CN101981051A

CN101981051A - 参与非生物胁迫耐受的转录激活因子

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Publication number: CN101981051A
Application number: CN2009801105099A
Authority: CN
Inventors: 索巴·希瓦萨恩卡尔; 大卫·A·塞凌格尔; 诺伯特·布鲁杰瑞
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2011-02-23
Also published as: US20130133110A1; BRPI0907114A2; WO2009094527A2; MX2010008045A; EP2247610A2; US20090188003A1; CA2713120A1; WO2009094527A3

Abstract

本发明提供在植物中调节核苷酸序列表达的组合物和方法。组合物包括参与调控应答诸如寒冷或干旱的非生物胁迫的基因表达的新的多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。还提供了在植物中表达所述多核苷酸和改善植物的寒冷和/或干旱耐受的方法。

Description

参与非生物胁迫耐受的转录激活因子

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更特别地涉及植物中基因表达调节。

发明背景

植物所受胁迫可能由生物和非生物剂导致。例如，胁迫的生物原因包括病原体侵染、昆虫摄食、被诸如槲寄生的其它植物寄生和反刍动物的放牧。非生物胁迫包括，例如，过量的或不足的可用水、温度极端、合成的化学药品例如除草剂和过量的风。然而即使在不利条件下，植物通过多种避免或耐受胁迫的内部和外部机制存活并经常茂盛。对胁迫的植物生理应答反映了基因表达的变化。

用于作物生长发育的水不足是维持或增加世界范围的食物生产的主要障碍。人口增长、气候变化、灌溉诱发的土壤盐渍化和待开发生产农业用地减少属于促成对可耐受干旱作物的需求的因素。干旱胁迫经常导致减产。在玉米中，这种产量损失大部分是由植物穗顶端部分结实和灌浆失败这一称作顶端籽粒败育(tip kernel abortion)的现象导致的。

低温也可以减少作物生产。春季或秋季的突发性降霜可能会导致未成熟组织死亡。

生理学地，干旱和低温胁迫的效果可能相似，因为两者都导致细胞脱水。例如，细胞间层中冰的形成将水抽提跨过细胞膜，在细胞内制造水份亏空。因此，植物耐旱性的改善可以改善其耐寒性。

植物通过基因表达调控来适应环境胁迫例如寒冷、干旱和盐度。胁迫可诱导基因的启动子区域可以包含被反式作用因子识别的DNA片段顺式作用元件。反式作用因子包括，例如，结合ABA应答元件(ABRE)的受脱落酸(ABA)受激的蛋白质；见，例如，Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(2005)Trends in Plant Science 10(2)：88-94。反式作用因子也包括核蛋白质，所述核蛋白质能够结合调节性DNA并与其他分子、尤其是DNA聚合酶III相互作用以起始与所述调节性DNA可操作连接的DNA的转录。转录因子可以以共享DNA结合结构域的相关蛋白质家族存在。所述转录因子基因可以自身被胁迫诱导。此外，顺式调节基因的下游靶可以是转录因子，从而产生基因应答级联的复杂网络。

CBF基因(代表C-重复/DRE结合因子)编码可以与某些植物启动子的特定顺式作用元件相互作用的蛋白质。(美国专利号5,296,462和5,356,816；Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1994)The Plant Cell 6：251-264；Baker，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.30：679-684)；Jiang，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.30：679-684)所述顺式作用元件已知为C-重复/DRE并且通常包含以单拷贝或多拷贝存在的5碱基对核心序列，CCGAC。

CBF蛋白质可以包含CBF特异结构域和AP2结构域并在多个物种中得到鉴定，包括拟南芥属(Arabidopsis)(Stockinger，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：1035-1040；Liu，et al.，(1998)Plant Cell.10：1391-1406)；甘蓝型油菜(Brassica napus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、黑麦(Secalecereale)和小麦(Triticum aestivum)(Jaglo，et al.，(2001)Plant Phys.127：910-917)和芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassicarapa)、萝卜(Raphanus sativus)、大豆(Glycine max)和玉米(Zea mays)(美国专利号6,417,428、7,253,000和7,317,141)。

DRE/CRT(脱水应答元件/C-重复)顺式元件在胁迫ABA非依赖应答中起作用并在许多植物物种中得到鉴定，包括拟南芥属、大麦、芸苔属、柑橘、棉花、桉树、葡萄、玉米、甜瓜、椒、水稻、大豆、烟草、番茄和小麦。所述DRE/CRT元件包含被称作DREB1(DRE结合)和CBF(C重复结合因子)的反式激活因子识别的核心结合位点，A/GCCGAC。接近所述顺式元件、和/或多顺式因子的二级结构似乎是胁迫可诱导表达必需的另外组分(综述，见，Agarwal，et al.，(2006)Plant Cell Rep.25：1263-1274；Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，(2005)Trends in Plant Science.10(2)：88-94)。CBF/DREB基因的启动子区域可以包含顺势作用元件例如ICEr1和ICEr2(Zarka，et al.，(2003)Plant Physiology.133：910-918；Massari和Murre，(2000)Mol.Cell.Bio.20：429-440)。

复杂农艺性状的修饰需要属于多种途径的多种基因同时作用。使用单个基因修饰复杂农艺性状可能导致仅部分植物应答潜力的实现。相反地，所述CBF转录因子为过表达单一转录因子以导致同时激活和过表达多个下游基因提供了机会，以提供对性状的最大可能的调控。基于表达分析和联合研究使用所选的玉米CBF基因，能够了解靶向用于转基因修饰的转基因或内源基因，或用于非生物胁迫耐受的标记辅助育种。

在植物中过表达CBF已经表现对干旱、寒冷和/或盐胁迫耐受的改善(Jaglo-Ottosen，et al.，(1998)Science 280：104-106；Kasuga，et al.，(1999)Nature Biotechnology 17：287-291；Hsieh，et al.，(2002)Plant Phys.129：1086-1094；Hsieh，et al.，(2002)Plant Phys.130：618-626；Dubouzet，etal.，(2003)Plant J.33：751-763)。尽管CBF转录因子可能用于转基因方法以调节植物对胁迫的应答，CBF的组成型表达却导致负多重效应。在所选组织和/或处于胁迫条件的CBF的可控表达是所关心的。

发明概述

提供了调节植物中基因表达的组合物和方法。组合物包括参与调控寒冷、盐和/或干旱应答基因表达的分离的多肽，包括SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29。本发明的其它组合物包括编码SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29所示序列的多肽的每一多核苷酸、每一的可操作片段和与每一的全长编码序列85％一致的序列。本发明的组合物还包括SEQ ID NO：30、37、38、43和44所示的多核苷酸，与其互补的全长多核苷酸，以及其变体和片段。所述序列称作CBF或CBF样基因。

在本发明的一实施方式中，DNA构建体包括与启动子序列可操作连接的本发明的分离的多核苷酸，其中所述启动子能够在植物细胞中驱动核苷酸序列表达。所述启动子序列对于所连接的核苷酸序列可以是异源的。在一些实施方式中，所述启动子序列可由外源试剂或环境条件诱导。在一些实施方式中，所述启动子优先在某些组织或器官中起始转录。

还提供了包含所述DNA构建体的表达盒；包含所述表达盒的载体；包含本发明的新序列的转化的植物细胞、转化的植物和转化的种子。

其它实施方式包括在植物中表达本发明的多核苷酸或多肽的方法。所述方法包括将包含与本发明的多核苷酸可操作连接的启动子序列的表达盒稳定地并入植物细胞的基因组中，其中所述启动子能够在植物细胞中起始所述多核苷酸的转录。本发明的某些实施方式包括调控转化的植物在胁迫条件下的发育的方法。

附图简述

图1提供了来自玉米的许多CBF多肽的比对：ZmCBF7(SEQ ID NO：17)、ZmCBF5(SEQ ID NO：15)、ZmCBF8(SEQ ID NO：18)、ZmCBF2(SEQID NO：2，在本文还标为1084 SEQ 2)、ZmCBF10(SEQ ID NO：20)、ZmCBF4(SEQ ID NO：14)、ZmCBF9(SEQ ID NO：19)、ZmCBF11(SEQ IDNO：21)、ZmCBF6(SEQ ID NO：16)、ZmCBF1(SEQ ID NO：4，在本文还标为1084 SEQ 4)、ZmCBF3(SEQ ID NO：13)、ZmCBF16(SEQ ID NO：26)，ZmCBF15(SEQ ID NO：25)、ZmCBF17(SEQ ID NO：27)、ZmCBF19(SEQ ID NO：29)、ZmCBF12(SEQ ID NO：22)、ZmCBF13(SEQ ID NO：23)、ZmCBF14(SEQ ID NO：24)、ZmCBF18(SEQ ID NO：28)。

图2提供了图1中比对序列的树状图。图1和图2都是使用Accelrys，Inc.的PileUp软件以默认设置创建的(blosum 62得分矩阵、空位生成罚分8、空位延伸罚分2、最大输入序列范围5000、所加空位字符最大值2000)。注意ZmCBF2(SEQ ID NO：2)示为1084 SEQ 2；ZmCBF1(SEQ ID NO：4)示为1084 SEQ 4。

图3是图1比对的一部分，其中ZmCBF1、ZmCBF2和ZmCBF3的AP2结构域标以下划线并且CBF特异结构域标以粗体。

图4是ZmCBF3至ZmCBF9和ZmCBF11的表达谱结果表格。

序列简述

发明详述

本发明提供分离的多肽，其活性为参与胁迫、特别地干旱或寒冷胁迫诱导的基因表达的转录起始因子。

所谓“重组表达盒”或“表达盒”是指通过重组或合成产生的核酸构建体，包含在宿主细胞中准许特定核酸转录的一系列特定核酸元件。所述重组表达盒可被并进质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。通常地，表达载体的表达盒部分除其他序列外还包括启动子和待转录的核酸。在SEQ ID NO：30提供编码ZmCBF3的多核苷酸序列。在SEQ ID NO：43提供编码ZmCBF4的多核苷酸序列。在SEQ ID NO：44提供编码ZmCBF6的多核苷酸序列。在SEQ ID NO：37提供编码ZmCBF15的多核苷酸序列。在SEQ ID NO：39提供编码ZmCBF17的多核苷酸序列。本领域技术人员可以从提供的氨基酸序列衍生其他多核苷酸编码序列。

所谓“异源核苷酸序列”是指并非和另一条序列在一起天然存在的序列。例如，编码转录因子的核苷酸序列与其可操作连接的启动子序列可以是异源的。另外，所述编码序列和/或所述启动子序列对于植物宿主可以是天然的或是外来的。

所谓“可操作的片段”是指足以执行或提供相关功能的特定多核苷酸或多肽的截短或改变的形式。例如，在目标是干扰基因功能的情况下，多核苷酸的截短形式可足以实现共抑制或反义调节的目的。在目标是起始转录的情况下，短于已知全长或包含最小内部删除或改变的启动子或转录因子仍然可以恰当地起作用。提供的启动子序列，或其一个或多个片段，可以单独使用或组合其他序列产生合成启动子而使用。在这类实施方案中，所述片段(也被称为“顺式作用元件”或“子序列”)赋予合成启动子所需的性能。

所谓“启动子”是指转录起点上游参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以起始转录的DNA区域。启动子通常包含能够引导RNA聚合酶II为特定的编码序列在适当的转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可以包含通常位于TATA盒上游或5’端的其他识别序列，被称为上游启动子元件，其影响转录起始率。因此启动子区域可被进一步定义为包含上游调节元件例如负责编码序列组织和时间表达的那些、增强子等。以同样的方式，在所需组织实现表达的启动子元件可被鉴定、分离和与其他核心启动子一起使用。

“植物启动子”是无论其来源是否为植物细胞均能够在植物细胞中起始转录的启动子。示例性植物启动子包括但不仅限于，从包含在植物细胞中表达的基因的植物、植物病毒和细菌例如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)中获得的那些。受发育控制的启动子实例包括优先在某些组织例如叶、根或种子中起始转录的组织优选启动子，和那些当发育到达某一生理阶段例如衰老时驱动表达的启动子。仅在某些组织中起始转录的启动子被称为“组织特异的”。“细胞型优选”启动子主要在一种或多种器官的某些细胞类型例如根或叶中的维管组织中驱动表达。“可诱导的”或“可抑制的”启动子是指受环境控制的启动子。可以通过可诱导的启动子实现转录的环境条件实例包括厌氧条件或光的存在。某些启动子被不利的环境条件诱导，例如，rab17(例示：SEQ ID NO：5；也见，Busk，et al.，(1997)Plant J 11：1285-1295)、rd29A(例示：SEQ ID NO：6；也见，GenBank D13044和Plant Cell 6：251-264，(1994))、rip2(例示：SEQ ID NO：7和8；也见，GenBank L26305和Plant Phys.107(2)：661-662(1995))、mlip15(例示：SEQ ID NO：9；也见，GenBank D63956；Mol.Gen.Gen.248(5)：507-517(1995))和ryeCBF31(美国专利申请号60/981,861，提交于2007年10月23日)。组织特异的、组织优选、细胞型优选和可诱导的启动子是“非组成型”启动子种类的成员。“组成型”启动子是指在所有或几乎所有组织中、在所有或几乎所有发育阶段、在大部分环境条件下有活性的启动子。

认识到要增加转录水平，可以利用增强子与启动子区域组合以增加表达。增强子在本领域已知并包括SV40增强子区域、35S增强子元件等。

“受试植物”或“受试植物细胞”是指关于感兴趣的基因使基因改变例如转化发生变化的植物或植物细胞，或者是传自这样改变的植物或植物细胞并包含所述改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供参考点用于测量受试植物或植物细胞中的变化。

对照植物或对照植物细胞可以包括，例如：a)野生型植物或植物细胞，即与用于产生受试植物或受试植物细胞的基因改变的起始材料有相同基因型的；b)植物或植物细胞，其与起始材料有相同基因型但是已用空(null)构建体(即对感兴趣的性状没有已知效果的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化；c)是受试植物或受试植物细胞子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；d)与受试植物或受试植物细胞遗传上一致的、但不暴露于会诱导感兴趣的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或e)受试植物或受试植物细胞本身，其处于感兴趣的基因不表达的条件。

所述术语“分离的”是指材料，例如核酸或蛋白质，其：(1)基本上或本质上没有在其天然环境下发现的通常与其陪伴或相互作用的组分。所述分离的材料任选地包含在其天然环境下没有发现与其伴随的材料；或(2)若材料处于其天然环境下，材料通过蓄意人为干涉合成地改变或合成地产生和/或被放置在细胞内的不同位置。合成地改变或产生材料可以对在其天然状态之内或之外的材料进行。例如，天然存在的核酸如果通过非天然、合成方法改变或产生，或如果其转录自通过非天然、合成方法改变或产生的DNA，则其成为分离的核酸。所分离的核酸也可以通过合成重排(“改组(shuffling)”)感兴趣的基因的一个或多个等位基因形式的一个或多个部分产生。同样地，天然存在的核酸(例如，启动子)如果被引入基因组的不同基因座就变成分离的。

多核苷酸可以是单或双链的，取决于语境，并且本领域技术人员会认识到所述术语的何种解释是合适的。

本发明的玉米(Zea mays)序列可被用于从其他生物体中分离相应的序列，特别地从其他植物中，更特别地从其他单子叶植物中。基于这类序列与本文阐述的序列的相似性，诸如PCR、杂交等的方法可被用于鉴定这类序列。在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，其与存在于来自所选择生物体的所克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中的其他相应核苷酸序列选择性杂交。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸并可以用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标记来标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本发明的序列的合成寡核苷酸制备。例如，本文公开的全部序列或其一个或多个部分，可被用作能够与相应序列特异杂交的探针。为了在多种条件下完成特异杂交，这类探针包含独特的并长度至少约10个核苷酸的序列。公知的聚合酶链式反应(PCR)方法可被用于从所选生物体中分离或扩增额外序列或作为诊断测定法以确定生物体中相应序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库(plated DNAlibraries)杂交筛选(噬斑或菌落；见，例如，Sambrook，et al.，见上；也见，Innis，et al.，eds.，(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Application(PCR操作步骤，方法及应用指南)，Academic Press)。制备用于杂交的探针和构建cDNA和基因组文库的方法在本领域通常已知并公开于Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验技术)，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork)。

这类序列的杂交可以在严紧条件下进行。所谓“严紧条件”或“严紧杂交条件”是指相比与其他序列杂交，探针与其靶序列杂交会达到可检测的更大程度(例如，至少是背景的两倍)的条件。严紧条件是靶-序列依赖的，并取决于多核苷酸的结构会有所差异。通过控制杂交的严紧性和/或洗涤条件，可以鉴定到与探针100％互补的靶序列(同源探查(probing))。可选择地，严紧性条件可以调整为允许序列中一些错配从而检测较低程度的相似性(异源探查)。

通常，严紧条件是那样的条件，其中在pH 7.0-8.3下，盐浓度低于约1.5M Na离子、通常地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)且温度对于短探针(例如，10-50核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50核苷酸)至少约60℃。严紧性也可以通过加入失稳剂例如甲酰胺来调整。示例性低严紧性条件包括以30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，和以1×-2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)在50-55℃洗涤。示例性中严紧性条件包括在40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS、37℃杂交，和以0.5×-1×SSC在55-60℃洗涤。示例性高严紧性条件包括在50％甲酰胺、l M NaCl、1％SDS、37℃杂交，和以0.1×SSC在60-65℃洗涤。杂交的持续时间通常少于约24小时，通常约4-约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth和Wahl的方程近似的得出(Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-284：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，和L是杂交物的碱基对长度。T_m是50％的互补的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配降低T_m约1℃；因此，T_m、杂交和/或洗涤条件可被调整以与所需一致性的序列杂交。例如，如果寻找≥90％一致性的序列，T_m可降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，用于特定序列及其互补体的严紧条件选用低于热熔点(T_m)约5℃。然而，严厉的严紧条件可在低于热熔点(T_m)1、2、3或4℃下使用杂交和/或洗涤；适中严紧条件可在低于热熔点(T_m)6、7、8、9或10℃下使用杂交和/或洗涤；低严紧性条件可在低于热熔点(T_m)11、12、13、14、15或20℃下使用杂交和/或洗涤。利用方程、杂交与洗涤组合物和所需T_m，普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液严紧性的变化已经在本质上描述。如果所需错配程度导致T_m低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度从而可以使用较高的温度。核酸杂交的广泛指南可以发现于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学与分子生物学实验室技术-核酸探针杂交)，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in Nolecular Biology(分子生物学实验技术)，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。也见，Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cioning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。因此，保留本发明功能且与本文公开的序列、或其互补体、或二者任一的片段在严紧条件下杂交的分离的序列都包括在本发明内。这类序列通常与公开的序列至少约85％一致。即序列的一致性范围可以变化，共享至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

用于比较的序列比对方法在本领域公知。进行用于比较的序列最适比对可以通过Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math.2：482的本地同源性算法；通过Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；通过这类算法的计算机化实现，包括但不仅限于：来自Intelligenetics，Mountain View，Californi的PC/Gene程序中的CLUSTAL；来自Accelrys，Inc.，San Diego，CA的

Wisconsin Package^TM中的Pileup、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。

CLUSTAL程序被充分描述于Higgins和Sharp，(1988)Gene73：237-244；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet，et al.，(1988)Nucleic Acids Research 16：10881-90；Huang，et al.，(1992)Computer Applications in the Biosciences 8：155-65和Pearson，et al.，(1994)Methods in Molecular Biology 24：307-331。对BLAST(基本局部比对搜索工具)的描述提供于Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410。

与本发明序列的一致性意味着具有至少85％序列一致性的多肽序列，其中序列一致性百分比是基于SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的全长。

CBF基因间AP2结构域高度保守，并且一些物种共享另一将所述AP2结构域归入同类(bracketing)的保守区(Jaglo，et al.，(2001)Plant Phys.127：910-917)。例如，在图3中，ZmCBF1、ZmCBF2和ZmCBF3的AP2结构域标以下划线。相同序列的CBF特异结构域标以粗体。因此，本领域技术人员会认识到最有可能保留功能的变体是至少一个结构域未被干扰的那些。

本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。所谓“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分，基本上或本质上没有在所述多核苷酸或蛋白质天然存在环境下发现的通常与其陪伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上没有其他细胞材料，或通过重组技术产生时的培养基，或基本上没有化学合成时的化学前体或其他化学药品。最适地，“分离的”多核苷酸没有在所述多核苷酸来源生物体的基因组DNA中天然侧翼连接所述多核苷酸的序列(即位于所述多核苷酸5’和3’端的序列)(最适地蛋白质编码序列)。例如，在多种实施方案中，所述分离的多核苷酸可以包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、在所述多核苷酸来源细胞的基因组DNA中天然侧翼连接所述多核苷酸的核苷酸序列。基本上没有细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)污染蛋白质的蛋白质制剂。当本发明的蛋白或其生物活性部分是由重组产生时，最适地，培养基表现少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非感兴趣的蛋白的化学药品。

ZmCBF多核苷酸和蛋白质的片段和变体也包括于本发明的方法和组合物。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留天然蛋白质生物活性并因此调节转录的蛋白质片段。例如，多肽片段可以包含CBF特异结构域或AP2结构域。在一些实施方案中，所述多肽片段会同时包含CBF特异结构域和AP2结构域。可选择地，用于抑制或沉默(即降低表达水平)CBF序列的片段不需要编码蛋白质片段，但是会保留抑制靶序列表达的能力。另外，用作杂交探针的片段通常不编码保留生物活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段范围可以为至少约11核苷酸，约20核苷酸，约50核苷酸，约100核苷酸和多达编码本发明蛋白质的全长多核苷酸。

编码CBF特异或AP2结构域或CBF多肽的多核苷酸片段将编码至少14、25、30、50、60、70、100、150、200、250或300邻接的氨基酸，或高达存在于全长CBF特异或AP2结构域、或CBF或CBF样蛋白质的氨基酸的全部数量。用作杂交探针、PCR引物、或抑制构建体的AP2或CBF特异结构域、CBF或CBF样多核苷酸的片段通常不需要编码CBF蛋白质的生物活性部分。

制备包含AP2或CBF特异结构域的多肽、或CBF或CBF样蛋白质的生物活性部分，可以通过分离CBF样多核苷酸的一部分，表达CBF样蛋白质的所编码部分(例如，通过在体外重组表达)，和评价所述CBF样蛋白质的所编码部分的活性。作为CBF样核苷酸序列或包含AP2或CBF特异结构域的多核苷酸序列的片段的多核苷酸，包含至少42、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500邻接的核苷酸，或高达存在于全长AP2或CBF特异结构域或CBF样多核苷酸中的核苷酸数量。

“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含对天然多核苷酸内一个或多个位点的一个或多个核苷酸的删除和/或添加和/或对天然多核苷酸内一个或多个位点的一个或多个核苷酸的替换。如本文使用的，“天然的”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些由于遗传密码简并性而编码CBF样多肽中的一种或AP2或CBF特异结构域的氨基酸序列的序列。诸如这些的天然存在的等位基因变体可以得到鉴定，其通过使用公知的分子生物学技术，像例如，使用本文他处概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸也包括合成来源的多核苷酸，例如通过使用定点诱变产生的、但仍编码能够调节转录或能够降低(即抑制或沉默)CBF样多核苷酸表达水平的包含AP2或CBF特异结构域(或两者)的多肽或CBF样多肽的那些多核苷酸。通常，本发明的特定多核苷酸的变体通过本文他处所述的序列比对程序和参数确定会与所述特定多核苷酸有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

本发明的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体也可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽和参照多核苷酸编码的多肽的百分比序列一致性进行评估。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：13多肽有给定百分比序列一致性的多肽的分离的多核苷酸。任意两个多肽间百分比序列一致性可以使用本文他处描述的序列比对程序和参数计算出。任意给定的本发明的多核苷酸对可以通过比较其编码的两个多肽共享的百分比序列一致性评估，所述两个编码的多肽的百分比序列一致性至少为约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

“变体”蛋白质意指源于天然蛋白质的对天然蛋白质内一个或多个位点的一个或多个氨基酸删除或添加和/或对天然蛋白质内一个或多个位点的一个或多个氨基酸替换的蛋白质。本发明包括的变体蛋白质具有生物活性，即它们继续拥有天然蛋白质的所需的生物活性，即，如本文所述调节转录。这类变体可以产生自，例如，遗传多态性或人为操作。本发明的CBF样蛋白质或AP2或CBF特异结构域的生物活性变体通过本文他处所述的序列比对程序和参数确定会与CBF样蛋白质或一致AP2或CBF样结构域的氨基酸序列有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性。本发明的CBF样蛋白质或AP2或CBF结构域的生物活性变体可以与所述蛋白通过少如1-15个氨基酸残基、少如1-10、例如6-10、少如5、少如4、3、2或甚至通过一个氨基酸残基而区别开。

本发明的多肽可以通过多种方式改变，所述多种方式包括氨基酸替换、删除、截断和插入。这类操作的方法在本领域内通常已知。例如，CBF样蛋白质或AP2或CBF样结构域的氨基酸序列变体和片段可通过突变编码DNA制备。诱变和多核苷酸改变的方法在本领域内众所周知。见，例如，Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.(酶学方法)154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company，New York)和其中所引参考文献。不影响感兴趣的蛋白生物活性的适当氨基酸替换的指南可以发现于Dayhoff，et al.，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图册)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型，通过引用将其并入本文。保守替换，例如将一个氨基酸更换为有相似性质的另一个氨基酸，可能是最适的。

因此，本发明的基因和多核苷酸同时包含天然存在的序列和突变体形式。同样地，本发明的蛋白质同时包括天然存在的蛋白质和其变体和修饰形式。这类变体可以继续拥有所需活性(即调节转录的能力)。在具体实施方案中，将要在编码所述变体的DNA中做出的突变不会将序列置于阅读框之外并且不会产生可能产生次级mRNA结构的互补区域。见，欧洲专利公开号0075444。

本文包含的蛋白质序列的删除、插入和替换预期不会对蛋白质的特征产生根本的变化。然而，当不易预测所述替换、删除或插入的确切效应时，本领域技术人员会意识到，通过常规筛选测定法评估所述效应。例如，CBF样多肽的活性可以通过测定所述多肽调节转录的能力来评估。多种方法可用于测定这种活性，包括，在核苷酸或多肽水平直接监测靶基因的表达水平。用于这类分析的方法是已知的并包括，例如，Northem印迹、S1保护测定法(S1 protection assays)、Western印迹、酶或比色测定法。在具体实施方案中，确定序列是否具有CBF样活性可以通过监测靶基因水平或活性的上升或下降来测定。可选择地，用于测定转录活性调控的方法可以包括监测植物表型的改变。例如，如本文他处更为详细地讨论的，调控CBF样多肽的水平可以导致植物对非生物胁迫耐受的改变。本文他处更为详细地讨论了测定这类变化的方法。

变体多核苷酸和多肽也包括源于诱变和重组程序例如DNA改组的序列和蛋白质。通过这类程序，一个或多个不同的CBF样编码序列可被操作用于产生具有所需性质的新的CBF样序列或AP2或CBF特异结构域。以这种方式，重组多核苷酸文库从包含具有基本序列一致性的序列区域的相关序列多核苷酸群中产生，并且可以在体外或体内同源重组。例如，利用这种方法，编码感兴趣的结构域的序列基序可以在本发明的CBF样基因和其他已知CBF样基因间改组来获得新基因，所述新基因编码具有感兴趣的改良性状、例如对于酶增加的K_m的蛋白质。用于这种DNA改组的策略在本领域内已知。见，例如，Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer，(1994)Nature 370：389-391；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

所述表达盒也可以包括，位于感兴趣的异源核苷酸序列的3′末端，在植物中起作用的转录和翻译终止区域。所述终止区域可以天然伴随存在于表达盒中的启动子核苷酸序列，或可以天然伴随感兴趣的DNA序列，或可以源自其他来源。方便的终止区域可从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区域。也见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，etal.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

所述表达盒又可以包含5’前导序列。所述前导序列可作用为增强翻译。翻译前导在本领域已知并包括：小RNA病毒前导，例如，EMCV前导(脑心肌炎5’非编码区域)，Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：6126-6130；马铃薯Y病毒属前导(potyvirus leaders)，例如，TEV前导(烟草蚀纹病毒)，Allison，et al.，(1986)；MDMV前导(玉米矮花叶病毒)，Virology 154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak，et al.，(1991)Nature 353：90-94；苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA非翻译前导(AMV RNA4)，Jobling，et al.，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导(TMV)，Gallie，et al.，(1989)Molecular Biology of RNA，237-256页；和玉米退绿斑驳病毒前导(MCMV)Lommel，et al.，(1991)Virology 81：382-385。也见Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiology 84：965-968。所述盒也可以包含增强翻译和/或mRNA稳定性的序列例如内含子。

在需要将异源核苷酸序列的表达产物导入特定细胞器、特别地质体、淀粉体，或至内质网或分泌在细胞表面或细胞外的那些情况中，所述表达盒还可以包含转运肽的编码序列。所述转运肽在本领域中公知并包括，但不仅限于，用于酰基载体蛋白质的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶等。

在制备表达盒中，多个DNA片段可被操作，从而以正确的方向和适当地以正确阅读框提供DNA序列。为此，接头或连接子可被用于连接DNA片段，或可涉及到提供方便的限制性位点、去除多余DNA、去除限制性位点等的其他操作。为此，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性消化、退火和再替换(resubstitutions)，例如转换和颠换。

如本文记录的，本发明提供在可操作地连接的启动子控制下能够表达所请求保护序列的载体。通常，所述载体应该在植物细胞内起作用。有时，可能优选在大肠杆菌(E.coli)内起作用的载体(例如，产生用于抗体生成的蛋白质、DNA序列分析、构建插入片段、获得大量核酸)。用于克隆和在大肠杆菌内表达的载体和程序讨论于Sambrook，et al.，(见上)。

所述转化载体，其包含在表达盒中可操作地连接启动子的本发明的序列，也可以包含待共转化进生物体的基因的至少一个额外核苷酸序列。可选择地，所述额外序列可以由另一个转化载体提供。

在植物中起作用的载体可以是源于农杆菌(Agrobacterium)的双元质粒。这类载体能够转化植物细胞。这类载体包含整合进宿主(植物)染色体所需的左和右边界序列。至少，介于这些边界序列中间的是处于可操作地连接的启动子控制下的待表达基因。在优选实施方案中，也包含选择性标记和报告基因。为轻松获得足够量的载体，优选允许在大肠杆菌中复制的细菌来源。

报告基因可以包含于转化载体。本领域已知的合适的报告基因实例可以发现于，例如，Jefferson，et al.，(1991)Plant Molecular Biology Manual(植物分子生物学手册)，ed.Gelvin，et al.，(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33；DeWet，et al.，(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff，et al.，(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain，et al.，(1995)BioTechniques 19：650-655；和Chiu，et al.，(1996)Current Biology 6：325-330。

用于选择被转化的细胞或组织的选择性标记基因可以包含于所述转化载体。这些可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不仅限于，编码对以下的抗性的基因：氯霉素，Herrera Estrella，et al.，(1983)EMBO J.2：987-992；甲氨蝶呤，Herrera Estella，et al.，(1983)Nature 303：209-213；Meijer，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.16：807-820；潮霉素，Waldron，et al.，(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108；Zhijian，et al.，(1995)Plant Science 108：219-227；链霉素，Jones，et al.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91；壮观霉素，Bretagne-Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res.5：131-137；博来霉素，Hille，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176；磺酰胺，Guerineau，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136；溴苯腈，Stalker，et al.，(1988)Science 242：419-423；草甘膦，Shaw，et al.，(1986)Science 233：478-481；草丁膦，DeBlock，et al.，(1987)EMBO J.6：2513-2518。

可以用于转基因事件的恢复但在最终产品中可能不需要的其他基因包括但不仅限于，实例例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶)，Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387)；GFP(绿色荧光蛋白)，Chalfie，et al.，(1994)Science 263：802和Gerdes(1996)FEBS Lett.389：44-47；DSred(Dietrich，et al.，(2002)Biotechniques 2(2)：286-293)；荧光素酶，Teeri，et al.，(1989)EMBO J.8：343；KN1(Smith，et al.，(1995)Dev.Genetics 16(4)：344-348)；Sugaryl，Rahman，et al.，(1998)Plant Physiol.117：425-435；James，et al.，(1995)Plant Cell 7：417-429和GenBank登录号U18908；和利用玉米基因编码花青素生产酶的系统，包括CRC，P(Bruce，et al.，(2000)Plant Cell 12(1)：65-79和R(Ludwig，et al.，(1990)Science 247：449)。

所述转化载体包含编码本发明多肽的分离的多核苷酸，其在表达盒内可操作地连接启动子序列，所述转化载体可用于转化任何植物。通过这种方式，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。转化操作步骤可以改变，这取决于用于转化的靶植物或植物细胞的类型，例如，单子叶或双子叶。转化植物细胞的合适的方法包括显微注射，Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334；电穿孔，Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；农杆菌介导转化，见例如，Townsend，et al.，美国专利号5,563,055；直接基因转移，Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722；和弹道粒子加速，见例如，Sanford，et al.，美国专利号4,945,050；Tomes，et al.，(1995)于Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基本方法)，ed.Gamborg and Phillips，(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926。也见，Weissinger，et al.，(1988)Annual Rev.Genet.22：421-477；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooydaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet，et al.，(1985)于The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(胚珠组织实验操作)ed，Chapman et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9415-418；和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导转化)；D.Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou，et al.，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米通过根癌农杆菌)；通过引用将所有这些内容并入本文。

所述已经转化的细胞可以依照常规方式长成植株。见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后这类植物可以以同样的被转化的品系或不同的品系授粉。产生的具有所需特征表达的植物可被鉴定。可以种植两个或更多个世代以确保所需表型特征在感兴趣的条件下稳定保持和遗传。

在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与其他感兴趣的多核苷酸序列组合(“叠加”)使用从而产生具有所需表型的植物。本发明的多核苷酸可以与任意基因或基因组合叠加，所产生的组合可以包含任意一个或多个感兴趣的多核苷酸的多个拷贝。所需组合可以影响一个或多个性状；即，某些组合可被产生用于调控涉及植物胁迫应答的基因表达。其他组合可以设计产生具有多种所需性状的植物，包括但不仅限于动物饲料所需的性状例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409))；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359；和Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增强的可消化性(例如，修饰的贮藏蛋白质(美国专利申请流水号10/053,410，提交于2001年11月7日)；和硫氧还蛋白(美国专利申请流水号10/005,429，提交于2001年12月3日))，通过引用将所述公开内容并入本文。本发明的多核苷酸也可以叠加昆虫、疾病或除草剂抗性所需的性状(例如，苏云金杆菌毒蛋白(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马菌素(fumonisin)解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒和抗病基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789；Martin，et al.，(1993)Science262：1432；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂例如草丁膦或草铵膦(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和加工或处理产品所需的性状例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；修饰的油(例如，脂肪酸脱饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如，美国专利号5,602,321；β-硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基烷羧酸酯(PHAs)的表达)，通过引用将这些公开内容并入本文。也可将本发明的多核苷酸与影响农艺性状的多核苷酸组合，所述农艺性状例如雄性不育(例如，见，美国专利号5,583,210)、茎强度、开花时间，或转化技术性状例如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619；WO00/17364；WO 99/25821)，通过引用将这些公开内容并入本文。

这些叠加的组合可以通过任何方法产生，包括但不仅限于通过任意传统或顶交法杂交育种植物，或遗传转化。如果是通过遗传转化所述植物叠加性状，所述感兴趣的多核苷酸序列可以以任意顺序于任意时间组合。例如，包含一个或多个所需性状的转基因植物可用作通过随后的转化引入另外的性状的靶。所述性状可以在共转化操作步骤中利用转化盒的任意组合提供的感兴趣的多核苷酸而同时引入。例如，如果两个序列将被引入，所述两个序列可以包含于分开的转化盒(反式)或包含于同一个转化盒(顺式)。感兴趣的序列的表达可以通过同一个启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能需要引入会抑制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒。这可以连同其他抑制盒或过表达盒的任意组合以在植物中产生所需性状组合。

本发明的被转化植物可用于植物育种程序。植物育种的目标是在单个品种或杂交种中组合多种所需性状。对于大田农作物，这些性状可能包括，例如，疾病和昆虫抗性，热、寒冷和/或干旱耐受、减少的农作物成熟时间、更高产量和更好的农艺品质。由于许多农作物是机械收割，植物特征例如萌芽和成苗、生长速率、成熟性以及植物和穗的高度需要有均质性。传统植物育种是开发新的和改良的经济作物的重要工具。本发明包括通过杂交第一亲本玉米植株和第二亲本玉米植株产生玉米植株的方法，其中亲本玉米植株之一或两者是本文所述的转化的植物。

本领域已知和用于玉米植物育种程序的植物育种技术包括但不仅限于，轮回选择(recurrent selection)、集团选择(bulk selection)、大量选择(mass selection)、回交、谱系育种、自由授粉育种、限制性片段长度多态性增强选择、遗传标记增强选择、加倍单倍体和转化。这些技术的组合经常被使用。

玉米植物育种程序中玉米杂交种的开发通常需要同源自交系的开发、这类品系的杂交和杂交的评估。有许多可以评估杂交结果的分析方法。最原始和最传统的分析方法是观察表型性状。可选择地，可检查植物的基因型。

使用转化技术工程化成特定玉米植株的遗传学性状可以通过植物育种领域公知的传统育种技术移动到另一品系。例如，常用回交途径从被转化的玉米植株向优良自交系移动转基因，并且产生的子代将包含所述转基因。同样，如果自交系被用于转化，那么所述转基因的植物可以与不同的自交系杂交，从而产生转基因杂交种玉米植株。如本文所用的，“杂交”可以指简单的X×Y杂交，或回交方法，这取决于语境。

在玉米植物育种程序中开发玉米杂交种涉及三个步骤：(1)从多个种质库选择植株用于最初的育种杂交(breeding cross)；(2)选自育种杂交的植物自交数代以产生尽管互相不同、但繁育纯种和高度一致的系列的自交系；和(3)将所选自交系与不同的自交系杂交以产生杂交种。在玉米近交过程中，品系的活力降低。当两个不同的自交系杂交产生杂交种时，活力恢复。自交系纯合性和同质性的重要后果是，通过杂交一对确定的自交系创造的杂交种会总是相同的。提供优越的杂交种的自交系一旦被鉴定后，只要自交亲本保持同质性，可以无限期地繁殖所述杂交种的种子。

本发明的转基因植物可被用于产生单交种、三交种或双交种。单交种是两个自交系杂交产生F1子代时产生的。双交种是从成对杂交的四个自交系(A×B和C×D)产生的，然后两个F1杂交种再次杂交(A×B)×(C×D)。三交种是从三个自交系产生的，其中将自交系中的2个杂交(A×B)，然后将产生的F1杂交种与第三个自交系杂交(A×B)×C。F1杂交种展示的大量杂交活力和均质性在下一代(F2)中丧失。因此，杂交种产生的种子用于消费而不是种植。

下面的实施例以举例的方式而不是限制的方式提供。

实施例

实施例1.在单子叶植物细胞中表达转基因

构建的质粒载体包含编码SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29全长多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于异源启动子，例如组成型启动子或胁迫应答启动子，例如rab17、rd29A、rip2、mlip15或ryeCBF31。然后这个构建体可通过以下程序引入玉米细胞。

未成熟的玉米胚解剖自发育中的颖果。授粉后10-11天当它们的长为1.0-1.5mm时分离胚。然后将所述胚轴侧朝下放置，并与N6固体琼脂糖培养基接触(Chu，et al.，(1985)Sci.Sin.Peking 18：659-668)。所述胚置于27℃的黑暗中。松散型胚发生愈伤组织(其由具有载于胚柄结构上的体细胞原胚状体和胚状体的未分化的细胞团组成)从这些未成熟胚的盾片增殖。分离自最初外植体的胚发生愈伤组织可以培养在N6培养基上并在这种培养基上每2-3周继代培养。

质粒p35S/Ac(Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)或等效物可被用于转化实验以提供选择性标记。所述质粒包含编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)的Pat基因(见欧洲专利公开号0242236)。所述酶PAT赋予对诸如草丁膦的草本谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性。P35S/Ac中的pat基因受来自花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)和来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区域的控制。

颗粒轰击方法(Klein，et al.，(1987)Nature 327：70-73)可以用于向愈伤组织培养细胞转移基因。根据这一方法，金颗粒(直径1μm)使用以下技术以DNA包被。10μg质粒DNA被加入到50μL金颗粒悬浮液中(60mg/mL)。氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺自由基(20μL的1.0M溶液)被加入到所述颗粒。加入这些溶液时涡旋所述悬浮液。10分钟后，短暂离心管子(5秒在15,000rpm)并移除上清。所述颗粒重悬浮于200μL无水乙醇，再次离心并移除上清。再次进行乙醇漂洗并将所述颗粒重悬浮于30μL终体积的乙醇。等份试样(5μL)的DNA包被的金颗粒可被放置于Kapton飞盘(Kapton flying disc)(Bio-Rad Labs)的中心。所述颗粒以生物弹道PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)加速进入谷粒组织，使用1000psi氦气压力，0.5cm间隙距离和1.0cm飞行距离。

用于轰击，将所述胚发生组织放置于N6固体琼脂糖培养基上面的滤纸上。所述组织像薄草坪那样排布并覆盖直径约5cm的圆区域。包含所述组织的皮氏培养皿可被放置在PDS-1000/He的室中大约离终止屏8cm处。该室中的空气被抽至真空度28英寸Hg。以氦气冲击波加速大载体(macrocarrier)，使用当震激管内He压力达到1000psi时破裂的防爆膜。

轰击后七天，所述组织可被转移至含有草铵膦(2mg每升)并且缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基中。所述组织在此培养基继续缓慢生长。额外两周后，所述组织可被转移至含有草铵膦的新鲜N6培养基。6周后，直径约1cm的活跃生长的愈伤组织区域可以在一些包含草铵膦补加培养基的平板上鉴定。这些愈伤组织在选择性培养基上继代培养时可以继续生长。

植物可以从转基因愈伤组织再生，其通过首先将组织簇转移至补加0.2mg每升的2，4-D的N6培养基上。两周后，所述组织可被转移至再生培养基。(Fromm，et al.，(1990)Bio/Technology 8：833-839)。

实施例2.在双子叶植物细胞中表达转基因

大豆胚以包含可操作地连接启动子的CBF多核苷酸的质粒轰击，如下。为诱导体细胞胚，3-5mm长的子叶解剖自表面消毒的大豆栽培种A2872的未成熟种子，然后在适当的琼脂培养基上置于26℃光照或暗中培养6-10周。然后切离产生次级胚的体细胞胚，并将其放置于合适的液体培养基。反复的选择繁殖为早期、球形阶段胚的体细胞胚簇以后，所述悬浮液如下述保持。

大豆胚发生悬浮培养物可以保持于在旋转振荡器上的35mL液体培养基，150rpm、26℃、按16∶8小时昼/夜时刻表荧光灯光照。培养物每两周通过接种大约35mg组织至35mL液体培养基继代培养。

然后大豆胚发生悬浮培养物可以通过颗粒枪轰击方法转化(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利号4,945,050)。DuPont生物弹道PDS1000/HE设备(氦改型)可被用于这些转化。

可用于促进大豆转化的选择性标记基因是由来自花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz，et al.，(1983)Gene25：179-188)、和来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区域组成的转基因。所述包含可操作地连接启动子的感兴趣的序列的表达盒可以分离为限制性片段。然后所述片段可被插入到携带所述标记基因的载体的独特限制性位点。

在50μL的60mg/ml 1μm金颗粒悬浮液中加入(按顺序)：5μLDNA(1μg/μL)，20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl₂(2.5M)。然后搅动所述颗粒制剂3分钟，在微量离心机中旋转10秒并移除上清。然后以400μL70％乙醇漂洗一次所述DNA包被的颗粒，并将其重悬于40μL无水乙醇。所述DNA/颗粒悬浮液可以超声粉碎3次，每次1秒。然后将5微升所述DNA包被金颗粒装载至每个大载体盘。

约300-400mg两周龄的悬浮培养物被放置于空的60×15mm皮式培养皿中并以吸管从组织移除残存的液体。对于每次转化实验，通常轰击约5-10盘组织。膜破裂压力设定为1100psi，转化室被抽至真空度28英寸汞。所述组织放置于离保留屏约3.5英寸处并轰击3次。轰击之后，所述组织被分为两份并放回至液体并如上述培养。

轰击后5-7天，液体培养基可以替换为新鲜培养基，并且轰击后11-12天替换为包含50mg/mL潮霉素的新鲜培养基。这种选择培养基可以每周更新。轰击后7-8周后，可以观察到从未转化的、坏死的胚发生簇中生长的绿色的被转化的组织。将分离的绿色组织转移并接种于单独的烧瓶，以产生新的无性繁殖的被转化的胚发生悬浮培养物。每个新系可以视为单独的转化事件。然后这些悬浮液可以继代培养并保持为未成熟胚簇或通过个体体细胞胚的成熟和萌发再生成完整植株。

实施例3.通过计算机同源搜索鉴定基因

基因一致性可以通过在默认参数下进行BLAST(基本局部比对搜索工具；Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；也见，信息可获自NCBI(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，美国国家医学图书馆(US National Library of Medicine)，8600Rockville Pike，Bethesda，Maryland 20894))搜索与包含于BLAST“nr”数据库中的序列(包含所有非冗余GenBank CDS翻译、源自三维结构Brookhaven蛋白数据库、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的最新主要版本的序列)的相似性而确定。所述cDNA序列通过BLASTN程序分析与包含在“nr”数据库的所有可公开获得的DNA序列的相似性。所述DNA序列以所有阅读框翻译并通过NCBI提供的BLASTX程序(Gish和States，(1993)Nature Genetics 3：266-272)比较与包含在“nr”数据库的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。在一些情况下，包含DNA重叠片段的来自两个或更多个克隆的测序数据被用于构建邻接的DNA序列。

序列比对和百分比一致性计算可以通过软件进行，所述软件例如GAP、BestFit、PileUp或Pretty，其作为Accelrys，Inc.，San Diego，CA的

Wisconsin Package^TM的一部分而可获得。通过GAP和BestFit进行多核苷酸序列成对比对的默认参数是空位生成罚分＝50、空位延伸罚分＝3、nwsgapdna.cmp为得分矩阵。通过GAP和BestFit进行多肽序列成对比对的默认参数是空位生成罚分＝8、空位延伸罚分＝2、BLOSUM62为得分矩阵。多核苷酸或多肽比对末端的空位没有罚分。

通过PileUp和Pretty进行多核苷酸序列比较的默认参数是空位生成罚分＝5、空位延伸罚分＝1。通过PileUp和Pretty进行多肽序列比较的默认参数是空位生成罚分＝8、空位延伸罚分＝2、BLOSUM62为得分矩阵。

序列比对也可以通过LASERGENE生物信息学计算机套装(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序完成。序列多重比对可以通过Clustal比对方法(Higgins and Sharp，(1989)CABIOS.5：151-153)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。通过Clustal方法进行的成对比对的默认参数是KTUPLE 1、空位罚分＝3、窗＝5和保存的对角线＝5。

其他成对比较工具也可使用，并被本领域技术人员知道。

实施例4.标准农杆菌转化操作步骤

对于农杆菌介导的玉米转化，使用了Zhao的方法(美国专利号5,981,840和PCT专利公开号WO98/32326，通过引用将其内容并入本文)。简要地，从玉米分离未成熟的胚胎，并将所述胚胎浸入到农杆菌悬浮液，其中细菌能够将感兴趣的基因转移进至少一个未成熟胚胎的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。然后将胚胎与农杆菌在固体培养基上共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在共培养步骤，被感染的胚胎在20℃培养3天，然后在26℃培养4天。这个共培养时期之后，涉及任选的“静息(resting)”步骤，其中所述胚胎在至少一种已知的抑制农杆菌生长的抗生素存在下、在不加植物转化体选择剂的情况下培育(步骤3：静息步骤)。基于颜色标记的瞬时表达在共培养和静息步骤可以监测到。然后，接种的胚在包含有选择试剂的培养基上培养，并重获生长的被转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。最后，生长在选择培养基上的愈伤组织在固体培养基上培养，以再生被转化的植物(步骤5：再生步骤)。

实施例5.多个玉米CBF多肽的鉴定和种系发生

如实施例3所述，生物信息学搜索工具可被用于鉴定具有共同序列或序列元件的多核苷酸或多肽。使用ZmCBF1和ZmCBF2序列(SEQ IDNOS：1-4)，进行TIGR GSS组件4.0的这类搜索。通过这种方式鉴定了17个玉米CBF或CBF样序列。

将玉米CBF蛋白质序列与拟南芥属和黑麦CBF序列比对。通过比对，产生1000半删除折叠刀(half-delete jackknife)序列改变数据集，并将其用于产生1000邻位相连的系统发生树。然后将从这些中得到的一致性树运行通过Phylip的极大可能性(Maximun-Likelihood)程序，从而产生具有以氨基酸替换距离为标尺的分支长度的树。基于该树，所有玉米序列处于与拟南芥属序列分开的进化枝中。然而，所述玉米序列进化枝与拟南芥CBF和At5g51990进化枝形成100％支持的分组。该分组表明有4个拟南芥CBF型蛋白质和10个玉米CBF型蛋白质。

实施例6.ZmCBF基因表达分析

对于基因ZmCBF3、CBF4-CBF9和CBF11，通过大规模平行测序技术(MPSS，

Hayward，California；前称Solexa)进行表达谱分析。ZmCBF1、ZmCBF2和CBF10没有可用的合适的标记标签。

结果显示在图4。CBF样7在冷冻的幼苗中的表达特异地高于对照；见图4的第5页，csdlllm-chil对csdlllm-ctr。CBF5和CBF7在干旱胁迫花梗中的表达特异高于对照；见图4的第4页，cpdl-drg对cpdl-ctr。

实施例7.ZmCBF12表达数据

对所有组织文库的分析表明，ZmCBF12在所有组织、即营养性、生殖性和根中表达，并且发现其可被生物和非生物胁迫诱导。如所有MPSS文库报告的，该基因的表达在玉米整个籽粒中最高为550ppm。其在干旱胁迫的玉米花梗中的表达相对于对照高四倍，在ABA处理的叶子和细胞分裂素处理的叶盘中相对于对照几乎高三倍，以及在从冷冻处理恢复的幼苗组织中相对于在最适温度的对照幼苗高两倍。这指示该基因在胁迫耐受中的潜在意义。

提供上述实施例是对本发明举例说明而非限制其范围。本发明的其他变形会容易地被本领域普通技术人员明白并包含于随附的权利要求书中。

说明书中引用的所有出版物和专利申请指示了本发明所属技术领域技术人员的技术水平。将本文引用的所有出版物、专利、专利申请和计算机程序通过引用并入本文至如同具体和单独地指示通过引用并入本文的相同程度。