CN101974626A - 基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法 - Google Patents

基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法 Download PDF

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Abstract

一种细菌检测技术领域的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，通过获取海绵单细胞，按照经典的荧光原位杂交方法，采用生物素标记的寡核苷酸探针对海绵单细胞内的微生物基因组DNA进行杂交，最后采用链亲和素标记的量子点进行孵育处理，得到在激发光为紫外区的荧光显微镜下呈现蓝色的海绵细胞以及呈现红色的细菌。本发明将机械法与化学法相结合，可以快速获取海绵细胞，避免海绵细胞自发荧光的干扰，成功探测到海绵细胞内的细菌。

Description

基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法
技术领域
本发明涉及的是一种细菌检测技术领域的方法，具体是一种基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法。
背景技术
作为最古老的后生动物，海绵具有独特的腔状结构，以滤食海水中的微生物为生，体内聚集了大量的共生微生物，一般可以达到海绵体积40％以上。许多证据表明，海绵来源的药用天然产物可能是其共生微生物产生的，海绵共生微生物也因此成为了海洋药物研发的重点之一。对这些微生物的多样性进行分析，鉴定出具有宿主特异性的微生物是开发利用海绵共附生微生物资源的前提。荧光原位杂交技术是一种不依赖于培养和DNA提取的方法：在一定条件下，使荧光染料标记的寡核苷酸探针与靶标DNA的结合，通过荧光显微镜观察拍照，其结果可以直接展示微生物在原位条件下的分布、种类和相对丰度。荧光原位杂交技术在海绵共生微生物的研究当中有成功应用的案例，但很多时候，海绵强烈、广谱的自发荧光会干扰、甚至掩盖探针的信号，使检测失败。因此，迫切需要开发一种新的方法可以绕过海绵自发荧光的障碍，使得荧光原位杂交技术能够应用广泛应用于海绵共生微生物的研究。
量子点技术是近几年来新兴的荧光标记技术。其本身是一种纳米级的半导体颗粒，可被激发出稳定、强烈的荧光。且荧光的颜色随着其自身半径的不同也不同，在肿瘤检测等方面已经有了成功的应用。经过对现有技术的检索发现，中国专利申请号200510020089.9，记载了一种“稳定标记肝癌细胞的方法”，该技术与传统的荧光染料相比，量子点的荧光谱更加丰富，不易粹灭。但是该现有技术的检测往往依赖抗原抗体反应，对于成分复杂、抗原性低、检测对象含量低的环境样品(海洋生物、地质样品)来说，抗原抗体反应难以达到要求。因此，需要选择新的检测方法。目前应用较多的DNA分子杂交技术是较为理想的标记环境样品的方法，用荧光标记的寡核苷酸探针在一定条件下与目标DNA结合，实现复杂环境样品中微量DNA的检测。因此，如果能用量子点标记寡核苷酸探针进行检测，则可以利用其丰富的激发光谱和极高的灵敏度实现海绵细胞内共生细菌的检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，将机械法与化学法相结合，可以快速获取海绵细胞，量子点发光技术可以避免海绵细胞自发荧光的干扰，成功探测到海绵细胞内的细菌。
本发明是通过以下技术方案实现的，获取海绵单细胞，按照经典的荧光原位杂交方法，采用生物素标记的寡核苷酸探针与海绵单细胞内的微生物基因组DNA进行杂交，最后采用链亲和素标记的量子点进行孵育处理，得到在激发光为紫外区的荧光显微镜下呈现蓝色的海绵细胞以及呈现红色的细菌。
所述的获取海绵单细胞是指：
1)将海绵组织解离于无钙镁人工海水中得到海绵细胞粗悬液；
2)收集海绵细胞粗悬液中的沉淀经离心处理后得到海绵细胞，经固定脱水处理得到海绵单细胞。
所述的海绵组织是指：体积不超过0.5cm3的海绵组织；
所述的无钙镁人工海水与海绵组织的体积比为1∶15-20，110rpm ；
所述的无钙镁人工海水的组分及含量为31.6g/L NaCl、0.75g/L KCl、1.0g/L Na2SO4、2.4g/LTris/HCl、0.02g/L NaHCO3、7.2g/L EDTA，余量为去离子水，该无钙镁人工海水的pH为7.6；
所述的解离是指：将海绵组织在20℃以下环境振荡、洗涤40min-60min后于200目的不锈钢细胞筛网上摩擦进行机械解离，同时用20-25倍于海绵体积的无钙镁人工海水冲洗，冲洗液转入锥形瓶中110rpm；
所述的离心处理是指：对海绵细胞粗悬液中的沉淀采用300g离心处理5min后用无钙镁人工海水洗涤三次，再次以300g离心处理5min获得包含海绵细胞内内共生微生物的海绵细胞；
所述的固定脱水处理是指：对海绵细胞采用20倍体积，4％浓度的多聚甲醛溶液进行固定，然后制备细胞涂片并分别置于75％、85％、100％的乙醇中脱水风干。
所述的生物素标记的寡核苷酸探针是指：细菌通用寡核苷酸探针EUB338-5′GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3′-Biotin储液
所述的杂交是指：采用生物素标记的寡核苷酸探针与杂交缓冲液混合后滴加于固定脱水处理后的海绵单细胞上，在43℃环境下杂交4-5h，经洗涤预热后在48℃环境下进行第一次孵育20min，再经二次预热后滴加量子点杂交缓冲液，并在37℃环境下进行第二次孵育20min。
所述的寡核苷酸探针与杂交缓冲液的用量比例为体积比1∶20；
所述的杂交缓冲液的组分及含量为NaCl 900mM、Tris/HCl 20mM、SDS 0.01％wt、甲酰胺31％wt，该杂交缓冲液的pH为7.4。
所述的洗涤是指：杂交完成后，倾去残留的探针杂交液，滴加预热至48℃的杂交后洗液；
所述的杂交后洗液的组分及含量为NaCl 110mM、Tris/HCl 20mM、EDTA 5mM、0.01％wtSDS，该杂交后洗液的pH为7.4。
所述的二次预热是指：用37℃的TBS缓冲液洗涤两次，每次5min；
所述的TBS缓冲液的组分及含量为NaCl 0.8％、KCl 0.02％、Tris/HCl 0.3％，该TBS缓冲液的pH为7.4。
所述的孵育处理是指：在37℃以下孵育30min，孵育完毕后用TBS溶液洗涤四次；
所述的用TBS溶液洗涤四次是指：用含有0.05％吐温-20的TBS溶液在37℃环境下洗涤四次，每次5min。
按照本发明方法可以快速获取海绵细胞，避免海绵细胞自发荧光的干扰，成功探测到海绵细胞内的细菌，为海绵共生微生物多样性与功能的研究提供了新的视角。
附图说明
图1为实施例中Holoxea sp.海绵细胞内共生细菌的检测结果。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例具体实施步骤如下：
1、海绵细胞分离：
(1)以下操作都在无菌条件下进行。海绵组织(1-2g)于4℃解冻后切成不大于0.5cm3的小块。加入盛有15-20倍体积人工海水(1.1g CaCl2，10.2g MgCl2·6H2O，31.6g NaCl，0.75gKCl，1.0g Na2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，1L去离子水，pH 7.6)的锥形瓶中，110rpm，20℃温和振荡40min-60min。
(2)将上一步中洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，让海绵小块变成蓉状，同时用20-25倍体积无钙镁人工海水(31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0gNa2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，7.2g EDTA，1L去离子水，pH 7.6)冲洗，转入锥形瓶中110rpm，20℃振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液。粗悬液经300g，5min离心后分别收集沉淀和上清，并用无钙镁人工海水洗涤沉淀(重悬→300g，5min→收集沉淀和上清)三次。操作时注意轻缓，避免对海绵细胞产生损伤。300g离心获得的沉淀为海绵细胞，其中包含海绵细胞内内共生微生物。
2、海绵细胞固定、脱水：对获得的海绵细胞取10-20μL涂片，风干后采用卡诺氏固定液(60％乙醇、30％氯仿、10％冰醋酸混合而成)进行室温固定30分钟。风干后分别在75％、85％、100％的乙醇中各浸泡3分钟，风干。待杂交用。
3、寡核苷酸探针杂交：将生物素标记的细菌通用寡核苷酸探针EUB338(5′GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3′-Biotin)用双蒸水配成50ng/μL的储液，取5μL与100μL杂交缓冲液(NaCl 900mM，Tris/HCl 20mM，SDS 0.01％，甲酰胺31％，pH 7.4)混合，滴加于涂片区域。置于湿盒中，将杂交炉温度设为43℃，杂交4-5h。杂交完成后，倾去残留的探针杂交液，滴加100μL预热至48℃的杂交后洗液(NaCl 110mM，Tris/HCl 20mM，EDTA 5mM，0.01％SDS，pH 7.4)，48℃孵育20min。洗涤完毕后倾去杂交后洗液。用预热至37℃的TBS缓冲液(NaCl 0.8％，KCl 0.02％，Tris/HCl 0.3％，pH 7.4)洗涤5min，重复一次。滴加量子点杂交缓冲液100μL，37℃孵育20min。
4、量子点标记：用量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，取100μL滴加于杂交区域，37℃孵育30min。孵育完毕，倾去残留的量子点杂交液，用含有0.05％吐温-20的TBS溶液37℃洗涤5min，重复一次。再用预热至37℃的TBS溶液洗涤5min，重复一次。风干后加盖盖玻片。
所述的量子点杂交缓冲液由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
所述的链亲和素标记的量子点是指：量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，其中：量子点-链亲和素复合物由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
5、荧光显微镜观察结果：如图1所示，激发光波长选择紫外区，海绵细胞显示蓝色，量子点杂交信号(红色)显示细菌杂交信号的存在。细菌含量较高时红色荧光会覆盖海绵细胞的蓝色荧光。
实施例2
本实施例具体实施步骤如下：
1、海绵细胞分离：
(1)以下操作都在无菌条件下进行。海绵组织(1-2g)于4℃解冻后切成不大于0.5cm3的小块。加入盛有15-20倍体积人工海水(1.1g CaCl2，10.2g MgCl2·6H2O，31.6g NaCl，0.75gKCl，1.0g Na2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，1L去离子水，pH 7.6)的锥形瓶中，110rpm，20℃温和振荡40min-60min。
(2)将上一步中洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，让海绵小块变成蓉状，同时用20-25倍体积无钙镁人工海水(31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0gNa2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，7.2g EDTA，1L去离子水，pH 7.6)冲洗，转入锥形瓶中110rpm，20℃振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液。粗悬液经300g，5min离心后分别收集沉淀和上清，并用无钙镁人工海水洗涤沉淀(重悬→300g，5min→收集沉淀和上清)三次。操作时注意轻缓，避免对海绵细胞产生损伤。300g离心获得的沉淀为海绵细胞，其中包含海绵细胞内内共生微生物。
2、海绵细胞固定、脱水：对获得的海绵细胞采用20倍体积，4％的多聚甲醛溶液悬浮，4℃浸泡过夜。固定完成的细胞取10-20μL涂片，风干后分别在75％、85％、100％的乙醇中各浸泡3分钟，风干。待杂交用。
3、寡核苷酸探针杂交：将生物素标记的细菌通用寡核苷酸探针EUB338(5′GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3′-Biotin)用双蒸水配成50ng/μL的储液，取5μL与100μL杂交缓冲液(NaCl 900mM，Tris/HCl 20mM，SDS 0.01％，甲酰胺31％，pH 7.4)混合，滴加于涂片区域。置于湿盒中，将杂交炉温度设为43℃，杂交4-5h。杂交完成后，倾去残留的探针杂交液，滴加100μL预热至48℃的杂交后洗液(NaCl 110mM，Tris/HCl 20mM，EDTA 5mM，0.01％SDS，pH 7.4)，48℃孵育20min。洗涤完毕后倾去杂交后洗液。用预热至37℃的TBS缓冲液(NaCl 0.8％，KCl 0.02％，Tris/HCl 0.3％，pH 7.4)洗涤5min，重复一次。滴加量子点杂交缓冲液100μL，37℃孵育20min。
4、量子点标记：用量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，取100μL滴加于杂交区域，37℃孵育30min。孵育完毕，倾去残留的量子点杂交液，用含有0.05％吐温-20的TBS溶液37℃洗涤5min，重复一次。再用预热至37℃的TBS溶液洗涤5min，重复一次。风干后加盖盖玻片。
所述的量子点杂交缓冲液由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
所述的链亲和素标记的量子点是指：量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，其中：量子点-链亲和素复合物由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
5、荧光显微镜观察结果：检测结果为阴性。可能的原因是多聚甲醛作为交联型的固定剂使得微生物细胞壁变得更加紧实，无法让探针透过。与成功的实施例1相比，卡诺氏固定液更适合于以微生物检测为目的细胞固定。在接下来的实施例3中，将讨论杂交温度对量子点荧光原位杂交实验的影响。
实施例3
本实施例具体实施步骤如下：
1、海绵细胞分离：
(1)以下操作都在无菌条件下进行。海绵组织(1-2g)于4℃解冻后切成不大于0.5cm3的小块。加入盛有15-20倍体积人工海水(1.1g CaCl2，10.2g MgCl2·6H2O，31.6g NaCl，0.75gKCl，1.0g Na2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，1L去离子水，pH 7.6)的锥形瓶中，110rpm，20℃温和振荡40min-60min。
(2)将上一步中洗涤后的海绵小块于200目的不锈钢细胞筛网上轻轻摩擦进行机械解离，让海绵小块变成蓉状，同时用20-25倍体积无钙镁人工海水(31.6g NaCl，0.75g KCl，1.0gNa2SO4，2.4g Tris/HCl，0.02g NaHCO3，7.2g EDTA，1L去离子水，pH 7.6)冲洗，转入锥形瓶中110rpm，20℃振荡、解离40min-60min，得到海绵细胞的粗悬液。粗悬液经300g，5min离心后分别收集沉淀和上清，并用无钙镁人工海水洗涤沉淀(重悬→300g，5min→收集沉淀和上清)三次。操作时注意轻缓，避免对海绵细胞产生损伤。300g离心获得的沉淀为海绵细胞，其中包含海绵细胞内内共生微生物。
2、海绵细胞固定、脱水：对获得的海绵细胞取10-20μL涂片，风干后采用卡诺氏固定液(60％乙醇、30％氯仿、10％冰醋酸混合而成)进行室温固定30分钟。风干后分别在75％、85％、100％的乙醇中各浸泡3分钟，风干。待杂交用。
3、寡核苷酸探针杂交：将生物素标记的细菌通用寡核苷酸探针EUB338(5′GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3′-Biotin)用双蒸水配成50ng/μL的储液，取5μL与100μL杂交缓冲液(NaCl 900mM，Tris/HCl 20mM，SDS 0.01％，甲酰胺31％，pH 7.4)混合，滴加于涂片区域。置于湿盒中，将杂交炉温度设为46℃，杂交4-5h。杂交完成后，倾去残留的探针杂交液，滴加100μL预热至48℃的杂交后洗液(NaCl 110mM，Tris/HCl 20mM，EDTA 5mM，0.01％SDS，pH 7.4)，48℃孵育20min。洗涤完毕后倾去杂交后洗液。用预热至37℃的TBS缓冲液(NaCl 0.8％，KCl 0.02％，Tris/HCl 0.3％，pH 7.4)洗涤5min，重复一次。滴加量子点杂交缓冲液100μL，37℃孵育20min。
4、量子点标记：用量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，取100μL滴加于杂交区域，37℃孵育30min。孵育完毕，倾去残留的量子点杂交液，用含有0.05％吐温-20的TBS溶液37℃洗涤5min，重复一次。再用预热至37℃的TBS溶液洗涤5min，重复一次。风干后加盖盖玻片。
所述的量子点杂交缓冲液由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
所述的链亲和素标记的量子点是指：量子点杂交缓冲液将量子点-链亲和素复合物稀释100倍，其中：量子点-链亲和素复合物由武汉珈源量子点技术开发有限公司的量子点荧光原位杂交试剂盒提供(产品号：K-5002-1)。
5、荧光显微镜观察结果：检测结果为阴性。为了提高探针检测的特异性，在本实施例中，杂交温度提高到46℃，但并未得到阳性结果。分析原因，可能是之前文献报道的46℃这一高特异性温度只适合纯培养微生物检测，对于环境样品并不适合，毕竟，较高的杂交温度是以牺牲灵敏度为代价来提高特异性的。
综合三个实施例，更加确定了海绵细胞的固定剂是卡诺氏固定液，杂交温度应控制在43℃。

Claims (8)

1.一种基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征在于，通过获取海绵单细胞，按照经典的荧光原位杂交方法，采用生物素标记的寡核苷酸探针对海绵单细胞内的微生物基因组DNA进行杂交，最后采用链亲和素标记的量子点进行孵育处理，得到在激发光为紫外区的荧光显微镜下呈现蓝色的海绵细胞以及呈现红色的细菌。
2.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的获取海绵单细胞是指：
1)将海绵组织解离于无钙镁人工海水中得到海绵细胞粗悬液；
2)收集海绵细胞粗悬液中的沉淀经离心处理后得到海绵细胞，经固定脱水处理得到海绵单细胞。
3.根据权利要求2所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的无钙镁人工海水的组分及含量为31.6g/L NaCl、0.75g/L KCl、1.0g/L Na2SO4、2.4g/L Tris/HCl、0.02g/L NaHCO3、7.2g/L EDTA，余量为去离子水，该无钙镁人工海水的pH为7.6。
4.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的解离是指：将海绵组织在20℃以下环境振荡、洗涤40min-60min后于200目的不锈钢细胞筛网上摩擦进行机械解离，同时用20-25倍于海绵体积的无钙镁人工海水冲洗，冲洗液转入锥形瓶中110rpm。
5.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的离心处理是指：对海绵细胞粗悬液中的沉淀采用300g离心处理5min后用无钙镁人工海水洗涤三次，再次以300g离心处理5min获得包含海绵细胞内内共生微生物的海绵细胞。
6.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的固定脱水处理是指：对海绵细胞采用20倍体积，4％浓度的多聚甲醛溶液进行固定，然后制备细胞涂片并分别置于75％、85％、100％的乙醇中脱水风干。
7.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的杂交是指：采用生物素标记的寡核苷酸探针与杂交缓冲液混合后滴加于固定脱水处理后的海绵单细胞上，在43℃环境下杂交4-5h，经洗涤预热后在48℃环境下进行第一次孵育20min，再经二次预热后滴加量子点杂交缓冲液，并在37℃环境下进行第二次孵育20min。
8.根据权利要求1所述的基于量子点荧光原位杂交的海绵细胞内共生细菌的检测方法，其特征是，所述的孵育处理是指：在37℃以下孵育30min，孵育完毕后用TBS溶液洗涤四次。
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