CN101988067B

CN101988067B - 一种朊蛋白异构体单克隆抗体基因及其应用

Info

Publication number: CN101988067B
Application number: CN2010102642461A
Authority: CN
Inventors: 洪涛; 赵丽; 张莹
Original assignee: Beijing Jiaotong University
Current assignee: Beijing Jiaotong University
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2010-08-26
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2030-08-26
Also published as: CN101988067A

Abstract

一种朊蛋白异构体单克隆抗体基因及其应用，以及该基因制备的单克隆抗体。本发明从培养的朊蛋白异构体特异的单抗APR3杂交瘤细胞中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得基因可以正确编码小鼠抗体可变区。本发明还涉及所述单克隆抗体在朊蛋白异构体的定性及定量检测，以及制备朊病毒病的诊断试剂和治疗药物方面的用途。本发明提供的单克隆抗体可特异性识别脑组织的朊蛋白异构体，在应用于朊病毒病的预防和早期治疗时，具有较强的靶向性。

Description

一种朊蛋白异构体单克隆抗体基因及其应用

技术领域：

本发明涉及一种特异性识别和结合朊蛋白异构体的单克隆抗体基因，以及该基因制备的单克隆抗体。

本发明还涉及所述单克隆抗体在朊蛋白异构体的定性及定量检测，以及制备朊病毒病的诊断试剂和治疗药物方面的用途。

背景技术：

朊蛋白异构体(PrPSc)是引起朊病毒病(prion disease)病理改变和可传播性的主要原因。朊蛋白异构体PrPSc也是朊病毒病的标志物，是最重要的朊病毒病感染性因子，对神经元的毒性最强。

针对朊蛋白异构体PrPSc分子的免疫疗法来治疗或预防朊病毒病，是治疗的一个重要途径。现有技术的方法目前还不能特异性识别朊蛋白异构体，因此免疫效果不理想。

因此需要有特异性识别和结合朊蛋白异构体，而不识别正常朊蛋白的单克隆抗体。

发现对朊蛋白异构体具有特异性的单克隆抗体基因，是研制朊蛋白异构体的单克隆抗体的关键。

发明内容：

本发明的目的是发现特异性识别和结合朊蛋白异构体(PRPSC)的单克隆抗体基因，并以此制备特异性针对朊蛋白异构体的单克隆抗体。

本发明的另一目的是将所制备的朊蛋白异构体单克隆抗体用于朊蛋白异构体的定性及定量检测，可用于制备朊病毒病的诊断试剂和治疗药物。

本发明应用5’RACE技术通过基因特异引物和锚定引物成功的从培养的抗朊蛋白异构体杂交瘤细胞APR3中克隆了抗体轻链、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可以正确编码小鼠抗体可变区。基于上述已经克隆到的APR3抗体轻链、重链可变区基因，采用基因重组的方法，构建和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体，以用于朊病毒病的诊断和治疗目的。

制备上述单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为APR3。已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201077。中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉武汉大学。

本发明内容详述如下：

本发明制备了抗朊蛋白异构体单克隆抗体，取名为APR3。由北京交通大学生命科学与生物工程研究院建立和保存。本发明人发现了抗朊蛋白异构体的单克隆抗体APR3重链和轻链可变区基因，重组后可表达出特异性识别和结合朊蛋白异构体的抗体活性片段。

单抗APR3可以特异性识别脑组织的朊蛋白异构体PrPSc。APR3对PRPSc的结合能力高于其宿主蛋白PrP。其亚类为IgG₁。用于ELISA、蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1∶10⁴、1∶2,000。

本发明人使用5’RACE的方法克隆到抗朊蛋白异构体单抗APR3轻链、重链可变区基因。根据抗体恒定区CH-1区的最保守的一段序列设计引物，进行反转录，在cDNA产物的5’端加上Poly(C)尾巴，然后使用针对多聚脱氧核苷酸尾巴设计的锚定引物与基因特异性引物通过PCR方法将目的基因扩增出来。序列分析表明，APR3抗体轻链和重链可变区序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达90％与91％。可以确定所得到的序列为抗体轻链和重链可变区序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。

APR3重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性抗朊蛋白异构体单抗的杂交瘤细胞株中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为450bp，所述的轻链可变区基因全长为429bp，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合朊蛋白异构体的抗体活性片段。

所述抗朊蛋白异构体单克隆抗体APR3的重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：4所示。其中：

SEQ ID NO：1是抗朊蛋白异构体单克隆抗体重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是抗朊蛋白异构体隆抗体重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是抗朊蛋白异构体单克隆抗体轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是抗朊蛋白异构体单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。

抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因的克隆。

分泌产生上述抗朊蛋白异构体单克隆抗体的细胞株为采用传统的骨髓瘤与脾细胞融合的方法获得的一株鼠源性抗朊蛋白异构体单抗杂交瘤细胞株，命名为APR3，其抗原为朊蛋白多肽片段，其分泌的抗体分子亚型为IgG1。

本发明在制备抗朊蛋白异构体单克隆抗体及其性质和功能鉴定中进行了如下实验：

1、抗体制备及性质的鉴定

抗体的制备(见实施例1)。其亚类为IgG₁，抗原识别表位在PRP多肽99-126位氨基酸。

朊蛋白异构体是最主要的朊病毒病致病因子，对神经元的毒性最强。目前，关于诊断和治疗用途的针对朊蛋白异构体单抗，目前尚未见报道。

2、免疫组化实验

单抗APR3可以特异性识别朊病毒感染的脑组织中朊蛋白异构体。结果显示：染色清晰，定位准确，基本没有背景干扰。在进行免疫组化过程中，无须抗原修复(见实施例2)。

3、免疫印迹(Western blot)实验

结果表明：APR3可以很好识别以SDS-PAGE分离，转移在硝酸纤维素膜的朊蛋白，(见实施例3)。

用于蛋白质免疫印迹的最佳稀释度为1∶2,000。

4、单抗APR3可变区基因的克隆

利用5’RACE的方法扩增抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因(见实施例4)。

用本发明获得的抗PrP单克隆抗体，利用双抗体夹心ELISA法(酶联免疫吸附试验)、Western blot实验、免疫组化等实验方法，可以分别制备三种不同方法的检测朊病毒病的试剂。

基于上述已克隆到的抗PRP单抗APR3轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和/或表达多种小分子基因工程抗体的载体、细胞株和抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于朊病毒病诊断、预防和治疗的基础与临床研究和应用。因此，所述抗PRP单克隆抗体还可以制备成为药物，用于诊断、预防和治疗朊病毒病。

本发明的优点：

首先，本发明提供的抗朊蛋白异构体的单克隆抗体特异性识别脑组织的PrPSc，而不识别PrPc，具有朊病毒病鉴别诊断的前景。

其次，这种特异性识别应用于朊病毒病的预防和早期治疗中，具有较强的靶向性。单抗APR3对患病脑组织的识别很强，对正常脑组织却不识别。

实施例2以及图1～图4均可以体现出单抗APR3对朊病毒病脑组织中PrPSc具有特异识别的能力，而不识别正常脑组织的PrPc。这一特点决定了单抗APR3具有鉴别诊断的作用；如果将其用于预防和治疗，将会有较好的效果。

附图说明：

图1～图5是单抗APR3性质和应用的验证图，其中：

图1为单抗APR3对正常脑组织的识别，反应很弱，几乎为阴性。

图2为单抗APR3对患病脑组织的识别，反应很强。

图3为商品化单抗F89对正常脑组织的识别，反应较强。

图4为商品化单抗F89对患病脑组织的识别，反应较强。

图5为单抗APR3对PrP蛋白的识别。图中，3F4是商品化单抗3F4，作为阳性对照，35kD、25kD表示蛋白分子量。

生物材料保藏信息：

培养物名称：杂交瘤细胞株APR3

保藏编号：CCTCC C201077

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏时间：2010年7月16日

具体实施方式：

实施例1抗朊蛋白异构体单克隆抗体APR3的制备

1.免疫原的制备

免疫原PrP多肽片段由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并且在N端偶联匙孔血蓝蛋白。

2.小鼠的免疫接种

取6-8周龄雌性BALB/c小鼠5只。分别用PrP多肽片段共进行4次免疫：首次按100μg/只剂量将Aβ寡聚混合物与等体积福氏完全佐剂(Sigma)混匀后，腹腔注射。间隔2周后重复注射，使用福氏不完全佐剂(Sigma)，偶联多肽剂量为50μg/只。间隔2周后重复一次；再间隔两周，用纯抗原50μg进行脾内加强免疫，3-4d后取脾融合。

3.饲养细胞的制备取6-8周龄BALB/c小鼠，引颈处死，无菌条件下RPMI 1640培养液(Sigma)冲洗腹腔数次，将冲洗液2000rpm，离心10min。弃上清，用含20％小牛血清的RPMI 1640培养液悬浮沉淀，细胞计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml，加入96孔板中，100μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育。

4.细胞融合取强化免疫3-4d的小鼠，眼球放血后，收集血清，拉颈处死，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液后，按10∶1的比例将脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞(经8-氮鸟嘌呤，即8-Azaguanine，简称8-AG筛选)混合，1000rpm离心10min，弃上清，轻弹管底使沉淀细胞呈糊状，37℃水浴中加入0.7ml 50％PEG 4000(polyethylene glycol，Sigma)，边加边旋转离心管，使细胞保持混匀状态，1min加完，37℃水浴中静置90s，立即缓慢加入20ml RPMI 1640液，800rpm离心8min，弃上清，加入含20％小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、2％HAT(Sigma)、1％青链霉素(Sigma)的1640培养液，轻轻混匀，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，加入已备有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育，逐日观察细胞生长情况，1周后补加含20％小牛血清、1％HT(Sigma)、1％青链霉素的RPMI 1640培养液，按下列公式计算克隆生长率。

克隆生长率(％)＝(细胞克隆生长孔/接种孔)×100％

5.阳性克隆的筛选及亚克隆

待细胞克隆长至视野的1/3时(显微镜放大倍数4×10)，小心吸取细胞上清液，10μg·ml^-1Aβ寡聚混合物为包被抗原，ELISA方法检测上清中的抗体，具体方法及判断标准见“4.细胞融合”，按下列公式计算克隆阳性率。

克隆阳性率(％)＝(抗体阳性孔/检测的细胞克隆生长孔)×100％

采用有限稀释法对抗体分泌阳性的孔进行反复克隆化，至所有单克隆孔上清抗体阳性率为100％。

6.杂交瘤细胞株的建立

将克隆化的阳性克隆移入24孔板、6孔板和T25细胞培养瓶，扩大培养60-90d并建株。

7.单克隆抗体的亚类鉴定

按照Sigma公司的小鼠IgG亚类鉴定试剂盒(Sigma)操作杂交瘤细胞株分泌单抗A8的IgG亚类为IgG₁。

8.单抗的大量制备及纯化

接种杂交瘤细胞至降植烷(Sigma)预处理的BABL/c小鼠腹腔，1×10⁷个杂交瘤细胞/只，7-10天后抽取腹水，使用AKTA explore100蛋白层析系统通过Protein A亲和层析柱纯化单克隆抗体。用BCA试剂盒(美国PIERCE公司)测定抗体浓度，为2mg/ml。

实施例2免疫组化实验

1.方法

(1)脱蜡、水化。

(2)PBS洗两次各5分钟

(3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

(4)抗原修复。

(5)PBS洗5分钟。

(6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

(7)滴加单抗APR3，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。

(8)PBS洗三次每次2分钟。

(9)滴加生物素化二抗(山羊抗小鼠IgG)，20℃～37℃20分钟。

(10)PBS洗3次每次2分钟。

(11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

(12)PBS洗4次每次5分钟。

(13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。

(14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

(15)脱水、透明、封片、镜检。

2.结果与结论

结果显示，染色清晰，定位准确，背景较低。单抗APR3对正常脑组织的识别，反应很弱，几乎为阴性，见图1；单抗APR3对患病脑组织的识别，反应很强，见图2；商品化单抗F89对正常脑组织的识别，反应较强，图3；商品化单抗F89对患病脑组织的识别，反应较强，见图4。上述结果说明，单抗APR3可以作为朊病毒病脑切片中朊蛋白异构体的检测。

实施例3免疫印迹(Western blot)实验

1.方法

取50～100μg样品，5×样品缓冲液，混匀后上样，先以100V电压使蛋白通过浓缩胶。当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，结束电泳，取下凝胶，常规用考马斯亮蓝R-250染色法染色；将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装有印迹缓冲液的容器里平衡10min，依次在放入滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，成“三明治”状，倒入转膜缓冲液，胶面朝负极，NC膜面朝向正极，小心避免并赶去气泡。接通电源，使恒流80mA连续转移2h，切断电源。

转膜结束后，用丽春红S染色液(10×丽春红S贮存液配制方法为：称取丽春红S 2g，三氯乙酸30g，璜基水杨酸30g，加水至100ml；用时按照1∶10的比例用用去离子水稀释)确定蛋白条带位置，做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜(称取脱脂奶粉5g，溶于0.1mol/LPBST(NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.1.44g，KH₂PO₄.0.44g，Tween-20 0.05ml，补ddH₂O至1L，pH7.2～7.4)100ml)，4℃封闭过夜。用封闭液液稀释单抗APR3，浓度一般为0.2～1μg/ml，于4℃孵育12～14h，或于20～37℃孵育2h。用0.1mol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5～10min。用PBS稀释HRP标记的二抗，稀释度为1∶1000，室温孵育1h。用0.1mol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5min。按照PIERCE化学发光试剂盒说明，将A液和B液等体积混合，加在硝酸纤维素膜上，2～5min后，用X光片曝光显影，观察结果。用Quantity One software(BIO-RAD)软件进行条带半定量。

2.结果与结论

Western Blot结果，单抗APR3对PrP蛋白的识别，以商品化单抗3F4为阳性对照，见图5。

上述结果说明，单抗APR3可以通过Western Blot进行样本的PrP检测。

实施例4单抗APR3可变区基因的克隆

取处于对数生长期的APR3杂交瘤细胞(5×10⁶)，采用Trizol试剂法提取杂交瘤细胞株APR3的总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。利用5’RACE的方法扩增抗prion单抗APR3轻、重链可变区基因。分别跟据小鼠IgG轻链和重链恒定区CH-1区基因序列设计基因特异性引物L-GSP1：ACTGGATGGTGGGAAGATGG和H-GSP1：CAGTGGATAGACCGATGGGGG。根据试剂盒说明书以总RNA为模板，分别以L-GSP1和H-GSP1为引物，使用SuperScrip II反转录酶合成cDNA第一链。反转录反应方案为：总RNA5μg，GSP 100n mol/L，补加无Rnase水至18μL，70℃孵育10min后立即置冰浴上；继续向反应液中加入10×buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂2.5μL，10m mol/L dNTP 1μL，42℃孵育1min后加入1μL 200U/μL SuperScrip II反转录酶，42℃反应50min，70℃孵育10min。反转录完毕后加入RNase水解RNA，使产物中只含有cDNA第一链。使用S.N.A.P离心柱纯化cDNA第一链，然后通过末端脱氧核苷酸转移酶TdT以dCTP为底物向cDNA第一链5’端加上Poly(C)尾巴。

分别用以PRP：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG与L-GSP2：GGGGAA GATGGATACAGTTGGTGCAGC和PRP与H-GSP2GATAGCCGATGGGGGTGTTGTTT TGG两对引物以已经加上Poly(C)尾巴的cDNA第一链为模板扩增抗体轻链和重链(VL、VH)可变区基因。用PCR产物纯化试剂盒(Omega)回收纯化后，将目的片段克隆至T载体，测序分析(见序列表1-4)。

PCR扩增反应按照常规方法进行：以上述产物为模板，分别用重链和轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为：cDNA5μL，上下游引物(10m mol/L)各1μL，10m mol/LdNTP 2μL，10×buffer 5μL，补加双蒸水至50μL，Ex Taq DNA聚合酶1.25μl，加水至50μl，混匀，瞬时离心后，置PCR仪内反应。PCR条件为：95预变性5min，循环参数为94变性40s，55退火40s，72延伸1min，共30个循环，最后72延伸51min。

目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物以试剂盒(Omega)纯化回收后，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1μl，PCR产物纯化重链(或轻链)4μl，连接缓冲液5μl，混匀后置4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆并测序。

抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因在制备用于诊断、预防和治疗朊病毒病的试剂(盒)及药物中的应用：

抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因应用方面的研究主要有：(1)建立可用于分析朊蛋白异构体的夹心ELISA法；(2)朊病毒病的预防及早期治疗研究：用于早期或Prnp转基因鼠等朊病毒动物模型，静脉、腹腔或颅内注射抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体，通过观察症状、组织病理学以及分子细胞生物学改变，得到实验室数据；(3)朊病毒病的治疗研究：用于晚期或Prnp转基因鼠等朊病毒动物模型，静脉、腹腔或颅内注射抗朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体，通过观察症状、组织病理学以及分子细胞生物学改变，得到实验室数据；(4)；朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体用于各期临床试验研究；(5)朊蛋白异构体单抗APR3轻、重链可变区基因相关的多肽或抗体应用的副作用及并发症研究。(脑膜脑炎、出血)。

以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可以直接用于朊病毒病的诊断及免疫治疗。

以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：(1)嵌合抗体：是用鼠MAb的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保存了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在免疫治疗中显示出良好的效果。(2)人源化抗体：针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体：主要有由VH-CH1和VL-CH1组成的Fab抗体、用一条多肽(Gly4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体：主要有双链抗体(ScFv)₂、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)₂、F(ab’)₃、(ScFv)₄等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体：是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白：把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的核酸或酶等其它生物功能分子连接形成的具有靶特定的生物活性重组蛋白。(7)噬菌体抗体：把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中筛选出所需的特异性抗体。

以本发明所述及的轻、重链可变区基因编码的多肽，以及重构成一定形式的抗体，进行各种酶、生物素、荧光(Cy3、Cy5等)等标记。

以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子组装的朊病毒以及相关疾病诊断试剂盒。

Claims

1.一种朊蛋白异构体单克隆抗体的重链可变区基因与轻链可变区基因，其中重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和所示；轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述的重链可变区基因与轻链可变区基因及它们分别编码的多肽在制备朊蛋白异构体单克隆抗体中的应用。

3.权利要求1所述的重链可变区基因与轻链可变区基因及它们分别编码的多肽在制备诊断和治疗朊病毒病的试剂或药物中的应用。

4.一种朊蛋白异构体单克隆抗体，其重链与轻链可变区DNA序列和氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO：1是重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO：3是轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是轻链可变区氨基酸序列。

5.权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测朊蛋白异构体试剂中的应用。

6.权利要求5所述的应用，所述检测朊蛋白异构体试剂是免疫组化试验试剂。

7.权利要求5所述的应用，所述检测朊蛋白异构体试剂是免疫印迹试验试剂。

8.权利要求4所述的单克隆抗体在制备诊断朊病毒病的试剂和治疗药物中的应用。