CN101991572B

CN101991572B - 一种二肽基肽酶ⅳ新抑制剂

Info

Publication number: CN101991572B
Application number: CN2009100567957A
Authority: CN
Inventors: 刘桂霞; 唐赟; 黄瑾; 李璀; 卢伟强; 卢春华
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-08-21
Also published as: CN101991572A

Abstract

本发明涉及一种二肽基肽酶IV新抑制剂，所述二肽基肽酶IV新抑制剂是N′-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-4，5，6，7-四氢化-1H-吲唑-3-酰肼(N′-[(2-hydroxy-1-naphthyl)methylene]-4，5，6，7-tetrahydro-1H-indazole-3-carbohydrazide)，其结构式如下所示，还提供了上述二肽基肽酶IV新抑制剂的筛选方法及用途，本发明的二肽基肽酶IV新抑制剂结构新颖，能有效抑制二肽基肽酶IV，从而可以作为药物先导化合物，用于制备糖尿病治疗药物，为广大糖尿病患者带来福音。

Description

一种二肽基肽酶Ⅳ新抑制剂

技术领域

本发明涉及药物学技术领域，特别涉及糖尿病治疗药物技术领域，具体是指一种二肽基肽酶IV(DPP-IV)新抑制剂及用途。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌疾病，古代称为“消渴”。它是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏而引起的血中葡萄糖浓度升高，进而糖大量从尿中排出，并且出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状。根据国际糖尿病联盟(IDF)的糖尿病地图，目前全球的糖尿病患者超过了2.5亿，预计到2025年这个数字将会增加至3.8亿。糖尿病是增长最快的影响全人类健康的疾病之一，也是21世纪的一种流行性疾病，主要分为I型和II型两种：I型又称为青少年糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病，而II型则成为成年型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病。20岁以上年龄的患者中，患II型糖尿病的人数占据了几类糖尿病患者人数的90％-95％。II型糖尿病是一种慢性代谢疾病，其特征是空腹和食后血糖浓度都很高。目前广泛认为II型糖尿病是高血糖症状是由胰腺β-细胞异常，胰岛素分泌不足，胰岛素抵抗和/或肝葡萄糖产量增加引起的。

自从发现肠降血糖素高血糖素样肽1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)具有降低血糖浓度的可能性，并且在II型糖尿病患者体内发现他们会产生低于正常水平的GLP-1以及对GIP具有不正常的响应，II型糖尿病的研究就进入了一个新的阶段。在进餐过程中，这些肠降血糖素从小肠中分泌到脉管系统，以葡萄糖依赖的形式刺激胰岛素分泌(Creutzfeldt，W.，The entero-insular axis in type 2 diabetes--incretins as therapeutic agents.Exp Clin EndocrinolDiabetes，2001.109 Suppl 2：S288-303)。一餐饭中有50-60％的胰岛素分泌是源自肠降血糖素的作用(Creutzfeldt，W.and M.Nauck，Gut hormones and diabetes mellitus.Diabetes Metab Rev，1992.8(2)：149-77)。目前对这些肠降血糖素的增效作用主要是通过对DPP-IV的抑制作用间接实现的。DPP-IV是一种二肽基肽酶，它对倒数第二位氨基酸是脯氨酸或丙氨酸的多肽底物有较强的选择性，是负责降解体内肠降血糖素的一种主要的酶，高达95％的GLP-1都是由DPP-IV负责降解的(Deacon，C.F.，A.H.Johnsen，and J.J.Holst，Degradation of glucagon-likepeptide-1 by human plasma in vitro yields an N-terminally truncated peptide that is a majorendogenous metabolite in vivo.J Clin Endocrinol Metab，1995.80(3)：952-7)。肠降血糖素降解被阻断后，引起胰岛素分泌的增加，这被认为是DPP-IV特异性抑制剂的主要作用方式。DPP-IV基因靶向灭活的小鼠其葡萄糖耐受性提高，GLP-1、GIP和胰岛素水平增加，胰岛素敏感性增加且对饮食诱导的肥胖症有抵抗性(Conarello，S.L.，et al.，Mice lackig dipeptidyl peptidase IVare protected against obesity and insulin resistance.Proc Natl Acad Sci USA，2003.100(11)：6825-30)。有证据表明胃排空的抑制，高血糖素分泌的下降，外周胰岛素敏化，以及肠降血糖素和其他DPP-IV敏感肽类在对β-细胞分化，有丝分裂和存活的重要作用，可以潜在地保护β-细胞，以及改善胰岛素分泌功能和葡萄糖处理(Deacon，C.F.，B.Ahren，and J.J.Holst，Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV：a novel approach for the prevention and treatment of Type 2diabetes？Expert Opin Investig Drugs，2004.13(9)：1091-102)。

DPP-IV是一个广泛表达的酶，存在于多种哺乳动物器官和组织如肝细胞、肾小管、内皮、肌成纤维细胞等等中(Rasmussen，H.B.，et al.，Crystal structure of human dipeptidyl peptidaseIV/CD26 in complex with a substrate analog.Nat Struct Biol，2003.10(1)：19-25)。DPP-IV通常以二聚体形式存在，包含有2个结构区：一个α/β水解区和一个有8个β螺旋刀片状平行的β螺旋区。DPP-IV包括766个氨基酸残基，其中前面6个残基是胞浆区，残基7-28组成了跨膜区。α/β水解区，位于靠近膜的位置，由残基39-51和506-766组成。催化三联体(Ser630-Asp708-His740)位于α/β水解区和β螺旋区形成的一个大的口袋中(Abbott，C.A.，G.W.McCaughan，and M.D.Gorrell，Two highly conserved glutamic acid residues in the predicted betapropeller domain of dipeptidyl peptidase IV are required for its enzyme activity.FEBS Lett，1999.458(3)：278-84)。DPP-IV的抑制剂就是通过在活性位置与DPP-IV的良好作用，从而竞争性/非竞争性的阻断了DPP-IV对多肽底物如肠降血糖素等的降解，继而使得血糖浓度得以降低，并且不会带来低血糖的风险。

因此，可以研发新的DPP-IV抑制剂，从而抑制DPP-IV，进而治疗II型糖尿病和它引起的肥胖症等并发症，为广大糖尿病患者带来福音。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种二肽基肽酶IV新抑制剂、其筛选方法及用途，该二肽基肽酶IV新抑制剂结构新颖，能有效抑制二肽基肽酶IV，从而可以作为药物先导化合物，用于制备糖尿病治疗药物，为广大糖尿病患者带来福音。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种二肽基肽酶IV新抑制剂，其特点是，所述二肽基肽酶IV新抑制剂是N′-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-4，5，6，7-四氢化-1H-吲唑-3-酰肼(N′-[(2-hydroxy-1-naphthyl)methylene]-4，5，6，7-tetrahydro-1H-indazole-3-carbohydrazide)，其结构式如下：

上述化合物的发现，源于一种计算机模拟药物设计的技术来缩短发现的时间和流程。这项技术叫做虚拟筛选(Virtual Screening)。虚拟筛选所用的化合物库，包括本发明中的化合物都来源于SPECS数据库(http://www.specs.net/)。包括步骤：

第一轮筛选：将SPECS库中的化合物分子用薛定谔公司的Glide5.0对接软件进行对接筛选，从已知的复合物的晶体结构出发，选择结合模式与复合物晶体结构中结合模式类似的能量打分好的分子；

第二轮筛选：利用改良Lipinski法对第一轮筛选所得分子进行分子类药性的评价；

第三轮筛选：采用Autodock4.0分子对接程序和第一轮的模型对第二轮筛选出的化合物进行自由能打分，再结合它在第一轮的能量打分进行筛选。

以上第三轮筛选得到的化合物再通过体外分子水平的生物活性测试加以确证。

因此，在本发明的第二方面，提供了一种上述的二肽基肽酶IV新抑制剂的筛选方法，其特点是，包括以下步骤：

(1)第一轮筛选：用Glide5.0对SPECS化合物库进行筛选，并且以已知活性的DPP-IV抑制剂小分子作为阳性化合物对照，获得能量打分优于阳性化合物的分子；

(2)第二轮筛选：利用改良Lipinski法对步骤(1)所得分子进行分子类药性评价；

(3)第三轮筛选：采用Autodock4.0对步骤(2)所得分子进行对接筛选，得到基于结合自由能的打分，并结合步骤(1)中打分情况筛选出打分高，作用模式好的化合物。

较佳地，还包括步骤：(4)对步骤(3)筛选出的化合物进行分子水平DPP-IV抑制活性测试。

在本发明的第三方面，提供了上述的二肽基肽酶IV新抑制剂在制备治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。

较佳地，所述糖尿病是II型糖尿病。

较佳地，所述并发症是肥胖病。

本发明的有益效果在于：本发明的二肽基肽酶IV新抑制剂结构新颖，能有效抑制二肽基肽酶IV，从而可以作为药物先导化合物，用于制备糖尿病治疗药物，尤其是II型糖尿病和它引起的肥胖症等并发症治疗药物，为广大糖尿病患者带来福音。

附图说明

图1是显示具有DPP-IV抑制作用的小分子筛选的流程示意图。

图2是显示本发明的二肽基肽酶IV新抑制剂浓度及其对应的DPP-IV抑制率的S型曲线示意图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

1.针对DPP-IV复合物的虚拟筛选：

请参见图1所示，以50个已知活性的DPP-IV抑制剂小分子作为阳性化合物对照，对SPECS化合物库的197116个化合物分子进行了筛选，最终得到了本发明的上述化合物，具体步骤如下：

首先从PDB库(Protein Data Bank)中提取了PDB库号(PDB code)为2P8S的DPP-IV-小分子抑制剂复合物晶体结构(Biftu，T.，et al.，Rational design of a novel，potent，and orallybioavailable cyclohexylamine DPP-4 inhibitor by application of molecular modeling and X-raycrystallography of sitagliptin.Bioorg Med Chem Lett，2007.17(12)：3384-7)作为筛选的模型，并从文献中选取了50个已知有抑制活性的化合物小分子(Biftu，T.，et al.，Rational design of anovel，potent，and orally bioavailable cyclohexylamine DPP-4 inhibitor by application of molecularmodeling and X-ray crystallography of sitagliptin.Bioorg Med Chem Lett，2007.17(12)：3384-7；Biftu，T.，et al.，(3R)-4-[(3R)-3-Amino-4-(2，4，5-trifluorophenyl)butanoyl]-3-(22，2-trifluoroethyl)-1，4-diazepan-2-one，a selective dipeptidyl peptidase IV inhibitor for the treatment of type 2 diabetes.Bioorg Med Chem Lett，2007.17(1)：49-52；Chen，P.，et al.，Imidazopiperidine amides as dipeptidylpeptidase IV inhibitors for the treatment of diabetes.Bioorg Med Chem Lett，2007.17(21)：5853-7；Kaelin，D.E.，et al.，4-arylcyclohexylalanine analogs as potent，selective，and orally activeinhibitors of dipeptidyl peptidase IV.Bioorg Med Chem Lett，2007.17(21)：5806-11；Kim，D.，et al.，(2R)-4-oxo-4-[3-(trifluoromethyl)-5，6-dihydro[1，2，4]triazolo[43-a]pyrazin-7(8H)-yl]-1-(2，4，5-trifluorophenyl)butan-2-amine：a potent，orally active dipeptidyl peptidase IV inhibitor for thetreatment of type 2 diabetes.J Med Chem，2005.48(1)：141-51)进行阳性对照，对197116个小分子的SPECS化合物库进行了虚拟筛选。

首先采用了薛定谔公司的Glide5.0对接软件对SPECS库进行了第一轮筛选。本发明者从2P8S的复合物结构出发，根据文献报道确定了以Glu205、Glu206、Ser209、Phe357、Arg358、Tyr547、Tyr662、Tyr666等氨基酸残基为中心，

半径作为口袋。对口袋部位进行grid计算，计算口袋内静电作用和范德华作用能的网格文件。本发明者用产生的网格文件对197116个SPECS库的小分子和50个阳性分子组成的化合物库进行分子对接。对接的结果按照结合能量的高低进行排名，取能量排名优于阳性分子的SPECS库小分子进入下一轮筛选，共得到7216个分子进入第二轮筛选。

第二轮筛选主要是进行分子类药性的评价。这个方法是在Lipinski五规则的基础上发展起来的，综合考虑了分子量、柔性键、氢键供体、氢键受体等方面。通过这轮筛选之后，有4522个小分子进入了下一轮筛选。

用于第三轮分子对接的程序主要是Autodock4.0。Glide5.0是一种比较刚性的对接软件，在它的对接中，受体是刚性的，而配体小分子的柔性也只是通过产生手性或者异构体构象等进行考虑。而Autodock4.0由于能较好的考虑受体和配体的柔性，因此两者并用可以更好的考察小分子与受体分子的作用。最终，通过对在Autodock对接中表现较好的小分子，结合它在Glide对接中的打分情况以及在两种对接中与受体分子作用模式的表现，挑选出了99个化合物。其中就包括本发明的二肽基肽酶IV新抑制剂。

2.本化合物购自荷兰SPECS公司(www.specs.net，Address：Specs，Kluyverweg 6，2629 HT Delft，The Netherlands)，其在SPECS库中的编号为AG-690/09390053，产品量10.2mg，条形码编号(Barcode：2068980007101)。

3.本发明的二肽基肽酶IV新抑制的生物活性测试--可溶性的人DPP-IV的外源表达和纯化与抑制剂的筛选

阳性化合物P32/98购于Biomol；博来霉素购于Invitrogen；DPP-IV底物甘氨酸-脯氨酸-7-酰氨基-4甲基香豆素购于sigma；毕赤酵母培养用培养基成分均购于Sigma，包括(yeast extract、peptone、methanol、D-(+)-glucose)；限制性内切酶SacI来自NEB；缓冲液各成分(NaCl)等均购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；白色96孔荧光板购自Corning公司；30KD浓缩管来自millpore；spectrophotometer购自eppendorf公司；synergy 2酶标仪来自biotek公司；毕赤酵母菌株GS115为实验室保存；DPP-IV表达载体pPICZα-sDPP-IV由Michael Hennig教授惠赠(F.Hoffmann-La Roche AG Pharma Research Discovery，Switzerland)。

3.1实验材料

3.1.1溶液

S buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.8)、100mM NaCl

Assay buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.5)

3.1.2实验仪器

Spectrophotometer购自eppendorf公司，synergy 2酶标仪来自biotek公司；

3.2实验方法

3.2.1构建表达菌株

首先将质粒pPICZα-sDPP-IV用限制性内切酶SacI切割，使质粒线性化。按照Invitrogen公司的毕赤酵母质粒转入的方法进行转入，在平板上鉴定正确的克隆。

3.2.2DPP-IV的外源表达

将正确转入质粒的单克隆挑出共八个，先分别进行小量表达，通过直接测活的方法(测活方法见下文)来筛选活性较高的单克隆。将挑选出来的活性较高的克隆进行大量表达。

3.2.3DPP-IV的纯化

收集毕赤酵母上清，将一升的毕赤酵母培养液的上清先用30KD浓缩管进行过滤和浓缩，将上清浓缩至18ml时使用S-200柱进行进一步纯化。

3.2.4DPP-IV测活和抑制剂的筛选

DPP-IV的抑制剂活性筛选是通过重组的人的DPP-IV来完成的。实验中是以重组的人的DPP-IV作为酶源。DPP-IV从Asn31-Pro766共736个氨基酸残基。

酶活测试原理：在活性测试中，使用Gly-Pro-7-酰氨基-4甲基香豆素作为底物，DPP-IV能将荧光底物中的7-酰氨基-4甲香豆素7-amino-4-methylcoumarin(AMC)从多肽底物的C端分解，反应在30分钟内符合一级反应动力学，在460nm荧光线性增强。酶活越好，460nm荧光越强。

所有实验均设置复孔。

按照以下实验步骤进行操作：

①将纯化好的酶，放在冰上待用。

②将抑制剂P32/98(作为阳性对照)用DMSO溶解并用测活缓冲液稀释，终浓度为0.1mM。

③对于荧光测试，将底物Gly-Pro-AMC用DMSO溶解并用测活缓冲液稀释，终浓度为0.01mM，激发(Ex)：380nm、发射(Em)：460nm。

④将DPP-IV用缓冲液以合适的倍数稀释，使终活性为17μU/μl。

⑤按下表所示加入各组分(96孔板)，最后加入底物。其中化合物即本发明的二肽基肽酶IV新抑制的初筛浓度为10μM。

样品	测活缓冲液	DPP-IV(17.3μU/μl)	抑制剂	底物
					空白组	50μl	0μl	0μl	50μl
对照组	35μl	15μl	0μl	50μl
					阳性组	25μl	15μl	10μl	50μl
化合物组	34.8μl	15μl	0.2μl	50μl

⑥在室温下孵育10分钟，然后每孔加入50μl稀释好的底物。使用biotek公司的synergy 2酶标仪在(Ex)：380nm/(Em)：460nm处检测酶活。每一分钟测量一次荧光，共检测30分钟。

⑦通过最佳拟合线性回归得到反应斜率。通过直接比较斜率来得到抑制率：

抑制率％＝[S(对照)-S(化合物)]/S(对照)*100％；(其中S代表斜率)。

实验中以DMSO为空白组，本实验中最终的DMSO不超过1％，在该浓度下导致的酶失活＜3％.通过对不少于7不同化合物浓度的测定得到测试化合物的半数抑制浓度IC₅₀。根据在化合物反应体系中的浓度及其对应的DPP-IV抑制率作S型曲线图2，据图2求得其IC50值(使用数据处理软件Origin 6.1)。

结果表明，化合物即本发明的二肽基肽酶IV新抑制对DPP-IV的活性有显著的抑制作用，其IC₅₀值为：5.77μM。其可作为药物先导化合物，用于制备糖尿病治疗药物，特别是治疗II型糖尿病及其并发症的药物。

综上，本发明的二肽基肽酶IV新抑制剂结构新颖，能有效抑制二肽基肽酶IV，从而可以作为药物先导化合物，用于制备糖尿病治疗药物，为广大糖尿病患者带来福音。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.具有如下结构式的化合物在制备二肽基肽酶IV抑制剂中的应用：

2.具有如下结构式的化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖尿病是II型糖尿病。