CN101990900A - 纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，具体包括纳米还原石墨烯氧化物悬液或纳米还原石墨烯氧化物膜作为抗菌材料的应用。所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液的制备包括石墨的预氧化、预氧化产物的分离、再氧化、氧化产物的纯化、氧化产物的还原。所述的纳米还原石墨烯氧化物膜是利用0.22μm的PVDF膜抽滤所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液制得。利用本发明的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，可将纳米还原石墨烯氧化物作为添加剂制成具有抗菌性能的产品或制成抗菌涂层材料，应用于医用及日常生活中。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌材料，具体的说，涉及纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用。
背景技术
随着微生物学科的发展，人们对微生物的研究和认识水平不断提高，在充分利用有益微生物的同时也对病原微生物十分的警惕，如何防范病原微生物对人体的侵害成为迫切需要解决的问题。但是，在防治病原微生物的过程中，由于大量使用抗生素，出现了很多问题。其中最突出的一个是病原微生物耐药株的大量出现；同时抗生素的大量使用也造成了严重的环境污染，这些都对人类健康及生活质量造成了危害。如何解决这些问题，人们正在研究和寻求各种方法和途径，其中，抗菌材料的研制和开发已受到重视，人们也研制开发出了一系列的抗菌材料。
目前的抗菌材料可以分为有机抗菌材料、无机抗菌材料和天然生物抗菌材料。各类抗菌材料都有各自的优缺点。无机抗菌材料具有较长的生命周期，但是毒性低、需用量大；有机抗菌材料抗菌性较弱，耐热性、稳定性较差，自身分解产物和挥发物可能对人体有害，易产生耐药性，易造成二次污染且不适合用于高温加工，一般只能用来进行一次性消毒或灭菌；然而天然生物抗菌材料的毒性和对环境污染小，但是受到安全性和加工条件的制约，目前不能大规模市场化生产。
随着纳米技术的发展，各种纳米抗菌材料层出不穷。早期的纳米抗菌材料主要是通过一定的方法和技术将抗菌剂制备成纳米级的材料，再与抗菌载体复合，从而形成具有抗菌功能的纳米材料，如纳米载银系抗菌材料，纳米金属氧化物抗菌材料(如MgO，CuO)。最近，研究发现其它一些纳米材料也具有较强的抗菌功能，比如TiO2光触媒系抗菌材料，碳纳米管及功能化碳纳米管，C60及其衍生物。但是，这些纳米抗菌材料自身的毒性也引起了广大研究者的关注，研究表明大部分纳米抗菌材料对哺乳动物细胞具有较强的毒性作用。
石墨烯氧化物是石墨烯的氧化产物，在其二维的碳骨架片层上镶嵌了含氧功能基团，如羟基、羧基、环氧基，这些含氧基团的存在赋予了石墨烯氧化物水溶性特征，因此，它可以方便地被制备成膜，甚至参杂其它材料制备成复合材料。
发明内容
本发明的目的是提供纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，以开发新型无毒的纳米抗菌材料。
本发明的技术方案如下：
纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，所述的纳米还原石墨烯氧化物是纳米还原石墨烯氧化物悬液或纳米还原石墨烯氧化物膜。
所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液的制备包括石墨的预氧化、预氧化产物的分离、再氧化、氧化产物的纯化、氧化产物的还原。所述的石墨的预氧化是将石墨粉末分散于含K2S2O4和P2O5的浓H2SO4中得到预氧化产物，所述的再氧化是将所述的预氧化产物分散于含KMnO4的浓H2SO4中得到氧化产物。所述的氧化产物的还原是在所述氧化产物中加入水合肼。
所述的纳米还原石墨烯氧化物膜的制备是通过过滤所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液，例如利用0.22μm的PVDF膜抽滤所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液制得。
本发明的纳米还原石墨烯氧化物具有良好的抗菌性能，其中的纳米还原石墨烯氧化物悬液对大肠杆菌的抑制率超过90％；涂布定植在纳米还原石墨烯氧化物膜上的大肠杆菌也大部分被抑制。利用本发明的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，可将纳米还原石墨烯氧化物作为添加剂制成具有抗菌性能的产品或制成抗菌涂层材料，应用于医用及日常生活中。
附图说明
图1是根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物的原子力显微镜图。
图2是根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液对大肠杆菌的抑制效率图。
图3是根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜的照片。
图4是根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜的表面的扫描电子显微镜图。
图5是根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜的横断面的扫描电子显微镜图。
图6是大肠杆菌在根据本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜上生长的情况。
具体实施方式
本发明将纳米还原石墨烯氧化物用作为抗菌材料，其中纳米还原石墨烯氧化物的形态包括是纳米还原石墨烯氧化物悬液或纳米还原石墨烯氧化物膜。
首先，制备纳米还原石墨烯氧化悬液，具体包括如下步骤：
(1)预氧化：将石墨粉末分散于含K2S2O4和P2O5的浓H2SO4(质量分数98％)中，75℃水浴3-5小时；将上述混合物冷却至室温，用三蒸水稀释后，用0.22μm滤膜抽滤，抽滤的沉淀50-60℃真空干燥过夜得到预氧化产物；
(2)再氧化：取一定量的上述预氧化产物分散于含KMnO4的浓H2SO4中，冰浴搅拌一定时间后，再加入NaNO3，水浴中搅拌后加入三蒸水，最后加入稀H2O2溶液终止氧化反应；氧化产物经稀HCl漂洗后抽滤得到悬液；将上述悬液超声1-3h；超声分散后的悬液通过离心除去未分散开的石墨烯氧化物；
(3)还原：在悬液中加入水合肼，75-85℃油浴23-26h；未反应的水合肼通过透析除去，上清液即为本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液。
根据本发明制备得到的纳米还原石墨烯氧化物悬液的抗菌性能测试采用革兰氏阴性菌，Eschrrichia coli DH5α(E.coli DH5α)，具体步骤包括：
(1)悬浮培养大肠杆菌，过夜后，离心收集大肠杆菌，用经灭菌的盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)重悬，然后稀释10倍后，测OD600，确定大肠杆菌的数量，然后将细菌的浓度调成108/mL；
(2)取一定体积的上述菌液分散于纳米还原石墨烯氧化物悬液中，然后加入NaCl溶液，使混合体系中NaCl的质量分数维持在0.8％-0.9％，混匀后放在37℃的恒温摇床上孵育2h-3h；
取相同体积的上述菌液直接放在37℃的恒温摇床上孵育2h-3h做为空白对照；
(3)将孵育前、孵育后的细菌悬液分别梯度稀释10、102、103、104、105、106倍，然后各取一定体积的悬液涂布在LB平板上，然后置于37℃过夜培养；
(4)分别统计每个平板上的菌落数量，然后计算孵育前后大肠杆菌的数量，并计算抑菌率。
按照本发明的另一个方面，一种纳米还原石墨烯氧化物膜的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)抽滤：将一定体积的制备好的纳米还原石墨烯氧化物悬液用0.22μm的PVDF膜抽滤。
(2)干燥：将上述覆盖了纳米还原石墨烯氧化物的PVDF膜室温真空干燥过夜；
(3)成膜：用尖镊子将纳米还原石墨烯氧化物膜从PVDF膜上剥离下来得到本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜。
根据本发明制备得到的纳米还原石墨烯氧化物膜的抗菌性能测试采用革兰氏阴性菌，Eschrrichia coli DH5α(E.coli DH5α)，具体步骤包括：
(1)悬浮培养大肠杆菌，过夜后，离心收集大肠杆菌，用经灭菌的盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)重悬，然后稀释10倍后，测OD600，确定大肠杆菌的数量，然后将细菌的浓度调成106-107/mL；
(2)将膜放在经灭菌的剥离培养皿中，然后把上述菌液用喷壶制成雾状滴落在膜及培养皿里，然后盖上盖子，37℃放置3-5min，使液滴干燥；
(3)将冷却至40℃左右的LB培养基(含1.5％琼脂)在培养皿和膜上铺一层，待培养基凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中过夜孵育，然后检查菌落生长情况。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
以下实施例中的化学试剂除特殊注明外，均购于国药集团化学试剂有限公司，AR(沪试)。
实施例1纳米还原石墨烯氧化物悬液的制备
称取4g石墨粉末，分散于24ml的浓H2SO4中，然后加入8g K2S2O4和8g的P2O5，75℃水浴搅拌4小时；将上述混合物冷却至室温，用三蒸水(Milli-Q@Synthesis A10TM，Millipore)稀释到300mL，然后用0.22μm PVDF滤膜(0.22微米，直径50mm，100张/盒，上海捷瑞生物工程有限公司)抽滤，抽滤的沉淀60℃真空(DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司)干燥过夜得到预氧化产物。
称取12gKMnO4，分散于92mL的冰浓H2SO4中，然后加入2g上述预氧化产物，冰浴搅拌15min，再加入2g NaNO3搅拌2h后，加入三蒸水200mL，最后加入560mL的稀H2O2溶液(含10mL30％的H2O2溶液)终止氧化反应；上述氧化产物用体积比1∶10的稀HCl漂洗，然后抽滤得到悬液；将上述悬液在300W(SK5200H，KUDOS)下超声1.5h；超声分散后的悬液3000rpm离心5min(Eppendorf Centrifuge5418，Eppendorf China Limited)，除去未分散开的石墨烯氧化物，上清即为制备好的纳米石墨烯氧化物悬液。
取100ml上述纳米石墨烯氧化物悬液，加入1mL水合肼(50wt％)，80℃油浴(DF-101S集热式恒温热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司)24h后，再透析除去未反应的水合肼，得到本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液。
其中，本实施例中的纳米还原石墨烯氧化物悬液的浓度为850μg/mL。通过离心浓缩或者稀释可以进一步调节制备的纳米石墨烯氧化物悬液浓度。
本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液通过原子力显微镜(
IIIa，Digital Instrument)观察，其纳米还原石墨烯氧化物的表面微观形貌如图1所示。纳米还原石墨烯氧化物片层一般指通过化学手段(如高温，化学还原)将纳米石墨烯氧化物片层上镶嵌的含氧功能基团(环氧基，羟基、羧基)除去后的产物。其片层上含氧量低于纳米石墨烯氧化物片层，同时通过过程，也可以修复纳米石墨烯氧化物片层上的一些缺陷，并恢复一定的导电性能。因此纳米还原石墨烯氧化物片层也是由单层的碳原子组成，并含有极少量的氧功能基团(环氧基，羟基、羧基)。经原子力显微镜观察可知，本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液中的纳米还原石墨烯氧化物片层厚度约为1.0nm，证实它确实是由单层的碳原子构成。同时纳米还原石墨烯氧化物片层尺寸分布范围较大，从几百纳米到几十纳米。根据实验结果一般大小在100nm～1μm范围内的纳米还原石墨烯氧化物片层具有良好的抗菌效果。
实施例2纳米还原石墨烯氧化物悬液的抗菌测试
悬浮培养大肠杆菌(DH5α甘油菌，碧云天生物技术研究所)，过夜后，12000rpm离心1min收集大肠杆菌，用经灭菌的盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)重悬，然后稀释10倍后，测OD600，确定大肠杆菌的数量，然后将细菌的浓度调成108/mL；
取100μL上述菌液分散于850μL还原石墨烯氧化物悬液中，然后加入50μL 18％的NaCl溶液，使混合体系中NaCl的质量分数维持在0.9％，混匀后放在37℃恒温摇床上(200rpm)孵育2h；
取100μL上述菌液直接放在37℃的恒温摇床(THZ-C恒温振荡器，江苏太仓市试验设备厂)上孵育2h-3h做为空白对照；
将孵育前、孵育后的细菌悬液分别梯度稀释10、102、103、104、105、106倍，然后各取100μL涂布在LB平板上，然后置于37℃过夜培养；分别统计每个平板上的菌落数(以平板上菌落数量在30-300个的平板数据做计算)，然后计算孵育前后大肠杆菌的数量。
其结果如图2所示，左边的柱状图表示用无菌的蒸馏水做对照所产生的细菌增殖率。孵育2h后，对照组细菌存活率为110.71％、129.38％、121.87％。右边的柱状图表示终浓度为85μg/mL的纳米还原石墨烯氧化物悬液中细菌的抑菌率，该浓度下的纳米还原石墨烯氧化物在37度与细菌作用2h后，细菌的存活率是15.89％、2.37％、8.69％。根据抑菌率的计算公式：抑菌率(％)＝1-存活率，可以算出对照组和实验组的各自的抑菌率。
由此可知，将3次数据平均后得到本发明的纳米还原石墨烯氧化物悬液的抑菌率为91.01±6.76％，而对照组的细菌增殖20.65±9.39％。
实施例3纳米还原石墨烯氧化物膜的制备
将一定体积的制备好的纳米还原石墨烯氧化物悬液用0.22μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜抽滤，将水全部滤掉。将抽滤得到的覆盖了纳米还原石墨烯氧化物的PVDF膜室温真空(DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司)干燥过夜；用弯头尖镊子将纳米还原石墨烯氧化物从PVDF膜上剥离下来得到本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜。
本发明的纳米还原石墨烯氧化物膜的外观形态如图3所示；通过扫描电子显微镜观察(Hitachi S-2400，Hitachi)，其纳米还原石墨烯氧化物膜的表面和横截面的微观形貌如图4和图5所示。经扫描电子显微镜观察可知，本发明制备的纳米还原石墨烯氧化物膜表面比较平滑。横断面扫描发现这个膜是由多层的纳米还原石墨烯氧化物堆积构成，因此可以通过调节纳米石墨烯氧化物片层的量可以调整膜的厚度，本实施例中膜的厚度约为4.6μm。图中的1μm表示测量比例尺度。实施例4纳米还原石墨烯氧化物膜抗菌测试
悬浮培养大肠杆菌，过夜后，12000rpm离心1min，收集大肠杆菌，用经灭菌的盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)重悬，然后稀释10倍后，测OD600，确定大肠杆菌的数量，然后将细菌的浓度调成107/mL；将纳米还原石墨烯氧化物膜放在经灭菌的100mm剥离培养皿中，然后把上述菌液用喷壶制成雾状滴落在膜及培养皿里，然后盖上盖子，37℃放5min；将冷却至40℃左右的LB培养基(含1.5％琼脂)在培养皿和膜上铺一层，待培养基凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中过夜孵育，然后检查菌落生长情况。
其结果如图6所示，左边透明部分是直径是10cm的玻璃培养皿的一部分，上面有大量的大肠杆菌菌落生长；黑色不透明部分的是纳米还原石墨烯氧化物膜，定殖在纳米还原石墨烯氧化物膜上的大肠杆菌大部分都被杀死了，仅有少部分菌落形成。由此发现定殖在纳米还原石墨烯氧化物膜上的大肠杆菌大部分被抑制。
其中值得注意的是，本发明提供的纳米还原石墨烯氧化物悬液和纳米还原石墨烯氧化物膜的制备方法在此仅作为示例而非限制。本发明提供的纳米还原石墨烯氧化物悬液和纳米还原石墨烯氧化物膜的抗菌测试方法在此仅作为示例而非限制，其他等效的方法，例如抗菌塑料的抗菌性能测试(国标)同样适用于本发明。
以上所述的，是根据本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的技术内容为本领域技术人员的公知常识。
Claims (11)
1.纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用。
2.如权利要求1所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物是纳米还原石墨烯氧化物悬液或纳米还原石墨烯氧化物膜。
3.如权利要求2所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液的制备包括：
石墨的预氧化得到预氧化产物；
将所述预氧化产物再氧化得到氧化产物；以及氧化产物的还原。
4.如权利要求3所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的石墨的预氧化是将石墨粉末分散于含K2S2O4和P2O5的浓H2SO4中得到预氧化产物。
5.如权利要求3所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的再氧化是将所述的预氧化产物分散于含KMnO4的浓H2SO4中得到氧化产物。
6.如权利要求3所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的氧化产物的还原是在所述氧化产物中加入水合肼。
7.如权利要求2所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物膜的制备是通过过滤所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液。
8.如权利要求2所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物膜的制备是利用0.22μm的PVDF膜抽滤所述的纳米还原石墨烯氧化物悬液。
9.如权利要求1所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物是由单层碳原子组成的纳米还原石墨烯氧化物片层。
10.如权利要求9所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物片层的大小在100nm～1μm之间。
11.如权利要求9所述的纳米还原石墨烯氧化物作为抗菌材料的应用，其特征在于，所述的纳米还原石墨烯氧化物片层的厚度约为1nm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110330 |