分离的编码核苷酸序列的库(其可插入宿主载体中)来完成，所得载体转换或转染到宿主细胞中，并且所得细胞接种到单独集落中。多种类型有机体的单一细胞培养物的合适控制序列是本领域熟知的。用于在酵母中表达的控制体系是可广泛获得的，并且是常规使用的。控制元件包括启动子(任选地含有操作子序列)，并且取决于宿主的性质包括其他元件，例如核糖体结合位点。特别可用于原核宿主的启动子包括来自PKS基因群的那些，所述基因群导致作为第二代谢物的聚酮化物的产生，包括来自I型或芳族(II型)PKS基因群的那些。例子为act启动子、tcm启动子、螺旋霉素启动子等。然而，也可使用其他细菌启动子，例如衍生自糖(例如半乳糖、乳糖(lac)和麦芽糖)代谢酶的那些。另外的例子包括衍生自生物合成酶的启动子，例如用于色氨酸(trp)、β-内酰胺酶(bla)、λ噬菌体PL和T5的启动子。另外，可以使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利No.4,551,433；其通过引用的方式并入)。
如所述，特别有用的控制序列是本身或者和合适的调节体系一起在营养菌丝体中从生长转化到平稳期的过程中活化表达的那些。这些类型的示意性控制序列、载体和宿主细胞包括修饰的S.coelicolor CH999和在PCT公开no.WO 96/40968中所述的载体、和S.lividans的类似菌株。参见美国专利No.5,672,491、5,830,750、5,843,718和6,177,262，它们均通过引用的方式并入。其他调节序列也可以是期望的，其允许相对于宿主细胞的生长而调节PKS序列的表达。调节序列是本领域普通技术人员已知的，并且例子包括引起基因对应于化学或物理刺激(包括存在调节化合物的情况)而打开或关闭表达的那些。其他类型的调节元件(例如增强子序列)也可以存在于载体中。
合适的标记也可以包括在重组表达载体中。多种标记是已知的，它们可用于选择变形细胞系，并且通常包含这样的基因，当细胞在合适的选择性培养基中生长时，所述基因的表达赋予变形的细胞合适的显型。例如，这些标记包括赋予质粒抗菌素抗性或敏感性的基因。
多种PKS核酸序列或核苷酸序列或这些序列的混合物可以使用单独的控制元件或在单一启动子的控制下，作为单独的盒克隆到一种或多种重组载体中。PKS亚单位或组件可以包括侧翼限制位点以允许其他PKS亚单位的容易缺失和插入。这些限制位点的设计是本领域普通技术人员已知的，并且可以使用上述技术来完成，例如定向突变和PCR。将本发明的重组载体引入合适的宿主中的方法是本领域普通技术人员已知的，并且典型地包括使用CaCl2或其他试剂(例如二价阳离子)、脂质转染法、DMSO法、原生质体转化法、配对法和电穿孔法。
在检查的30多种PKS中，生物合成中使用的模块和制备的聚酮化物的结构之间的相应性在PKS的蛋白序列和相应的基因的DNA序列的水平上完全理解。模块编程到聚酮化物结构中可以通过序列鉴别来鉴定。可以克隆(或合成)相应于所需模块的DNA序列并且将它们作为完全功能单元转移到异源，否则非聚酮化物中，从而产生宿主例如E.coli(B.A.Pfeifer，S.J.Admiraal，H.Gramajo，D.E.Cane，C.Khosla，Science 291，1790(2001)；其通过引用的方式并入)和Streptomyces(C.M.Kao，L.Katz，C.Khosla，Science 265，509(1994)；其通过引用的方式并入)。用于聚酮化物生物合成的另外的基因也被鉴定。确定磷酸泛酰巯基乙胺：蛋白转移酶(PPTase)(转移ACP域的4-磷酸泛酰巯基乙胺辅因子)的基因，通常存在于产生聚酮化物的宿主中，已经在E.coli和其他宿主中克隆(K.J.Weissman，H.Hong，M.Oliynyk，A.P.Siskos，P.F.Leadlay，Chembiochem 5，116(2004)；其通过引用的方式并入)。此外，用于制备前体(例如甲基丙二酰基CoA和乙基丙二酰基CoA)的基因也已经被鉴定和克隆到异源宿主中。还可以重新编程聚酮化物生物合成以制备具有期望结构的化合物，其通过单一PKS的基因操作或由来自两种或多种来源的模块构成的杂化PKS的构建来进行(K.J.Weissman，H.Hong，M.Oliynyk，A.P.Siskos，P.F.Leadlay，Chembiochem 5，116(2004)；其通过引用的方式并入)。
操作模块PKS基因以制备本发明的PKS的重组方法在美国专利No.5,672,491、5,843,718、5,830,750、5,712,146和6,303,342、以及PCT公开no.WO 98/49315和WO 97/02358中有所描述，其通过引用的方式并入。多种基因工程策略被用于多种PKS以确定聚酮化物的结构可以被操纵以制备新型聚酮化物(参见上述引用的专利文献和Hutchinson，1998，Curr Opin  Microbiol.1：319-329，and Baltz，1998，Trends Microbiol.6：76-83；其通过引用的方式并入)。在一些实施方案中，杂化PKS的组分布置在多肽上，所述多肽具有多肽内接头，所述多肽内接头将多肽组件导向到功能性PKS蛋白中，使得不需要PKS在多肽中具有如自然PKS中观察到的相同布置的模块。接合多肽的合适的多肽内接头和在多肽内接合模块的多肽内接头在PCT公开no.WO00/47724中有所描述，其通过引用的方式并入。
已经阐明多种聚酮化物途径提供不同选择的宿主以制备这些本发明的羧酸和内酯，如表1-7和化合物51-53中所示。尽管所述产物可以在尺寸和官能性上有较大区别，但是所有都事实上使用相同的策略进行生物合成。非同源酶配子之间确切的界面将视情况而决定。来自目标蛋白的ACP-接头-KS和ACP-接头-TE区域将比对以检查最少破裂的融合点以用于杂化合酶。基因构建将使用不依赖于序列和接头的克隆(SLIC)以消除基因“瘢痕”。
可在标记本发明的PKS中使用的PKS序列的部分来源列表例如但不限于，包括Ambruticin(美国专利No.7,332,576)；阿维菌素(美国专利No.5,252,474；MacNeil et al.，1993，Industrial Microorganisms：Basic and Applied Molecular Genetics，Baltz，Hegeman，&Skatrud，eds.(ASM)，pp.245-256；MacNeil et al.，1992，Gene 115：119-25)；杀假丝菌素(FRO008)(Hu et al.，1994，MoI.Microbiol.14：163-72)；埃博霉素(美国专利No.6,303,342)；红霉素(WO 93/13663；美国专利No.5,824,513；Donadio et al.，1991，Science 252：675-79；Cortes et al.，1990，Nature348：176-8)；FK506(Motamedi et al.，1998，Eur.J.Biochem.256：528-34；Motamedi et al.，1997，Eur.J.Biochem.244：74-80)；FK520或子囊霉素(美国专利No.6,503,737；还参见Nielsen et al.，1991，Biochem.30：5789-96)；Jerangolid(美国专利No.7,285,405)；细霉素(美国专利No.7,288,396)；洛伐他汀(美国专利No.5,744,350)；奈马克丁(MacNeil et al.，1993，supra)；尼达霉素(Kakavas et al.，1997，J.Bacteriol.179：7515-22)；竹桃霉素(Swan et al.，1994，MoI.Gen.Genet.242：358-62；美国专利No.6,388,099；Olano et al.，1998，MoI.Gen.Genet.259：299-308)；寡霉素(Omura，S.，Ikeda，H.，Ishikawa，J.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：12215-12220)；岬毒素(PCT公开no.WO2003/044186)；苦霉素(Xue et al.，2000，Gene 245：203-211)；匹马霉素(PCT公开no.WO 2000/077222)；Platenolide(EP Pat.App.791，656)；雷帕霉素(Schwecke et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7839-43)；Aparicio et al.，1996，Gene 169：9-16)；利福霉素(August et al.，1998，Chemistry & Biology，5：69-79)；Soraphen(美国专利No.5,716,849；Schupp et al.，1995，J.Bacteriology 177：3673-79)；螺旋霉素(美国专利No.5,098,837)；泰乐菌素(EP 0 791,655；Kuhstoss et al.，1996，Gene 183：231-36；美国专利No.5,876,991)。其他合适的PKS编码序列是本领域普通技术人员容易获得的，或者保持为发现或表征的，但是对于本领域普通技术人员来说是可获得的(例如通过参照GenBank)。引用的各参考文献都是特异性的，并且单独通过引用的方式并入。
络合聚酮化物包含较多种类的天然产物，所述天然产物在细菌(主要成员是放射菌族；例如Streptomyces)、真菌和植物中合成。聚酮化物形成大多数临床上重要的药物的配基组分，例如抗菌素(例如红霉素、泰乐菌素)，抗真菌剂(例如制霉菌素)、抗癌剂(例如埃博霉素)、免疫抑制剂(例如雷帕霉素)等。尽管这些化学物在它们的结构或它们的作用模式上彼此并不相同，但是它们具有共同基础以用于它们的生物合成，这通过称为聚酮化物合酶的酶的组来进行。
加载模块和至多两个延长剂模块的装配可在E.coli中完成。需要乙酰基CoA和丙二酰基CoA作为前体的化合物可在E.coli宿主中制得。模块还可以在载体中克隆，所述载体可引入多种Streptomyces宿主中(例如Streptomyces coelicolor)。
需要丙酸酯(丙二酸甲酯)前体的化合物可在多种Streptomyces宿主(其具有这些前体的丰富供应)中制备。可选择地，E.coli可加入丙酸酯，并且酶甲基丙二酰基CoA变位酶可克隆到E.coli宿主中，其工程化以引入vitB 12。
需要模块J以用于它们合成的化合物将含有乙基侧链，并且使用2-乙基丙二酰基CoA作为前体。丙二酸乙酯从丁酸酯的异构化制备。以该途径编码酶来制备该前体的基因可克隆到合适的E.coli中。多种链霉菌存在，其产生乙基丙二酰基CoA，它们中的一些适于克隆和表达PKS基因(例如Streptomyces fradiae)。
可能并不明智使用E.coli来制备分子(需要三个或更多个模块用于它们的合成)的生物合成所需要的构建体。三个模块将包含15kb或更多。β-内酰胺酶抑制剂PKS是用于合成这些化合物和原位操纵宿主Micromonospora chalcea subsp.izumensis的染色体组中的PKS的良好选择。
宿主细胞
本发明提供包含本发明的重组核酸和/或PKS的任一种的宿主细胞。宿主细胞可以是基因修饰的宿主细胞。在培养时，宿主细胞能够制备任何本发明的羧酸或内酯，包括但不限于化合物1-53的那些。在一些实施方案中，在培养时，宿主细胞能够制备表1和2中所述的羧酸以及表3-7中所述的内酯。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
本发明的宿主细胞是基因修饰的，因为异源核酸已经引入宿主细胞中，这样基因修饰的宿主细胞不会天然发生。合适的宿主细胞是能够表达核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体编码能够生物合成羧酸或内酯的PKS。编码PKS的重组核酸操作地连接异源启动子和一个或多个控制区域，其导致PKS在宿主细胞中的表达。
任何真核或原核宿主细胞可用在本发明的方法中，只要其在用核酸序列转化后保持能生存即可。通常，尽管不是必需的，但是宿主微生物是细菌。细菌宿主细胞的例子包括但不限于分配至Escherichia、Enterobacter、Azotobacter、Erwinia、Bacillus、Pseudomonas、Klebsiella、Proteus、Salmonella、Serratia、Shigella、Rhizobia、Vitreoscilla、和Paracoccus taxonomical类的那些种。优选地，宿主细胞不会受到必需核酸序列的转导、随后的蛋白表达(即，酶)、或用于实施和甲羟戊酸酯途径相关的步骤所需要的所得中间体的不利影响。例如，优选在宿主细胞的自身代谢过程和甲羟戊酸酯途径相关的那些过程之间发生最小的“干扰”(即，相互干扰)。合适的原核细胞包括Escherichia coli、Pseudomonas putida或Streptomyces种。
合适的真核细胞包括但不限于真菌、昆虫或哺乳动物细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，例如来自Saccharomyces或Schizosaccharomyces种。来自Saccharomyces种的合适的种类为Saccharomyces cerevisiae。来自Schizosaccharomyces种的合适的种类为Schizosaccharomyces pombe。
使用本发明的PKS制备羧酸或内酯的方法
本发明提供制备本发明的羧酸的方法，例如表1和2与化合物51-53中所述的羧酸，包括：提供本发明的宿主细胞；以及在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述羧酸。所述方法还可包括从宿主细胞和/或培养基分离所述羧酸。所述方法还可包括使所述羧酸和醇反应以制备酯。
从宿主细胞和/或培养基分离所述羧酸的步骤可包括将培养基的pH减小至约3.5，并且使用合适的溶剂从培养基中提取羧酸。合适的溶剂包括乙酸乙酯、醋酸戊酯、四氢呋喃等。然后羧酸在中性pH下重新提取到水中，然后通过离子交换色谱法、HPLC等进一步纯化。所述酸可转化为用作生物燃料的酯。这将还除去在提取过程中对于pH调节的需要。
线性羧酸酯可以通过在酸催化剂的存在下使它们和醇加热而酯化。合适的酸催化剂是本领域技术人员熟知的。合适的酸催化剂是浓硫酸。酯化反应是缓慢的和可逆的，因此酯通常蒸馏出来以防止重新形成酸。合适的酯化方法是本领域技术人员熟知的。酸RCOOH和醇R′OH(其中R和R′可以相同或不同)之间反应的等式为：
Figure BPA00001251085600231
本发明提供制备本发明的内酯的方法，例如表3-7中所述的内酯，包括提供本发明的宿主细胞；以及在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述内酯。所述方法还可包括从宿主细胞和/或培养基分离所述内酯。
内酯通常从细胞中提取到周围介质中。从宿主细胞和/或培养基分离所述内酯的步骤可包括在中性pH下使用合适的溶剂从培养基中提取内酯，然后通过干燥溶剂相来浓缩内酯。合适的溶剂包括乙酸乙酯、醋酸戊酯、四氢呋喃等。内酯可通过反相色谱法、HPLC等进一步纯化。
所述方法还可包括氧化或燃烧可燃烧的组合物(所述组合物包含从宿主细胞中分离的酯和/或内酯或其混合物)以获得能量。在一些实施方案中，氧化或燃烧是完全的或基本上完全的。在一些实施方案中，获得的能量是热能和/或增加的压力。在一些实施方案中，氧化或燃烧发生在引擎中。引擎可以是任何氧化或燃烧燃料以获得能量的引擎，例如内燃机、外燃机、喷气发动机、炉、锅炉等。
例如，异源表达PKS基因的多种方法、适于表达这些基因的宿主细胞的多种方法、和制备聚酮化物的多种方法在下列文献中有所描述：美国专利No.5,843,718、5,830,750和6,262,340；WO 01/31035、WO01/27306和WO 02/068613；和美国专利申请公开No.20020192767和20020045220；它们通过引用的方式并入。
本发明提供包含羧酸或内酯、或衍生自所述羧酸的酯、所述宿主细胞和/或培养基的痕迹残渣和/或污染物的组合物，其分离自制备羧酸或内酯的宿主细胞和/或培养基。
分离羧酸或内酯包括从至少部分或全部宿主细胞和/或培养基或其部分(羧酸或内酯从其中制备)中分离羧酸或内酯。分离的羧酸或内酯可不含或基本上不含由至少部分或全部宿主细胞和/或培养基或其部分形成的杂质。分离的羧酸或内酯基本上不含这些杂质，此时所述杂质的量和性能不干扰所述组合物作为燃料的使用，例如燃烧反应中的燃料。这些宿主细胞是本质上不产生羧酸或内酯的特异性细胞。
本发明还提供可燃烧的组合物，其包含分离的酯或内酯和细胞组分，其中细胞组分基本上不干扰所述组合物的燃烧。细胞组分包括全部细胞或其部分。细胞组分衍生自产生羧酸的宿主细胞，所述酯或内酯从其中产生。
本发明的酯或内酯可用作作为能量的化学来源的燃料，其可用作石油衍生的燃料、乙醇等的替代品。本发明的羧酸或内酯还可用于烷烃、醇、和用作可再生的燃料的多种酯的合成中。另外，羧酸或内酯还可作为合成治疗剂或高价油(例如可可油等价物)的前体。羧酸或内酯还可用于制备类花生酸类物质或相关分子的种类，其可具有和治疗相关的应用。
可燃烧的组合物还可包含一种或多种能够氧化或燃烧的烃或它们的混合物，例如生物燃料、矿物燃料等。
已经描述了本发明，提供下列实施例以通过示意性的方式而非通过限制性的方式来描述本发明。
实施例1
用于制备六元内酯的PKS的克隆方案
本发明的六元内酯可使用下述方法来制备。
来自之前表征的途径的加载域(LD)和第一延长模块连接至模块，所述模块将使第一延长剂饱和，并且引入后面的期望延长剂单元。来自红霉素生物合成途径的硫酯酶(TE)表明非常适于环化六元内酯。因此，该TE被用于环化所有这些初始产物。该方案限制每个构建体中两个之间相邻的不饱和内部模块的数量。这些中的一个(加入TE)被充分公开，并且是本领域技术人员所熟知的。
途径如下所示：来自Streptomyces ambofaciens的螺旋霉素簇(来自Streptomyces caelestis的尼达霉素途径也可起到该作用)被用于醋酸酯引子和一个醋酸酯延长。来自Streptomyces bikiniensis的查耳霉素途径被用于加载醋酸酯和延长丙酸酯。来自Saccharapolyspora spinosa的多杀菌素途径被用于引入丙酸酯引子和醋酸酯延长。来自Streptomyces fradiae的泰乐菌素途径被用于引发和用丙酸酯延长。来自S.noursei的制霉菌素途径提供方式来引入另外醋酸酯和饱和之前延长的羰基。来自Saccharopolyspora erythraea的红霉素途径提供丙酸酯延长并还原倒数第二个羰基、以及在所有构建体中使用的硫酯酶。
下列菌株可得自国家培养物中心：Streptomyces ambofaciens ATCC 23877；S.caelestis NRRL-2821；S.bikiniensis NRRL2737；Saccharapolyspora spinosa NRRL 18538和18823；S.fradiae ATCC19609；S.noursei ATCC 11455和Saccharopolyspora erythraea ATCC11635。
初始基因构建体在E.coli的两个载体和Streptomyces coelicolor的两个载体中构建。具体而言，它们是用于E.coli的pPRO18(丙酸酯诱导)和pET28(IPTG诱导)以及用于S.coelicolor的pOJ446(胞质)和pSET152(积分)。ErmE*和Tet启动子用于Streptomyces构建体中以分别开发连续和可诱导的表达。由于E.coli不产生基本的构建块丙二酸甲酯，因此，BAP1菌株被用作宿主。可选择地，还可以使用质粒基系统，所述系统能够将琥珀酰基-CoA转化成丙二酸甲酯。
所有构建体被设计以制备单一蛋白，所述蛋白能够催化所有必须用于将构建块丙二酰基-CoA和/或甲基丙二酰基-CoA转化为期望产物的步骤。在图6和7中所示出的生物合成路线中，这需要两个非天然相互作用/构建体。在所有的情况下，它们在第一和第二延长模块之间，并且再次在第二延长模块和硫酯酶之间。在所述构建体中，加载域、第一延长模块和(在大部分情况下)来自第二延长模块的酮合酶域都衍生自单一途径。例外是含有加载域和来自多杀菌素途径的第一延长的那些构建体。这两个模块存在于单一酶中。因此，为了避免蛋白-蛋白相互作用的问题，加入接头肽以将该酶融合到靶络合物的下游部分。
尽管已经参照特定的实施方案来描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种修改，并且可以替换等价物。另外，可以进行多种改变以使特定的情况、材料、物质组成、过程、过程的一个步骤或多个步骤适应本发明的主题、精神和范围。所有这些修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (26)

1.一种组合物，包含具有下列化学结构的羧酸：
Figure FPA00001251085500011
其中R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3；或R2和R3各自为H，并且R1为H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。
2.权利要求1所述的组合物，其中R1是H或-CH3；R2是H、-CH3或-CH2CH3；并且R3是H、-CH3或-CH2CH3。
3.权利要求1所述的组合物，其中R2和R3各自为H，并且R1是H、-CH3或-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。
4.权利要求3所述的组合物，其中R2和R3各自为H，并且R1是-(CH2)nCH3，其中n是1至6的整数。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述羧酸是表1和2中公开的任何羧酸。
6.一种组合物，包含具有下列化学结构的内酯：
Figure FPA00001251085500012
其中R4是H或-CH3；R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3；并且m是1、3、5、7或9；前提条件是当m是1时，R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3，并且当m是3、5、7或9时，R4是H或-CH3，R5和R6各自为H。
7.权利要求6所述的组合物，其中m是1，R5和R6各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3。
8.权利要求6所述的组合物，其中m是3、5、7或9，R4是H或-CH3，R5和R6各自是H。
9.权利要求6所述的组合物，其中所述内酯是表3-7中公开的任何内酯。
10.权利要求7所述的组合物，其中所述内酯是具有下列化学结构的六元内酯：
其中R1是H或-CH3；R2和R3各自独立地为H、-CH3或-CH2CH3。
11.权利要求8所述的组合物，其中所述内酯是具有下列化学结构的八元内酯：
Figure FPA00001251085500022
其中R是H或-CH3。
12.权利要求8所述的组合物，其中所述内酯是具有下列化学结构的十元内酯：
Figure FPA00001251085500031
其中R是H或-CH3。
13.权利要求8所述的组合物，其中所述内酯是具有下列化学结构的十二元内酯：
Figure FPA00001251085500032
其中R是H或-CH3。
14.权利要求8所述的组合物，其中所述内酯是具有下列化学结构的十四元内酯：
其中R是H或-CH3。
15.一种能够合成羧酸或内酯的聚酮化物合酶(PKS)，其中所述PKS不是天然存在的。
16.权利要求15所述的PKS，其中所述羧酸或内酯是表1-7中所述之一或是选自化合物1-53中的化合物。
17.一种编码权利要求15所述的聚酮化物合酶(PKS)的重组核酸。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述羧酸或内酯是表1-7中所述之一或是选自化合物1-53中的化合物。
19.一种包含权利要求17所述的重组核酸的载体。
20.一种包含权利要求19所述的载体的宿主细胞，其中当在合适的条件下培养时，所述宿主细胞能够制备所述羧酸或所述内酯。
21.一种制备羧酸的方法，包括：
(a)提供权利要求20所述的宿主细胞；以及
(b)在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述羧酸。
22.权利要求21所述的方法，还包括：(c)从所述宿主细胞和/或所述培养基中分离所述羧酸。
23.权利要求22所述的方法，还包括：(d)使所述分离的羧酸和醇反应以制备酯。
24.一种制备内酯的方法，包括：
(a)提供权利要求20所述的宿主细胞；以及
(b)在合适的培养基中培养所述宿主细胞，使得制得所述内酯。
25.权利要求24所述的方法，还包括：(c)从所述宿主细胞和/或所述培养基中分离所述内酯。
26.一种包含羧酸或内酯、或衍生自所述羧酸的酯、所述宿主细胞和/或培养基的痕迹残渣和/或污染物的组合物，其分离自制备羧酸或内酯的宿主细胞和/或培养基。
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