CN101977622A - 增加角膜上皮的通透性和使基质胶原纤维网络不稳定的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了增加角膜上皮的通透性以促进物质扩散至角膜基质中的方法以及使基质的胶原纤维网络暂时不稳定的方法。这些方法结合使用打开了上皮，以促进稳定分子扩散至基质中并使桥接分子与基质胶原纤维分离，由此引起胶原纤维网络通过稳定分子重新稳定。这些方法可以用于提高矫正近视、远视和散光的非侵入性角膜矫正(如角膜曲率矫正)的有效性和寿命。

Description

增加角膜上皮的通透性和使基质胶原纤维网络不稳定的方法
本申请要求享有2008年3月24日提交的美国临时申请No.61/064,730和2008年3月24日提交的美国临时申请61/064,731的优先权，通过引用将它们全部并入本说明书中。
发明领域
本公开内容涉及增加角膜上皮的通透性以允许分子例如胶原结合性分子扩散至角膜基质中的方法，并涉及使基质的胶原纤维网络暂时不稳定的方法。在此所述的处理(1)打开了上皮，以增强分子扩散至基质中和(2)使桥接分子与基质胶原纤维分离，由此引起胶原纤维网络通过稳定分子重新稳定。该处理对提高用于矫正近视、远视和散光的非入侵性角膜矫形的有效性和寿命是重要的。
背景
角膜曲率矫正(orthokeratology)方法：角膜曲率矫正术是改善眼睛屈光不正的非外科手术方法，并且是例如激光眼睛手术的替换方案。具体地说，角膜曲率矫正术是矫正患者角膜的曲率的治疗性方法。常规的角膜曲率矫正方法包括使用一系列渐进性接触透镜，该接触透镜用于逐渐矫正角膜并产生更球形的前曲率。该方法典型地包括配戴两副至多至几副特别设计的接触透镜，并且通常需要大约三至六个月来实现光学矫正。已经证明该方法能减轻或消除近视和散光，因此提高裸眼视力并产生屈光正常(一种视力经历零屈光不正的状态，或不需要矫正的状态)。角膜矫正透镜设计的最新改进使其可以更快得多地实现屈光正常。在许多情况中，一个晚上戴着一副最终结果透镜就可以实现屈光正常。
角膜曲率矫正术的局限性在于经过矫正的角膜组织保持其最初曲率的记忆，并在除去所述透镜后，趋于松弛并恢复至最初的曲率。因此，当角膜曲率矫正的患者达到最大结果时，要求定时戴着保持器接触透镜，以稳定结果。保持器接触透镜通常由刚性透气的材料制得。角膜曲率矫正的患者不断增加地在夜间戴着保持器接触透镜，以快速获得所期望的结果，并且在他们的白天活动中享受几乎屈光正常的视力。这种形态的缺陷在于为了防止角膜恢复为其早前的形状，需要每天晚上戴着保持器透镜。
角膜成形术(corneoplasty)：针对解决该问题的相关方法使用角膜软化剂以暂时软化角膜，使其可以更容易地被矫形至所需的构造以产生屈光正常。该角膜成形方法是一种在一次就诊或在几周期间进行的三步方法。该三步方法包括：首先，将软化剂应用于角膜，以软化角膜组织；第二，将刚性接触透镜置于角膜上，使得眼睛屈光正常；第三，应用稳定剂。然后角膜将矫形并与由刚性接触透镜支配的所需构造相适应。角膜软化剂的施用有助于在较短的时间内矫正较大的屈光不正。
然而，已经发现难以相对于视力轴精确地放置成形接触透镜来控制角膜组织的矫形。在一些不成功的应用中，由于误放成形接触透镜引起的误差，角膜成形术诱发了散光或复视。此外，因为所有三个步骤是在一次就诊时进行的，患者没有机会对矫形的角膜组织的结果作出反应。在该方法期间，患者不能“尝试并看见”或引到临床医师来帮助获得更好的结果。
根据上述内容，对进行敏度矫正方法的改进方法存在需求，该方法能够使患者快速达到屈光正常，同时保留回复至其先前视力水平的选择，例如，使得该方法是可逆的，直至患者选择进行永久矫正。此外，对稳定角膜基质的组合物以及制备和应用该组合物的方法存在需求。该组合物需要能够使由角膜曲率矫正方法产生的角膜曲率稳定，使得角膜曲率矫正的患者可以省却配戴保持器接触透镜，省却应用软化剂，并且仍然保留恢复至最初角膜曲率的机会，直至患者确信他们想要永久性矫正。
美国专利6,161,544和6,946,440描述了在角膜曲率矫正术后应用稳定角膜的分子。在美国专利6,946,440(DeWoolfson和DeVore)中，所述稳定分子是相对高分子量的、天然的、胞外基质分子，其在角膜曲率矫正术后使基质稳定。由于这些分子在邻近胶原原纤维之间的离子型结合，在这些纤维之间形成了交联(或桥)，产生了稳定作用。然而，由于内在的连接上皮组织层形成紧密连接，对大于500道尔顿的亲水性分子的眼部传送具有高抵抗性，这些胞外基质分子的渗透受到限制。此外，因为所述位置固有地被天然胞外基质分子占据，所以胶原纤维上的外源性稳定分子的结合位点是有限的。
因此，为了增强稳定剂的传送并由此使基质稳定最大化，需要方法以(1)打开上皮，以允许稳定剂渗透到基质内，并且(2)使基质组织中邻近胶原纤维之间胞外分子的内在结合解离。打开上皮的方法也是有益的，因为它们可以用于增强任何眼用药物传送至角膜基质。
角膜解剖学
人的角膜由三个主要的层构成：上皮、基质和内皮。角膜的厚度通常为500-600μm，90％是基质。上皮厚大约50μm，并含有5-6层细胞，细胞之间具有紧密连接，尤其是最初2层扁平的、平板样的表面细胞。接下来的2-3层含有翅样的或多边形细胞，在单排柱状基细胞之上。
上皮形成通透屏障，尤其是对极性和离子型分子的通透屏障。对于离子型和亲水性分子，分子大小影响它们透过上皮的能力。这些分子的通透性通常限于约500道尔顿的分子大小。(参见Liaw和Robinson，见“Ophthalmic Drug Delivery Systems”(眼药传送系统)，A.K.Mitra编辑，Marcel Dekker，Inc.NY，1993)。相反，亲脂性分析容易通过上皮吸收。
接着上皮下面的屏障是Bowman’s膜。Bowman’s膜是一个8-14μm厚的均质薄层，其将上皮与下面的无细胞基质(substantia propria)分开。
基质由200-250个交替的胶原纤维的薄片(层)构成。每个薄片厚为约1μm，宽为10-25μm。基质含有70％的水，并阻止大于约500,000道尔顿的分子的移动。胶原纤维构成角膜结构的大部分。蛋白聚糖和纤维缔合的胶原连接至胶原纤维，以控制直径和稳定基质结构。纤维缔合的蛋白聚糖包括被称为小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)的一类蛋白聚糖，并包括饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、mimican和纤调蛋白聚糖。纤维缔合的胶原包括被称为与具有间断的三螺旋的原纤维缔合的胶原分子(FACIT)的一类胶原，并包括VI型、X型、XII型和XIV型胶原。
足够高浓度的某些赋形剂可以损害角膜的完整性，所述赋形剂包括防腐剂(苯扎氯铵)，阳离子型表面活性剂和螯合剂(0.5％EDTA)。
Godbey(p 102)使用0.02％西吡氯铵破坏了上皮细胞的顶层。Shih和Lee(p86)通过用洋地黄皂苷预先处理角膜，使上皮的上面2层剥落，剥离了上皮层。发现这种处理能增强噻吗咯尔的渗透。
其它渗透增强剂包括松胞菌素B(一种细胞骨架调节剂)。
通透性差的亲水性分子的传送目前依赖于非角膜渗透。非角膜的吸收途径包括穿过巩膜和结膜渗透进入眼内组织。这是一种低效的将药剂传送至角膜的方法，因为当药剂渗透远离角膜-巩膜边缘的眼睛表面时，它被局部毛细血管床吸收并通过全身循环被除去。通常，根据非角膜吸收，低于1％的眼用溶液到达房水。关于与眼用药物传送相关的一些困难的综述，参见Shirasaki，Y.“用于增强眼部渗透的分子设计(Molecular Design for Enhancement of Ocular Penetration)”，J.Pharm.Sci.，2007年10月7日(印刷前电子公开)；1-35。
角膜吸收代表一种更有效的传送眼内药物的途径，但是这种途径受角膜上皮的限速。因此，需要增强经上皮的渗透，特别是较大亲水性分子经上皮的渗透，以提供药物和其它物质至角膜基质的有效眼内传送。
因此，本公开内容提供了使用破坏上皮细胞连接的药剂处理角膜的方法。这种破坏使得分子可以经上皮扩散，否则该分子只能低效地进入角膜。此外，这些相同药剂中的一些(由于其小的分子大小(＜500道尔顿)，它们自由穿过上皮)渗透角膜基质并与胶原纤维网络上的去质子化胺基团反应，导致胶原纤维之间离子结合的蛋白聚糖桥解离。这使得纤维网络暂时不稳定，并引发纤维网络以新的、所期望的形状重新稳定。可以将稳定分子(如饰胶蛋白聚糖)应用于角膜表面。所述分子渗透上皮并与基质中的邻近胶原纤维结合，将角膜以其新的形状固定，以治疗近视、远视和/或散光。
已知多种化学物质与蛋白质反应，改变它们的化学和物理特征。通常，这些化学物质用于修饰溶液中的蛋白质。可以获得几篇讨论化学修饰的综述，包括Chemical Reagents for Protein Modification(用于蛋白质修饰的化学试剂)，R L Lunblad编辑，CRC Presss，Boca Raton，1991和G R Stark，Recent Development In Chemical Modification And Sequential Degradation Of Proteins(蛋白质的化学修饰和连续降解中的最新进展)，Advances in Protein Chemistry，24：261-308，1970。特定的化学试剂与蛋白质上去质子化的游离胺反应，用呈现出负电荷或中性电荷的化学部分替代正(NH3 +)电荷。其它化学试剂与蛋白质上的去质子化胺反应，用两个正电荷替代一个正电荷。这种静电荷和电荷密度的变化改变了蛋白质的化学特征和物理特征二者。在未决专利公开(DeVore等，美国公开20050106270)中描述了这种技术。
对于本公开内容的目的，可以使用广泛多种试剂中的任何一种来破坏上皮细胞连接并使基质胶原纤维之间的蛋白聚糖桥解离。在授予DeVore等的美国专利中描述了使完整结缔组织不稳定的已知化学试剂。
美国专利No.4,969,912(Kelman & Devore)描述了使用酰化剂形成医疗植入物，溶解或部分溶解胶原组织的方法。美国专利6,743,435(DeVore & Ciaramentaro)描述了使用酰化剂分散完整动物组织的方法。
美国专利6,161,544(DeVore和Oefinger)描述了使用酰化剂(如戊二酐)使角膜组织不稳定的方法。专利申请20050106270(DeVore和DeVore)描述了使用酰化剂改变完整组织的化学和物理特征的方法。尽管这些专利描述了化学酰化剂用于溶解、分散和改变完整的组织的用途，但它们没有描述这些试剂用于使角膜上皮连接解离和/或使角膜基质中邻近胶原纤维之间的蛋白聚糖桥解离的用途。
发明概述
本公开内容描述了用破坏上皮细胞连接的物质处理角膜的方法。这些方法可以用于增强任意目标分子(如用于治疗青光眼的眼用药物和用于角膜矫形中的稳定剂)的眼部传送。本公开内容还描述了用使桥接分子与角膜基质中胶原纤维单元解离的物质处理角膜的方法。该方法有助于稳定经过矫形的角膜曲率，如角膜曲率矫正术产生的曲率。
在破坏上皮细胞连接的方法中和使桥接分子解离的方法中所用的物质由于其小的分子大小(＜500道尔顿)而自由穿过上皮。具有去质子化胺的物质的反应性使胶原纤维网络不稳定，由此使用外源性应用的稳定分子使网络重新稳定。上皮细胞连接的破坏使相对大的稳定分子能有效地渗透上皮并与基质中的邻近胶原纤维结合，将角膜以所限定的形状固定。由角膜曲率矫正术等方法产生的经过矫形的角膜曲率的稳定将为病况例如近视、远视和散光提供长期的、非入侵性的治疗。
因此，本公开内容的目的是提供处理角膜的方法，该方法导致上皮细胞连接的破坏，以促进分子扩散至角膜基质中。这些方法适合于促进任意目标分子进入角膜中。在一些实施方案中，那些分子还使离子结合的桥接分子与基质胶原纤维解离，使基质胶原网络暂时不稳定，使得网络可以以所期望的形状重新稳定。所述方法可以包括给予治疗有效量的在生理学上可接受的溶液中的一种物质，以既破坏上皮细胞连接又使离子键桥与基质胶原纤维解离。然而，在其它实施方案中，所述方法包括给予治疗有效量的在生理学上可接受的溶液中的第一种物质，以破坏上皮细胞连接，促进分子扩散至角膜基质中，然后再给予在生理学上可接受的溶液中的第二种物质，以使离子结合的桥接分子与基质胶原纤维解离，使该基质胶原网络暂时不稳定，使得该网络可以以所期望的形状重新稳定。在任意一个所公开的方法中，也可以将角膜初步准备，用于给予能够离子桥接基质中的邻近胶原纤维的物质，以其经过矫形的形状稳定角膜。所公开的方法可以单独、组合或与其它方法组合，用于治疗近视、远视或散光。
在一个实施方案中，本公开内容提供了稳定角膜形状的方法，其中该方法包括将破坏角膜上皮连接的物质(“破坏剂”)应用于该角膜并将使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质(“解离剂”)应用于该角膜；然后应用使基质胶原网络重新稳定的物质，由此使该角膜的形状稳定。在一些实施方案中，使用角膜曲率矫正方法将角膜矫形。
在其它实施方案中，本公开内容提供了增强眼用药物传送的方法，该方法包括在应用所述眼用药物之前，将破坏角膜上皮连接的物质应用于角膜。可以使用适用于角膜表面的施药器应用眼用药物、破坏角膜上皮连接的物质或眼用药物和破坏角膜上皮连接的物质二者。与其它方法一致，该方法可以进一步包括在应用眼用药物之前，将使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质应用于角膜。所述眼用药物可以是任何眼用药物，但通常是亲水性眼用药物。
在上述各种方法的每种方法中，所述破坏剂可以是酸酐，并且所述解离剂可以是酸酐、酰基氯、磺酰氯或磺酸。在特定的实施方案中，所述破坏剂选自马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐或酞酸酐。相似地，在特定的实施方案中，所述解离剂选自乙酸酐、丁酸酐或丙酸酐。在包括应用稳定剂的那些方法中，根据特定的实施方案，所述稳定剂可以是饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、mimican、纤调蛋白聚糖、VI型胶原、X型胶原、XII型胶原或XIV型胶原。在特定的实施方案中，所述稳定剂是人重组饰胶蛋白聚糖。
将之前的描述结合所附的说明性附图考虑时，本发明的其它目的，特征和优点将变得清楚。
附图简述
图1显示了将饰胶蛋白聚糖直接受控应用于中央角膜后，荧光标记的饰胶蛋白聚糖向角膜中的渗透。图1A显示了用戊二酸酐预处理的角膜。图1B显示了对照角膜。
图2显示了将饰胶蛋白聚糖直接受控应用于中央角膜后，荧光标记的饰胶蛋白聚糖向角膜中的渗透。图2A显示了用乙酸酐预处理的角膜。图2B显示了对照角膜。
图3显示了角膜的透射电子显微照片。在图3A中，给角膜补充了饰胶蛋白聚糖处理。图3B显示了对照角膜。
图4显示了角膜的透射电子显微照片。图4A显示了胶原纤维之间的蛋白聚糖连接。这些连接在酰化处理的角膜中不存在，如图4B和4C中所示。
详细描述
本公开内容提供了增加角膜上皮的通透性，以促进分子(如胶原结合性分子或各种眼用药物)扩散至角膜基质中的方法。应当注意的是，尽管“药物”在其它上下文中可以具有特定的含义，但如在此所用的，其是用于包括有意应用于眼部的任何药剂(不管是化学药剂，还是生物药剂)的一般性术语。
如已经提及并且在Shirasaki，Y.“Molecular Design for Enhancement of Ocular Penetration”，J.Pharm.Sci.，2007年10月7日(印刷前电子公开)；1-35中综述的，存在限制药物吸收至眼睛前段的显著屏障。此外，局部应用的药物受到泪液的稀释，并且通过眼泪流转和眨眼快速除去。因此，通常，在局部应用后，只有1-7％剂量的药物进入房水中。泪膜中的药物通过角膜和非角膜途径吸收。角膜渗透可以通过经细胞吸收或通过细胞旁(paracellular)吸收而发生，但大部分药物通过经细胞吸收而渗透至角膜中。在这种途径中，药物被上皮细胞吸收并通过细胞质而被转运。相反，细胞旁吸收包括通过个体细胞之间存在的连接(juncture)的转运。但是由于角膜上皮呈现出如此紧密的连接，细胞旁的通透性是有限的。因此，药物通过结膜和巩膜。
大部分小分子量的、亲脂性的药物通过角膜途径吸收。然而，角膜是非常紧密的组织，并且角膜上皮是亲脂性的膜，具有紧密的连接，该连接充当药物吸收的屏障。因此，即使亲脂性药物可以通过亲脂性角膜上皮，其通过基质的渗透将是有限的，因为基质是亲水性的。疏水性的药物在渗透亲脂性的角膜上皮中遭遇困难。
因此，在本领域中存在提供更有效的眼用药物传递的需求。本公开内容提供了增加上皮通透性的方法。这增强了化合物(包括亲水性化合物和高分子量化合物)传送至房水。使用该技术，某些具有低上皮通透性的亲水性药物将具有显著提高的功效。
尽管该方法可以用于增强任何眼用药物的传送，但提及通常被用作眼用药物的几类化合物。一类这样的眼用药物是抗病毒药。在抗病毒药中，由于亲水性的性质而具有低眼部通透性的药物，如阿昔洛韦和更昔洛韦，可能特别得益于所公开的增强眼用药物传递的方法。另一类眼用药物是抗炎药。实例包括非甾族的抗炎药(NSAID)，如双氯芬酸，溴芬酸，氟比洛芬，普拉洛芬，奈帕芬胺和酮咯酸氨丁三醇，和类固醇，如泼尼松龙和地塞米松。抗青光眼药也是另一类眼用药物。这些包括：碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺，醋甲唑胺和依索唑胺；某些具有低角膜渗透系数的β-阻断剂，如醋丁洛尔，纳多洛尔，阿替洛尔和索他洛尔；α2-激动剂，如阿可乐定；以及被修饰用于降低在泪液中离子化的前列腺素F2α衍生物。抗感染药也是另一类眼用药物，包括具有低角膜通透性的实例。抗感染药的一些非限制性实例是喹诺酮类，如环丙沙星。过敏药也是另一类眼用药物。眼用药物的其它实例可以在Shirasaki，Y.“Molecular Design for Enhancement of Ocular Penetration”，J.Pharm.Sci.，2007年10月7日(印刷前电子公开)；1-35中找到。
本公开内容还提供了使基质的胶原纤维网络暂时不稳定的方法。这些方法常常结合破坏上皮细胞连接的方法来使用，尽管本公开内容也考虑到它们可以单独使用。基质的暂时去稳定化有助于其以新的形状(例如提高视觉敏度的形状)重新稳定。因此，除了其它方法，本公开内容提供了如下的方法：(1)破坏角膜上皮细胞连接，以促进物质(包括可以稳定胶原纤维的高分子量物质)的经上皮扩散和基质渗透和(2)使基质胶原纤维之间的分子桥解离，促使胶原网络通过外源性应用的稳定分子重新稳定。
在许多实施方案中，这些方法包括将治疗有效量的酰化或乙酰化试剂应用于眼睛角膜的表面。如在下文更详细讨论的，酰化剂或乙酰化剂包括酸酐、酰基氯、磺酰氯和磺酸。
通常，在用溶液处理角膜使角膜蛋白上的游离胺去质子化后，将所述物质应用至角膜的表面。去质子化溶液呈现出7.5-10.0的pH范围，通常为8.0-9.0，并且常常为8.3-8.7。它们通常包括呈现出所期望范围中pH的缓冲液和盐溶液，例如缓冲剂，其为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠混合物，或单独为磷酸二钠。缓冲剂和溶液的浓度范围为0.05-1.0M，常常为0.1-0.7M，通常为0.2至0.5M。
可以将所述方法实践中所用的各种溶液应用于眼睛，不需对它们接触的眼睛组织进行任何限制。然而，常常使用置于角膜表面的装置给予去质子化溶液和含有破坏剂和/或解离剂的溶液，以限制角膜表面暴露。用于将溶液应用至角膜表面的施药器的非限制性实例描述在2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置(APPARATUS TO IMPROVE LOCALIZED CONCENTRATION OF FLUIDS IN OCULAR ENVIRONMENTS)”的共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中，通过引用将其全部内容并入本说明书。
当将酰化剂或乙酰化剂用于破坏上皮细胞连接时，它可以是用负电荷替代负电荷的酰化剂或乙酰化剂、用中性电荷替代正电荷的酰化剂或乙酰化剂、或用两个正电荷替代一个正电荷的酰化剂或乙酰化剂。
当将酰化剂或乙酰化剂用于使基质胶原纤维之间的分子桥解离时，它可以是用中性电荷替代负电荷的任何酰化剂或乙酰化剂。这有助于防止增加的蛋白水合和随后的角膜肿胀。
稳定角膜的形状是重要的一个领域是在角膜曲率矫正方法之后。因此，本公开内容还提供了在角膜曲率矫正方法之后，稳定人角膜的方法。这些方法包括破坏角膜上皮细胞连接，以促进高分子量的物质经上皮扩散和基质渗透，稳定胶原纤维并使基质胶原纤维之间的分子桥解离，促使胶原网络通过外源性应用的稳定分子重新稳定。在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的酰化试剂或乙酰化试剂应用于眼睛角膜的表面。在破坏和解离后，然后将稳定剂应用于角膜，以渗透基质并使基质胶原网络以角膜曲率矫正术所形成的形状重新稳定。理想地，这种方法产生屈光正常。
在所公开的方法中使用的稳定剂可以是可外部应用，稳定基质胶原网络的任何分子。然而，所述稳定剂通常是小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(SLRP)，其包括饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、mimican和纤调蛋白聚糖，或具有间断的三螺旋的原纤维缔合的胶原分子(FACIT)，其包括VI型、X型、XII型和XIV型胶原。通常，所述稳定分子是人重组饰胶蛋白聚糖。通常在溶液中应用饰胶蛋白聚糖，其中人重组饰胶蛋白聚糖溶液的浓度为约0.05至约25mg/mL。通常，浓度为约1至约10mg/mL，并且常常为约2至约6mg/mL。应用稳定剂(如人重组饰胶蛋白聚糖)所用的体积范围通常为约0.05至5mL。常常为约0.1至约2.0mL，并且在许多情况中，体积为约0.2至约1.0mL。
破坏上皮细胞连接和使胶原纤维之间的分子桥解离的化学物质
对本公开内容的目的来说，存在广泛多种可以用于破坏上皮细胞连接和/或使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质。在所公开的方法中，破坏角膜上皮连接的物质可以称为“破坏剂”。相似地，使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质可以称为“解离剂”。
已经报道了破坏上皮细胞连接的化学物质和药物包括EDTA、高碘酸盐、高浓度脲化合物、氯化镁和有机溶剂。然而，存在有限数量的已经报道能够分散完整组织或使分子键合性分子与其它组织成分解离的物质(例如，酰化剂，参见DeVore等，专利)。例如，Neefe的美国专利No.3,760,807，3,776,230和3,831,604共同描述了化学物质如盐酸丙对卡因、盐酸达克罗宁、氯在溶液中的应用，以及全部蛋白水解酶用于软化角膜的胶原组织的应用。此外，Harris的美国专利描述了酶(如透明质酸酶)用于软化角膜胶原组织的应用。还有，Kelman和DeVore的美国专利No.4,713,446，4,851,513，4,969,912，5,201,764，5,354,336和5,492,135以及DeVore专利申请公开20050106270各自描述了各种用于处理和/或软化用于眼科使用的天然和人造的基于胶原的材料的化学物质。通过引用将所有这些专利关于化学去稳定剂的教导并入本说明书。尽管并入本说明书，但这些专利的教导不意味着限制术语去稳定剂的范围，并且其中所列出的清单不意味着是限制性的。
因此，存在几种已经报道了能破坏上皮细胞连接的化学物质和药剂。然而，只存在有限数量的已经报道了能分散完整组织的物质(例如，酰化剂，参见DeVore等，专利)。产生这些作用的试剂家族包括酸酐、酰基氯、磺酰氯和磺酸。但是，没有报道既破坏上皮细胞连接，又使基质胶原纤维之间存在的分子桥(例如，FACITS和SLRPS)解离的物质。因此，用于破坏上皮细胞连接的物质通常与用于使FACITS和ALRPS与基质胶原纤维解离的物质是不同的。然而，本公开内容还明确地考虑使用相同的物质来实现这两种功能。
打算将以下的物质列表作为破坏上皮细胞连接和/或使FACITS和SLRPS与基质胶原纤维解离的物质类型的代表。这些列表只是示例性的，并且不意味着是限制性的。
对于上皮细胞破坏，合适的酸酐包括将净电荷从正变成负的物质。这些物质包括，但不限于，酸酐，包括马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐、酞酸酐和许多其它这类酸酐。酰基氯包括，但不限于，草酰氯、丙二酰氯和许多其它酰基氯。磺酰氯包括，但不限于，氯磺酰乙酰氯、氯磺酰苯甲酸、4-氯-3-(氯磺酰基)-5-硝基苯甲酸、3-(氯磺酰基)-对茴香酸等。磺酸包括，但不限于，3-磺基苯甲酸等。
其它物质可以将每个反应位点的净电荷从一个正电荷变成两个负电荷。这类物质的实例包括，但不限于，3，5-二羧基-苯磺酰氯等。
还有其它物质可以用于将每个反应位点的净电荷从正电荷变成中性。那些物质的实例包括，但不限于，酸酐，包括乙酸酐、氯乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、异丁酸酐、异戊酸酐、己酸酐和其它酸酐；酰基氯，包括乙酰氯、丙酰氯、二氯丙酰氯、丁酰氯、异丁酰氯、戊酰氯等；磺酰氯，包括，但不限于，乙烷磺酰氯、甲烷磺酰氯、1-丁烷磺酰氯等。
对于FACITS和/或SLRPS与基质胶原纤维的解离，除了其它物质以外，本公开内容提供了分散组织但不增加组织水合(引起肿胀)或增加生物机械强度的那些物质。
使FACITS和/或SLRPs与基质胶原纤维解离的物质包括将净电荷从正电荷变成负电荷的物质。这些物质包括，但不限于，酸酐、酰基氯、磺酰氯和磺酸。酸酐的实例包括马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐、酞酸酐和许多其它这类酸酐。酰基氯包括，但不限于，草酰氯、丙二酰氯和许多其它酰基氯。磺酰氯包括，但不限于，氯磺酰乙酰氯、氯磺酰苯甲酸、4-氯-3-(氯磺酰基)-5-硝基苯甲酸、3-(氯磺酰基)-对茴香酸等。磺酸试剂包括，但不限于，3-磺酰基苯甲酸等。
其它物质可以将每个反应位点的净电荷从一个正电荷变成两个负电荷。特定的物质包括，但不限于，3，5-二羧基-苯磺酰氯等。
在特定的实施方案中，本公开内容提供了使用普通的酸酐(例如戊二酸酐)破坏上皮细胞连接并使用普通酸酐(例如乙酸酐、丁酸酐或丙酸酐)使FACITS和SLRPS与基质胶原纤维解离的方法。这些酸酐中的每一种水解成无毒的化合物，许多是在中间代谢中常见的。
为了用于所公开的方法中，通常将所述物质稀释于生理学上可接受的微碱性pH的溶液中，如，pH大约8.5的磷酸二钠溶液，或在另一种提供约8.3至约8.8的pH的缓冲液。然后将溶液在置于角膜表面上的施药器中直接应用于角膜表面。用于将溶液应用于角膜表面的施药器的非限制性实例描述在2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中，通过引用将其全部内容并入本说明书。应首先用微碱性pH的溶液或缓冲液引发组织后，将物质应用于组织表面。酰化剂与首先被去质子化的蛋白质反应，或水解成酸。
因此，尽管多种不同的物质可以用作细胞连接破坏剂和基质去稳定剂，但本公开内容集中于这些物质的特定家族，包括酸酐、酰基氯、磺酰氯和磺酸。如上文所提及的，当使用酰化剂时，导致细胞连接破坏的酰化剂的类型可以不同于导致基质胶原纤维之间分子桥的解离但不引起角膜肿胀的酰化剂的类型。后一种类型的物质限于用不带电荷的部分或(带正电荷的部分)替代去质子化胺的那些。已经显示用带负电荷的部分的替代导致被处理的组织“硬化”。
打算将以下物质列表作为使基质胶原纤维之间的分子桥解离的这些物质的类型的代表。该列表只是示例性的，并且不意味着是限制性的。
合适的、但非限制性的潜在酸酐的实例包括：乙酸酐、丙酸酐、甲基丙烯酸酐、丁酸酐、异丁酸酐、戊酸酐、己酸酐、癸酸酐、十二烷酸酐、肉豆蔻酸酐、棕榈酸酐和油酸酐。
合适的、但非限制性的潜在酰基氯的实例包括：丙酰氯、甲基丙烯酰氯、丙烯酰氯、异丁烯酰氯、丁酰氯、异丁酰氯、戊酰氯、异戊酰氯、己酰氯和庚酰氯。
合适的、但非限制性的潜在磺酰氯的实例包括1-十六烷磺酰氯、4-(十六烷氧基)苯磺酰氯、五甲基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、甲苯磺酰氯和2，5二甲基苯磺酰氯。
合适的、但非限制的潜在磺酸的实例包括5-十三烷基-1，2-氧硫杂环戊烷-2，2-二氧化物。以上所列的所有化学物质都可以从Sigma-Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)获得。
在以上的物质中，普通的酸酐，例如，乙酸酐、丁酸酐或丙酸酐，可以用于许多实施方案中，使基质胶原纤维的分子桥解离，因为这些酸酐中的每一种都水解成非常无毒的化合物。
在破坏上皮细胞连接的那些物质中，许多实施方案利用普通的酸酐，例如，马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐、酞酸酐。然而，可以使用许多其它这类酸酐。
尽管可以通过将物质以溶液形式应用于眼睛来应用它们，但吸收的所述途径包括通过巩膜和结膜渗透至眼内组织中。如所讨论的，这是一种将物质传递至角膜的无效方法，因为当物质渗透超过角膜-巩膜边缘的眼睛表面时，其被局部毛细血管床吸收并通过全身循环被除去。通常，低于1％的通过非角膜途径应用的眼用溶液到达房水。
角膜吸收代表了一种更有效的传递眼内药物的途径，但是这种途径受角膜上皮限速。通常，如果有的话，大于约500道尔顿的分子只能无效地渗透上皮。然而，许多用于矫正视觉敏度的方法中的眼用药物和物质的大小大于500道尔顿。对于眼部传递的一般性综述，参见Ophthalmic Drug Delivery Systems(眼用药物传递系统)，编辑：AK Mitra，Marcel Dekker，Inc.，1993。
所公开的破坏上皮细胞连接的方法可以用于促进大于500道尔顿的分子传递至角膜基质。例如，如所讨论的，所述方法可以用于促进人重组饰胶蛋白聚糖(其约为40,000道尔顿)的基质传递。使用所公开的方法，甚至可以传递更大的分子。
还可以通过将含有目标物质的溶液直接施用于适合于角膜表面的施药器中，将其施用至角膜，来提高物质至角膜的传递效率。这种应用技术将角膜的中心核暴露于所述物质，但防止对角膜外周的暴露。通常在处理之前立即将所述物质溶解或稀释于生理学上可接受的溶液中，并置于注射器中用于注入施药器中。用于将溶液应用至角膜表面的施药器的非限制性实例描述在2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中，通过引用将其全部内容并入本说明书。然后将溶液注入施药器中，使角膜表面暴露约2秒钟至约1分钟，常常约15秒钟至约45秒钟，并且通常约25秒钟至约35秒钟。直接的角膜传递可以用于促进任何物质传递至角膜。
如所述的，所述的各种方法可以单独使用，具有不同的益处。因此，例如，破坏上皮细胞连接的方法可以用于促进任何眼用药物或需要基质内传递的其它分子的基质传递。然而，这些方法也可以彼此结合使用，并且甚至作为较大方法的一部分使用。作为说明性的、非限制性的实例，以下顺序被用于破坏上皮细胞连接，以使桥接分子与基质胶原纤维解离并重新稳定角膜结构。
1.应用数滴局部麻醉剂，约2分钟；
2.将预处理缓冲液应用于眼睛，约30秒钟；
3.应用预处理缓冲液中的上皮细胞连接破坏性酸酐试剂，约30秒钟；
4.应用第二次应用预处理缓冲液，约30秒钟；
5.将预处理缓冲液中的分子桥解离性试剂应用于眼睛，约30秒钟；
6.用无菌缓冲液或无菌生理盐水溶液彻底冲洗；
7.应用重新稳定性分子的溶液，约30秒钟；
8.用无菌缓冲液或无菌生理盐水溶液彻底冲洗。
这种一般性方法适用于希望稳定角膜形状的任何情况中。这种应用的一个非限制性实例是角膜曲率矫正术后角膜组织的稳定。
当然，对这种方法的改变是可能的，特别是关于应用时间、缓冲体系和溶液的精确pH。下文讨论用于破坏上皮细胞连接以允许高分子量物质(例如稳定分子)渗透的处理的实例。
实施例1
评价饰胶蛋白聚糖渗透至人供体角膜组织中的共焦显微术
经戊二酸酐处理的角膜的共焦显微镜检查。四个供体角膜获自Insight Biomed(Minneapolis，MN)。所有角膜的病毒污染测试为阴性。由于存储期满、低内皮细胞计数或与上皮细胞完整性和基质结构无关的其它因素，角膜被拒绝用于移植。通过裂隙灯显微术检查所有角膜的上皮细胞完整性。角膜存储在Optisol(Bausch & Lomb)中用于保存。在Dartmouth-Hitchcock医学中心的外科手术研究系，Lebanon，NH进行共焦显微镜检查。两个角膜是未处理的对照，两个是用戊二酸酐处理，接着应用荧光标记的人重组饰胶蛋白聚糖。人重组饰胶蛋白聚糖从CHO-S细胞(Cardinal Health)制得，并在10mMNaPO4缓冲液+150mM NaCl(pH 7.2)中呈现出3.7mg/mL的浓度。使用来自Molecular Probes的标记试剂盒，通过使饰胶蛋白聚糖与Oregon绿488反应，制备荧光标记的饰胶蛋白聚糖。
将所有角膜置于凸面的硅酮垫上，并用针使其牢固。这使得角膜的表面以固定的位置来暴露。使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，给予所有处理溶液。用盐酸丙对卡因处理对照角膜1分钟，接着用0.5mL的0.2M磷酸钠缓冲液(pH 8.3-8.5)处理30秒钟，0.5mL盐水冲洗30秒钟，然后用0.1mL荧光标记的人重组饰胶蛋白聚糖处理。用盐酸丙对卡因处理经处理的角膜1分钟，接着用0.5mL的0.2M磷酸钠缓冲液(pH 8.3-8.5)处理30秒钟，戊二酸酐(在应用前立即以5mg/mL溶解于磷酸钠缓冲液(pH8.3-8.5)中)处理30秒钟，盐水冲洗，然后用0.1mL荧光标记的人重组饰胶蛋白聚糖处理。使用Zeis共焦显微镜(型号LSM 510Meta；C apo 40×，NA＝1.2，Thornwood，NY)检查对照角膜和经处理的角膜的饰胶蛋白聚糖向基质中的扩散。
图1中所示的结果证明了戊二酸酐破坏上皮细胞连接的能力，使得人重组饰胶蛋白聚糖(MW大约为40,000道尔顿)在直接应用于中心角膜后可以扩散至角膜中。如所示的，当将饰胶蛋白聚糖直接应用于中心角膜时，其向对照角膜中的渗透只限于上皮，并且上皮细胞连接没有被破坏。相反，饰胶蛋白聚糖渗透了戊二酸酐处理的角膜的角膜基质。因此，戊二酸酐成功地破坏了上皮细胞连接，允许40,000道尔顿饰胶蛋白聚糖分子的扩散。
乙酸酐处理的角膜的共焦显微镜检查。实验方案与以上对戊二酸酐处理所述的方案相同。使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，应用所有处理溶液。用于将溶液应用于角膜表面的施药器在设计上与2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中描述的相似，通过引用将其全部内容并入本说明书。用盐酸丙对卡因处理对照角膜1分钟，接着用0.5mL的0.2M磷酸钠缓冲液(pH 8.3-8.5)处理30秒钟，0.5mL盐水冲洗30秒钟，然后用0.1mL荧光标记的人重组饰胶蛋白聚糖处理。用盐酸丙对卡因处理经处理过的角膜1分钟，接着用0.5mL的0.3M磷酸钠缓冲液(pH 8.3-8.5)处理30秒钟，乙酸酐(3μL)(在应用前立即用0.3M磷酸钠缓冲液(pH8.3-8.5)稀释)处理30秒钟，盐水冲洗，然后用0.1mL荧光标记的人重组饰胶蛋白聚糖处理。使用Zeis共焦显微镜(型号LSM 510Meta；C apo 40×，NA＝1.2，Thornwood，NY)检查对照角膜和经处理的角膜的饰胶蛋白聚糖向基质中的扩散。
图2中所示的结果证明了乙酸酐破坏上皮细胞连接以允许人重组饰胶蛋白聚糖(MW大约为40,000道尔顿)的扩散的能力。如所示的，直接应用于中心角膜时，渗透至对照角膜中的饰胶蛋白聚糖只限于上皮，并且上皮细胞连接没有被破坏。相反，饰胶蛋白聚糖渗透了乙酸酐处理角膜的角膜基质。因此，乙酸酐也成功地破坏了上皮细胞连接，使得40,000道尔顿饰胶蛋白聚糖分子可以扩散。
实施例2
用于评价饰胶蛋白聚糖与人供体角膜组织中的胶原基质纤维结合的透射电镜术
在Dartmouth-Hitchcock医学中心的外科手术研究系，Lebanon，NH进行了以下研究。在该研究中包括五只成年雌性猫。所有动物获自Liberty实验室并通过耳朵刺花纹来识别。通过裂隙灯检查和内皮细胞结构的测量来测定眼毒性。利用透射电镜术，测定饰胶蛋白聚糖向角膜基质中的渗透。将用饰胶蛋白聚糖处理过的角膜与缓冲福尔马林中的Quinolinic蓝色着色剂(Cupromeronic蓝)反应。该试剂可以将小的蛋白聚糖结构(例如，饰胶蛋白聚糖)染色。
将猫分入三个处理组。用饰胶蛋白聚糖处理每个组的一只眼睛。三只眼睛是对照。将处理过的眼睛暴露于50μg饰胶蛋白聚糖1天、3天或5天。使用无菌移液管，将饰胶蛋白聚糖溶液给予角膜。没有使用施药器将溶液局限于中心角膜表面。在处理后立即以及在第2、3、5和8天临床评价所有眼睛。在最终处理后一个月，再次检查眼睛，然后剜出。将每只眼睛切片。将一半置于福尔马林中，用于随后的组织学分析。另一半再分成两份，其中一份为透射电镜术备用。
在Rutgers大学Robert Wood Johnson医学中心的病理系(New Brunswick，NJ)进行了透射电镜术。图3呈现了饰胶蛋白聚糖补充的角膜(图3A)和对照(图3B)角膜的显微照片。注意到，饰胶蛋白聚糖补充的角膜中胶原纤维之间的分子桥(纤维之间的连接)增加。
在Dartmouth-Hitchcock医学中心的外科手术研究系，Lebanon，NH进行了以下第二项研究。该研究中包括三只成年雌性猫。所有动物获自Liberty实验室并通过耳朵刺花纹来识别。通过裂隙灯检查和内皮细胞结构的测量，测定眼毒性。利用透射电镜术，测定饰胶蛋白聚糖向角膜基质中的渗透。将用饰胶蛋白聚糖处理过的角膜与缓冲福尔马林中的Quinolinic蓝色着色剂(Cupromeronic蓝)反应。该试剂可以将小的蛋白聚糖结构(例如，饰胶蛋白聚糖)染色。
将猫分入三个处理组。来自两只猫的一只眼睛是未处理的对照。使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，给予所有处理溶液。用于将溶液应用于角膜表面的施药器在设计上与2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中描述的相似，通过引用将其全部内容并入本说明书。用盐酸丙对卡因处理两只眼睛，接着用0.5M磷酸钠缓冲液(pH 8.35)处理，然后用溶解于0.6mL磷酸钠缓冲液中的3mg戊二酸酐处理，然后用磷酸钠缓冲液处理，接着用稀释于0.6mL磷酸钠缓冲液中的1.5μL乙酸酐处理，用0.6mL磷酸钠缓冲液中的1.5μL乙酸酐第二次处理，缓冲液冲洗，最后用0.6mL人重组饰胶蛋白聚糖(4.47mg/mL)处理。
将两只眼睛如上处理，但没有用饰胶蛋白聚糖溶液的最终处理。在处理后立即临床评价所有眼睛。处理后三天，剜出眼睛，并将角膜取出，置于含有Cupromeronic蓝的福尔马林中。
在Rutgers大学Robert Wood Johnson医学中心的病理系(New Brunswick，NJ)进行了透射电镜术。图4显示了每个处理后角膜的显微照片。图4A清楚地显示了邻近胶原纤维之间蛋白聚糖连接的存在。如图4B和4C中所示，这些连接在用酰化剂处理的角膜中是不存在的。注意到在酰化处理的角膜中不存在桥接分子。
实施例3
在猫模型中酰化处理在角膜滞后中的作用
实施例2中处理的动物中角膜滞后(CH)的测量。角膜滞后是角膜生物机械强度的一种度量，使用Reichert眼反应分析仪来测量了角膜滞后。Reichert眼反应分析仪利用了动态双向扁平法(dynamic bi-directional applanation)，测量角膜的生物机械特性和眼睛的眼内压。测量方法的基本输出是Goldmann-矫正的压力度量(IOPG)，以及一种被称为角膜滞后(CH)的角膜组织特性的新度量。CH值显示于表1中。
表1.猫研究#1的CH值
酰化和饰胶蛋白聚糖处理后猫角膜的角膜滞后
Figure BPA00001230436200211
如所示的，酰化处理降低了角膜滞后(CH)，这表明由于胶原纤维之间的分子连接的解离，角膜结构“软化”。随后应用饰胶蛋白聚糖将CH值提高至大于最初值的水平，这表明角膜结构“强化”。
酰化处理还破坏了角膜上皮细胞连接，允许人重组饰胶蛋白聚糖向基质中扩散，以重新稳定基质胶原纤维网络。
实施例4
在猫模型中酰化处理在角膜滞后中的作用
使用Reichert眼反应分析仪进行了第二个研究，以检查酰化对“软化”角膜结构完整性或使角膜结构完整性不稳定的作用。在该研究中包括五只受试动物。处理每只动物的一只眼睛，而对侧的眼睛用作对照。对于三只受试动物，在处理之前，以及在用盐酸丙对卡因、稀释于pH8.3-8.5的磷酸钠溶液中的乙酸酐和饰胶蛋白聚糖处理后，使用Reichert眼反应分析仪评价处理眼睛的角膜滞后。对于两只受试动物，没有将酰化剂应用于角膜。而是，使用4毫米环钻穿透角膜上皮，以提供饰胶蛋白聚糖渗透的路径。角膜滞后结果显示于下表2中。
表2
猫研究#2的CH值
Figure BPA00001230436200221
如表2中所示，酰化处理降低了CH值，这表示角膜软化。随后应用人重组饰胶蛋白聚糖提高了CH值，这表明角膜结构重新稳定。在环钻中应用饰胶蛋白聚糖，但不用酰化剂处理的角膜，提供了最小的CH值增加。这些结果证实了在添加稳定分子(例如，饰胶蛋白聚糖)之前，使基质胶原纤维之间的分子连接解离的重要性。
示例性的方法学
使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，应用所有处理溶液。用于将溶液应用于角膜表面的施药器的非限制性实例描述在2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中，通过引用将其全部内容并入本说明书。将数滴盐酸丙对卡因或相似的麻醉剂应用于角膜，少于5分钟(例如，约1-2分钟)。然后将角膜表面暴露于小体积(例如，约0.1-1.0mL)pH7.5-9.5的微碱性预处理缓冲液或溶液。例如，pH可以为8.0至9.0，或它可以为8.2-8.7。尽管缓冲液的精确pH可以改变，但缓冲液必须足以防止最终pH降至低于6.8。合适的缓冲液包括磷酸钠，以及提供以上所公开范围中pH的其它缓冲液。暴露时间可以为15秒至2分钟，尽管常常暴露时间为30秒至1分钟。暴露于预处理缓冲液或溶液后，将角膜表面暴露于酰化剂。例如，首先将角膜暴露于戊二酸酐(GA)或有效破坏上皮细胞连接的相似酸酐、酰基氯、磺酰氯或磺酸。戊二酸酐是粉末，必须在应用于角膜之前快速溶解于预处理缓冲液中。推荐使用研钵和杵棒来研磨戊二酸酐，以减小颗粒大小。这使得可以快速溶解。GA以1mg/mL至10mg/mL的浓度溶解。常常，浓度为3mg/mL至5mg/mL。将角膜暴露于GA，持续15秒至2分钟的时间段。常常，暴露时间为30秒至1分钟。然后将角膜重新暴露于预处理缓冲液或溶液，持续另一个短的时间段，例如，30秒至1分钟。在这点上，将第二种酰化剂应用于角膜表面，以使基质胶原纤维之间的桥或连接解离。再次，使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，给予处理溶液。在许多情况中，所述酰化剂是乙酸酐(AA)或其它不导致角膜肿胀的酸酐、酰基氯、磺酰氯或磺酸。对于该处理，优选的是将中性电荷赋予去质子化胺的酰化剂。在应用前，立即将液体酰化剂(例如，乙酸酐)稀释于预处理缓冲液或溶液中。浓度取决于特定的酰化剂。当酰化剂是AA时，浓度通常为1至5μL/0.6mL预处理缓冲液或溶液。通常，浓度为1-3μL/0.6mL预处理缓冲液或溶液。将角膜暴露于AA少于2分钟，通常为15秒至1分钟，并且在许多情况中，AA暴露时间为20秒至45秒。如果需要，AA处理可以应用第二次。使用将暴露局限于中心角膜表面的施药器，应用所有处理溶液。用于将溶液应用于角膜表面的施药器的非限制性实例描述在2008年3月24日提交、临时申请号为61/064,731、发明名称为“提高眼部环境中流体局部浓度的装置”、共同未决的Bruce DeWoolfson和Michael Luttrell的临时申请中，通过引用将其全部内容并入本说明书。AA处理后，用无菌盐水、平衡的盐溶液或其它无菌生理溶液，将角膜彻底冲洗。最终，将角膜表面暴露于稳定剂(或重新稳定剂)。在许多情况中，稳定剂是人重组饰胶蛋白聚糖。通常以1至5mg/mL的浓度应用人重组饰胶蛋白聚糖，常常为2至4mg/mL的浓度。将角膜暴露于饰胶蛋白聚糖溶液，通常少于3分钟，常常为15秒至2分钟，并且在许多情况中，为30秒至1分钟。然后用无菌盐水、平衡的盐溶液或其它无菌生理溶液冲洗眼睛。使用这些方法来稳定角膜曲率矫正方法后的视力矫正，以提供近视、远视和散光的长期的、非入侵性的治疗。
因此，可以看出本公开内容提供了破坏上皮细胞连接，以促进亲水性的和/或高分子量的分子扩散至基质中的独特和有效的方法。本公开内容提供了使基质中胶原纤维之间的分子桥或连接解离，以在角膜矫形后允许基质重新稳定的独特和有效的方法。本发明使晶状体的胶原纤维基质不稳定的方法使得潜在的患者老花眼能在数小时内得以治疗，不需要明显的恢复期。出于这些原因，认为本公开内容代表了本领域中的显著进展，其具有实质性的商业价值。所述的方法具有结合任何涉及角膜矫形的技术来使用的潜能，所述技术包括矫正近视、远视和散光的方法。
尽管在此显示和描述了使本发明具体化的某些特定的结构，但对本领域的技术人员明显的是，可以在不脱离本发明基础概念的精神和范围下，进行各种改变和各部分的重排，并且本发明的精神和范围不限于在此所示和所述的特定形式，除了在所附权利要求范围所示的范围内。

Claims (11)

1.一种稳定角膜形状的方法，其中该方法包括将破坏角膜上皮连接的物质(“破坏剂”)应用于该角膜，并将使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质(“解离剂”)应用于该角膜；然后应用使基质胶原网络重新稳定的物质，由此稳定角膜的形状。
2.权利要求1的方法，其中使用角膜曲率矫正方法矫形了所述角膜。
3.权利要求1的方法，其中所述破坏剂是酸酐，并且所述解离剂是酸酐、酰基氯、磺酰氯或磺酸。
4.权利要求3的方法，其中所述破坏剂选自马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐或酞酸酐。
5.权利要求3的方法，其中所述解离剂选自乙酸酐、丁酸酐或丙酸酐。
6.权利要求1的方法，其中所述稳定剂是饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、腔蛋白聚糖、mimican、纤调蛋白聚糖、VI型胶原、X型胶原、XII型胶原或XIV型胶原。
7.权利要求6的方法，其中所述稳定剂是人重组饰胶蛋白聚糖。
8.一种提高眼用药物传递的方法，该方法包括在应用眼用药物前将破坏角膜上皮连接的物质应用于角膜。
9.权利要求8的方法，其进一步包括在应用眼用药物前将使基质胶原纤维之间的分子桥解离的物质应用于角膜。
10.权利要求8的方法，其中所述破坏上皮的物质选自马来酸酐、琥珀酸酐、戊二酸酐、柠康酸酐、甲基琥珀酸酐、衣康酸酐、甲基戊二酸酐、二甲基戊二酸酐或酞酸酐。
11.权利要求8的方法，其中所述眼用药物是亲水性药物。
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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