CN101970052A - 调节白介素13的功能和活性的药物的设计和选择 - Google Patents

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Abstract

总体而言，本发明涉及包括炎症调制物在内的治疗分子形式的药物的领域以及它们的设计和选择。更具体地说，本发明涉及白介素13(IL-13)上的靶位点以及所述IL-13靶位点在设计用于调节生理过程的药物中的用途，通过所述靶位点GAG分子或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖调节IL-13的活性或功能，所述靶位点选自位于人IL-13或其同源物或衍生物的AB环和/或螺旋D的氨基酸。还考虑包含所设计药物的治疗组合物和预防组合物。

Description

调节白介素13的功能和活性的药物的设计和选择
申请日期
本申请涉及并要求享有于2007年12月21日提交的澳大利亚临时专利申请第2007907059号的优先权，其全部内容在此引作参考。
技术领域
总体而言，本发明涉及包括炎症调制物在内的治疗分子形式的药物的领域以及它们的设计和选择。还考虑包含所述药物的治疗组合物和预防组合物。
背景技术
作者在本说明书中提及的出版物的参考书目的细节汇集于说明内容的末尾。
本说明书对任何现有技术的引用不是并且不应视为承认或以任何形式提示该现有技术构成任何国家一般常识的部分。
具有高程度靶标特异性的治疗分子的设计和选择是药物模拟研究(pharmaco-mimetic research)的主要目标。随着复杂的计算算法的快速发展，虚拟筛选(in silico screening)如今是合理药物设计的合理途径。然而难度不仅在于靶分子的鉴定，而且在于这些分子上有构象活性的袋、裂口和位点的鉴定。
可用于炎症的治疗分子的鉴定特别重要。
炎症是一个复杂的多因素过程，该过程包括中性粒细胞和单核细胞从血液迁移到炎症部位的组织中。该迁移涉及一系列的连续步骤，从在毛细血管后小静脉中剪切力条件下内皮上的粘连(tethering)开始(Smith，Microcirculation 7：385-394，2000)。所述粘连事件取决于选凝素家族的粘附分子，内皮细胞上的E-选凝素和P-选凝素和中性粒细胞上的L-选凝素以及在这两种细胞类型上表达的它们的相应配体(Burns等，Physiol Rev 83：309-336，2003)。粘附步骤主要涉及整合素(αLβ2、αMβ2、α4β7、α4β1)与Ig超家族粘附分子(ICAM-1、ICAM-2、MadCAM和VCAM)的相互作用(Fabbri等，Inflamm Res 48：239-246，1999)。然而，跨内皮细胞的迁移步骤涉及邻近的内皮细胞之间的连接处表达的分子。
影响肺的慢性炎性疾病例如支气管哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和过敏性鼻炎特别难以对付，其导致高水平的发病率和死亡率。哮喘特别流行并且往往通过暴露于环境中的刺激物例如变应原、药物、病原体、空气传播的污染物和刺激物触发。
与肺部炎性病症有关的一种细胞因子是白介素-13(IL-13)。IL-13是17kDa的糖蛋白，其已从活化的T细胞中克隆(Zurawski和dVries，Immunol Today 15：19-26，1994)。它是细胞因子家族的一个成员，该家族特征在于四个α-螺旋束的三级结构。所述螺旋定义为螺旋A-螺旋D。螺旋的转角被称作环，即AB环、BC环和CD环。该家族的其它成员包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5和GM-CSF。它最初被称为T细胞来源的细胞因子，其抑制炎性细胞因子的产生，然而IL-13还能产生很多其它功能。这些功能包括调节胃肠道寄生虫驱除、气道高反应性(AHR)、过敏性炎症、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、组织嗜曙红细胞增多症、肥大细胞增生症、IgE抗体产生、杯状细胞增生症、肿瘤细胞生长、胞内寄生病、组织重建和纤维化(Wynn，Annu.Rev.Immunol.21：425-56，2003)。编码人IL-13的基因位于染色体5Q31上，与编码IL-3、IL-4、IL-5、IL-9和GM-CSF的基因在相同的3000kb簇上。IL-13基因在编码IL-4的基因的上游12kb处并且以相同的方向排列，提示这些基因在进化中通过基因重复形成(de Waal Malefyt和de Vries，The Cytokine Handbook，第3版.A.W.Thomson编辑：427-442，1998)。IL-13蛋白与IL-4仅有25％的同源性，但由于与IL-4共有受体复合体而表现出功能的一些相似性。
IL-13受体复合体包括IL-4受体(IL-4Rα)链和两个另外的IL-13结合蛋白，IL-13Rα1和IL-13Rα2。IL-13Rα1和IL-13Rα2两者均结合IL-13，但仅IL-13Rα1与IL-4相互作用，尽管IL-13Rα2与IL-13Rα1共有37％的同源性(Andrews等，J.Allergy Clin.Immunol 120：91-97，2007)。IL-13Rα1本身以低-中亲和力(2-10nM)结合IL-13，但在IL-4Rα链存在的情况下，IL-13Rα1以高亲和力(kd约300-400pM)结合IL-13。相比之下，IL-13Rα2以高亲和力(0.5-1.2nM)结合IL-13，但其并不表现出促进IL-13的信号转导。业已表明其充当诱饵受体(decoy receptor)。因此，由IL-13Rα1和IL-4Rα链形成的异二聚体复合体构成功能性IL-13受体(Wills-Karp，Immunol.Rev.202：175-190，2004)。对于该受体复合体存在依次的结合顺序，其中IL-13首先结合IL-13Rα1，继而募集IL-4Rα以形成高亲和力结合位点(Andrews等，J.Immunol.176：7456-7461，2006)。IL-13R的异二聚体作用引起詹纳斯激酶(Janus kinase)TYK2和JAK1(分别与13Rα1和IL-4Rα组成型缔合)的活化，然后激活信号转导物和转录激活因子6(STAT6，signal transducer and activator of transcription 6)。
IL-13R(IL-4Rα/IL-13Rα1)表达于造血细胞和非造血细胞上，这些细胞包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、气道上皮细胞和气道平滑肌细胞。IL-13Rα2存在于气道平滑肌细胞和气道上皮细胞上。IL-13Rα2被描述为诱饵受体，并且由IL-13Rα2和免疫球蛋白Fc部分组成的融合蛋白用作体内外IL-13的抑制剂。IL-4也可使用IL-13R(IL-4Rα/IL-13Rα1)和由IL-4Rα和IL-2受体共同γ-链组成的另一受体。受体的这种重叠解释了IL-4和IL-13的许多功能相似性(上述Andrews等，2006)。
由各个受体链识别的IL-13分子上的位点各有不同。例如，分子建模已提示IL-13的D-螺旋与IL-13Rα1相互作用，而IL-13的A-螺旋和C-螺旋的部分与IL-13R的IL-4Rα链相互作用(Oshima和Puri，J.Biol.Chem.276：15195-15191，2001；Zuegg等，Immunol.Cell Biol.79：332-339，2001)。发现螺旋A中的12和15位的谷氨酸和分别在C螺旋中65和68位的精氨酸和丝氨酸的突变已发现对于通过IL-4Rα链的生物学信号转导是重要的，原因在于它们的特异性突变导致功能的损失和/或增进(Thompson和Debinski，J.Biol.Chem.274：29944-29950，1999)。事实上，突变的E12K产生抑制人IL-13活性的高效拮抗剂(上述Oshima和Puri，2001)。而D-螺旋的氨基酸被描述成对于结合IL-13Rα1和/或IL-13Rα2是重要的，这些氨基酸为H102、K104、K105、R108、E109和R111(Arima等，J.Biol.Chem.280：24915-24922，2005；Madhankumar等，J.Biol.Chem.277：43194-43205，2002)。这些数据得到分子建模研究和IL-4Rα/IL-13/IL-13Rα1信号转导复合体的晶体结构支持。所述晶体结构的分析进一步提示IL-13上的K104和R108对于与IL-13Rα1结构域3的相互作用极其重要(LaPorte等，Cell 132：259-272，2008)。A螺旋和D螺旋上的一条氨基酸(a stripe of amino acid)分出了由这些氨基酸的烷基部分划出的疏水峡谷(canyon)。这些侧链形成裂口，受体插入所述裂口中以与细胞因子A螺旋和D螺旋的主链接触，并且尤为重要的是D螺旋上的氨基酸R108和K104的侧链。而似乎R111对于结合可溶性受体IL-13Rα2是重要的(Andrews等，J.Allergy Clin.Immunol.120：91-97，2007)。IL-13Rα1的结构域1与由M33、D87、K89、T35的烷基侧链形成的疏水碟形补丁(saucer-shaped patch)相互作用(上述LaPorte等，2008)。
调节IL-13功能的能力将有助于可用于治疗以下疾病的药物的开发：肺部炎性病症(包括哮喘、过敏反应、肺气肿和COPD)、IL-13引起的其它疾病(包括特应性皮炎、纤维化)和其中IL-13促进了避免凋亡的肿瘤生长/保护的各种癌症(例如慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)、何杰金氏病(Hodgkin’s disease))以及其中IL-13表现出拮抗肿瘤的免疫监视的其它癌症(上述Wynn，2003)。IL-13和纤维化之间的联系提示IL-13拮抗剂在其中长期暴露于IL-13下而触发过度愈合、组织重建或形成破坏性组织病理的许多情况中有效，在例如特发性肺纤维化、慢性移植排斥、博来霉素诱导的肺纤维化、进行性全身性硬化症、辐射诱导的肺纤维化、肝纤维化和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的情况中有效。
特定的糖胺聚糖(GAG)序列可特异地结合许多生物分子并与这些生物分子发生独特的相互作用，这些生物分子包括趋化因子、生长因子、细胞因子、凝血级联蛋白(例如抗凝血酶III(AT-III)-五糖复合体)和粘附分子。然而，已开发用于治疗用途的GAG片段非常少，主要由于糖类构件的合成在化学上有阻碍。抗凝血酶(AT)-结合性五糖Arixtra(注册商标)[Sanofi]已被批准用于矫形外科后的血栓预防，GAG模拟物PI-88(Progen)已进行了作为抗癌治疗的临床试验。其它的聚阴离子多糖(例如多硫酸戊聚糖)也可以以类似于GAG或GAG序列的方式结合生物分子，包括趋化因子、生长因子、细胞因子、凝血级联蛋白(例如抗凝血酶III(AT-III)-五糖复合体)以及粘附分子。
有描述IL-13与GAG的相互作用的性质的需要。这将使得能够开发GAG-IL-13相互作用的小分子选择性调节物。这包括经由IL-13的受体(IL-13R)阻断IL-13信号传导，从而治疗由于该信号传导事件而产生的疾病状况。
发明简述
在通篇说明书中，除非上下文另外需要，否则词语″包括″或变体诸如″包含″或″具有″应理解为暗指包含所示要素或整数或要素组或整数组，但不排除任何其它的要素或整数或要素组或整数组。
本文提供了IL-13的胞外结构域的结构模型、硫酸酯结合区域的位置和对不同的肝素和GAG片段与IL-13结合的建模。这导致肝素和各种大小的GAG片段与IL-13上特定结合位点的相互作用和亲和力的鉴定。这继而能够确定用于设计和选择小于天然存在的GAG的GAG样分子的分子靶标。提出这些分子在性质上与GAG相似但小于天然存在的GAG(GAG模拟物/聚阴离子糖缀合物)，具有作为调节IL-13活性和功能的治疗和预防药物的潜能，因为这些分子在与IL-13Rα1和/或IL-13Rα2的结合位点重叠的位点上结合IL-13，因而阻断了IL-13与这些分子相互作用并因此阻断了构成功能性IL-13受体的IL-4Rα/IL-13Rα1复合体的形成。因此，GAG模拟物/聚阴离子糖缀合物在一系列疾病过程中具有治疗药物和预防药物的作用，这些疾病过程例如炎症、纤维化、慢性移植排斥、癌症和干细胞的分化和增殖。尤其是过敏性炎性疾病哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎或湿疹和其它炎症性呼吸系统疾病(例如COPD和ARDS)很可能确实受性质上与GAG相似但比天然存在的GAG小的这些分子的影响。
IL-13包含四个螺旋束。各个螺旋分别被称为螺旋A、螺旋B、螺旋C和螺旋D。所述螺旋中的转角被称作环，由此被称作AB环、BC环和CD环。本说明书所用的氨基酸编号系统是在人IL-13单体结构中提供的编号系统；1ijz.pdb。
因此，本发明的一个方面涉及IL-13上的靶位点，该位点上GAG分子或聚阴离子糖缀合物调节IL-13活性或功能，所述靶位点包括位于选自AB环、螺旋D以及AB环与螺旋D的组合的区域上的氨基酸。GAG/聚阴离子糖缀合物结合位点与IL-13的D螺旋上针对受体IL-13Rα1和/或IL-13Rα2的结合位点重叠，从而阻断了IL-13与这些分子相互作用并因此阻断了构成功能性IL-13受体的IL-4Rα/IL-13Rα1复合体的形成。
还提供了用于设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点，所述靶位点包括选自AB环、螺旋D以及AB环与螺旋D的组合的区域内氨基酸残基的构象。
本发明的另一个方面提供了可用作用于设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点的IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点，所述GAG结合位点选自：
(i)包含氨基酸残基Q22、Q24和K25的AB环中氨基酸残基构象；
(ii)选自氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的螺旋D上的氨基酸残基构象；以及
(iii)选自AB环中氨基酸残基Q22、Q24和K25以及螺旋D中氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象。
这些氨基酸位于人IL-13中，但本发明延伸至衍生的IL-13分子，包括剪接变体和多态变体以及非人IL-13同源物的同等位置。
另一个方面涉及可用作用于设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点的IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点，所述GAG/聚阴离子糖缀合物结合位点包括AB环中的氨基酸Q22、Q24和K25以及螺旋D中的氨基酸K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
本发明的另一个方面涉及一种调节IL-13活性或功能的分离的药物，所述药物能够作用于或拮抗或激动GAG或聚阴离子糖缀合物与IL-13上的位点结合，IL-13上的所述位点选自AB环中的氨基酸残基、螺旋D中的氨基酸残基以及AB环和螺旋D中的氨基酸残基。
更具体地说，本发明提供了一种分离的药物，其作用于或拮抗或激动GAG或聚阴离子糖缀合物与IL-13上的位点结合，所述位点选自：
(i)包括人IL-13中氨基酸残基Q22、Q24和K25的AB环中氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)选自人IL-13的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的螺旋D中氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)选自人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D中的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物。
“IL-13”包括突变体、衍生物、剪接变体、多态变体等。其特别包括天然存在的人IL-13变体IL-13R111Q，其中第111位的精氨酸被谷氨酰胺取代。该变体存在于约20％的高加索人群中并且许多研究已显示该IL-13多态性与特应性和特应性疾病(例如哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎)之间有很强的联系(上述Andrews，2007)。
本发明还考虑IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点在设计用于调节受治疗者中生理过程例如炎症过程的药物中的用途。
本发明的另一个方面是肝素、肝素寡糖或肝素片段或衍生物充当IL-13的拮抗剂，由于其在选自以下的位点上结合IL-13：
(i)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25；
(ii)螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111；和
(iii)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25以及螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
本发明的另一个方面是硫酸化木聚糖、多硫酸戊聚糖(PPS)的片段或衍生物充当IL-13的拮抗剂，由于其在选自以下的位点上结合IL-13：
(i)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25；
(ii)螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111；以及
(iii)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25以及螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
本发明还考虑选自以下的AB环和/或螺旋D上的硫酸酯结合基序(sulfate binding motif)：
(i)人IL-13的AB环上的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D中的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物。
另一个方面提供了IL-13的AB环中的和/或螺旋D上的硫酸酯结合基序在制备用于调节包括炎症过程在内的生理过程的药物中的用途，所述硫酸酯结合基序选自：
(i)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物。
本发明还考虑受治疗者中的治疗或预防方法，所述方法包括给予受治疗者IL-13活性或功能调节物，所述调节物与IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点结合或相互作用，所述结合位点选自：
(i)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25；
(ii)螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111；以及
(iii)AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
本文还考虑包括虚拟筛选以及其它基于计算机的方法在内的设计和选择IL-13活性和功能调节物的方法。
本文所用的氨基酸残基的单字母和三字母缩写定义于表1中。
表1
氨基酸缩写
Figure BPA00001211614700091
Figure BPA00001211614700101
附图简述
某些图含有彩色的图示或实体。彩图可通过请求从专利权所有人或从合适的专利局处获得。若从专利局处获取可能会征收费用。
图1A和图1B的图表显示(A)通过表面等离子共振确定的人IL-13与固定在BIAcore芯片上的肝素的结合情况。将IL-13按所示浓度注入固定在链霉亲和素传感器芯片之上的肝素中。在结合期和解离期期间均监控结合数据。(B)结合肝素偶联的流动细胞(fc2)或空白流动细胞(fc1)的IL-13。标出的是流动细胞2减去流动细胞1的数据(fc2-1)。
图2A和图2B为显示不同的阴离子多糖阻断IL-13的细胞增殖活性的能力的图示。(A)肝素或蔗糖八硫酸酯(均以10μg/ml)对IL-13介导的TF1.8细胞的细胞增殖的作用；显示了IL-13的滴定。(B)为显示在25ng/ml的IL-13下戊聚糖(虚线)和肝素(实线)对IL-13依赖性TF1.8细胞增殖的剂量响应曲线的图示。
图3A和图3B的图表显示肝素和硫酸乙酰肝素片段结合IL-13并抑制IL-13活性的能力取决于片段大小。(A)显示通过表面等离子共振测定的IL-13R111与BIAcore芯片上固定化肝素的结合情况的图示。单独注入IL-13(75nM)或接着用肝素(100nM)、硫酸乙酰肝素(100nM)、肝素DP10(100nM)和肝素DP6(100nM)预温育。(B)在存在不同大小的肝素(hep)和硫酸乙酰肝素(HS)片段的情况下TF1细胞增殖情况的图示。在1μg/ml和2.5μg/ml下检测多糖。
图4的图表显示大小为DP2、DP4、DP5、DP7和DP8的硫酸化木聚糖阻断IL-13依赖性TF-1细胞增殖的能力。按10μg/ml和2.5μg/ml使用不同大小的硫酸化木聚糖，而IL-13为2.5ng/ml。显示3个重复的平均抑制％+/-标准差。
图5的示图显示了影响人IL-13WT与GAG或聚阴离子糖缀合物结合的氨基酸的位置。(A)刚性肝素十一糖(endecasaccharide)与以棒状表示的关键IL-13氨基酸的相互作用的分子建模。显示了肝素片段的十种不同的对接定位(docking orientation)。肝素链显示为按元素着色的线，而蛋白显示为带。
图6是各种IL-13突变体与固定化的肝素结合的图示。肝素固定于BIAcore传感器表面并且使各种IL-13分子(BisTris pH 6.00、0.15MNaCl、0.005％Tween 20中75ngm)经过液相的表面。空白是经过不含偶联肝素的表面的单独的缓冲液。(A)第111位为精氨酸的野生型IL-13(R111WT)的结合情况对比代表天然存在的多态性的20％高加索人群的其中第111位为谷氨酰胺的IL-13突变体以及在Q111背景上其中以下氨基酸转变为丙氨酸：K25、K97、K104、K105和R108的第二种突变体的结合情况。(B)固定化的肝素与第111位为精氨酸的野生型IL-13(IL-13R111)的结合情况对比固定化的肝素与其中第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的野生型IL-13(IL-13R111K97A)、第111位为谷氨酰胺的IL-13(IL-13Q111)、以及第111位为谷氨酰胺并且第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的IL-13(IL-13Q111K97A)的对比情况。
图7是两种多态形式的人IL-13，第111位为精氨酸的IL-13和第111位为谷氨酰胺的IL-13的生物学活性的图示。生物学活性用IL-13诱导的TF-1细胞增殖来衡量。(A)无论检测哪种多态形式，IL-13依赖性TF-1细胞的增殖是相同的。(B)肝素在抑制两种形式的IL-13的生物学活性方面非常有效。
图8A和图8B的图示显示了IL-13的空间填充模型。肝素片段在相同位置上结合两种天然存在形式的IL-13，并且在两种情况下肝素的结合部分掩盖了IL-13上由IL-13Rα1的结构域3识别的位点。(A)结合肝素11聚物的人IL-13Q111的空间填充模型。(B)结合肝素11聚物的人IL-13R111(野生型)的空间填充模型。显示了涉及结合IL-13Rα1的结构域1和结构域3的氨基酸。D螺旋的氨基酸以不同色度的绿色显示，而A螺旋的氨基酸以不同色度的红色和橙色显示。肝素片段显示为按元素着色的线。显示了十种不同的对接定位。
发明详述
除非本文明确另外指出，否则本说明书中所用的单数形式包含复数方面。因此，例如，对“靶位点”的提及包括提及单个靶位点或多于一个靶位点；对“氨基酸”的提及包括单个氨基酸以及两个或更多个活性氨基酸；对“本发明”的提及包括提及本发明的一个或多个方面等。
本发明提供了用于设计和选择IL-13功能和活性的特异性拮抗剂和激动剂的IL-13上的靶位点。本文提出的此类拮抗剂和激动剂可用于调节包括炎症、癌症和干细胞分化和/或增殖在内的生理过程。通过使用术语“生理过程”，所有这样的病况均方便地涵盖在本文内。尤其是涵盖IL-13活性或功能的拮抗剂用于炎症，特别是过敏性炎症的治疗。
对“炎症”或“炎症过程”的提及包括但不限于导致旨在保护受伤害或疾病影响的组织的某些区域发红、肿胀、疼痛和热感反应的疾病和病症。可利用本发明的方法治疗的炎性疾病包括但不限于：痤疮、过敏性鼻炎、咽峡炎、关节炎、吸入性肺炎、脓胸、胃肠炎、炎症、肠型流感、NEC、坏死性小肠结肠炎、骨盆炎症性疾病、咽炎、PID、胸膜炎、咽喉痛(raw throat)、发红、红肿、咽喉炎(sore throat)、胃型流感和泌尿道感染、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS))、克罗恩病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、I型糖尿病、龈炎、湿疹(特应性皮炎)、牛皮癣性关节炎、腱炎和多发性硬化症。过敏性鼻炎、哮喘、COPD、ARDS和特应性皮炎是本文考虑的特别病况。
依照本发明，IL-13的AB环、螺旋D或AB环和螺旋D的组合中的氨基酸残基限定了用于结合GAG分子或聚阴离子糖缀合物结构决定簇。这使得能够开发GAG样分子并设计和选择小于天然存在的GAG的GAG样分子，其与IL-13结合并修饰其活性或功能。这样的分子继而被认为是调节以下生理事件的有用的候选药物，这些生理事件包括炎性过程例如哮喘、过敏反应、肺气肿、COPD、特应性皮炎和包括纤维化和各种癌症在内的IL-13引起的其它疾病，例如B慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、何杰金氏病，其中IL-13促进了避免凋亡的肿瘤生长/保护以及其中IL-13表现出拮抗肿瘤免疫监视的其它癌症。IL-13与纤维化之间的联系提示IL-13拮抗剂还可在其中长期暴露于IL-13下而触发过度痊愈、组织重建或形成破坏性组织病理的许多情况中有效，在例如特发性肺纤维化、ARDS、慢性移植排斥、博来霉素诱导的肺纤维化、进行性全身性硬化症、辐射诱导的肺纤维化和肝纤维化的情况中有效，并且有效抑制某些癌症的生长和发展。
已采用各种方法基于氨基酸的组成鉴定蛋白表面上的肝素/GAG结合位点(Caldwell等，Int J Biochem Cell Biol 28：203-216，1996；Fromm等，Arch Biochem Biphys 343(1)：92-100，1997)、二级结构(Hileman等，Bioessays 20(2)：156-167，1998)、碱性氨基酸的空间分布(Margalit等，J Biol Chem 268(26)：156-167，1993)以及蛋白的表面性质(Forster和Mulloy，Biochem Soc Trans 34(3)：431-434，2006)。虽然业已表明用于肝素结合的共有序列例如XBBXBX和XBBBXXBX(其中B为碱性残基和X可为任何残基)(Cardin和Weintraub，Arteriosclerosis9(1)：21-32，1989)，但是这些序列既不一定也不足以限定GAG结合位点。GAG结合位点通常由蛋白表面上的一簇碱性残基组成，但并不一定在连续序列中。此外，甚至在结构上相关蛋白的家族中，例如以四个α-螺旋束的三级结构为特征的细胞因子家族，GAG结合位点并不一定位于相同的螺旋上。因此，IL-4上的GAG结合位点涉及C-螺旋，IL-5上的GAG结合位点涉及C-螺旋以及由一个单体的AB环的和另一个单体的CD环组成的β-折叠(国际专利公开第WO 2005/100374A1号)。这意味着蛋白上的GAG结合位点不能由线性的氨基酸序列或蛋白的三级结构来确定或预测。
位点定向诱变涉及蛋白的DNA编码序列内一个或多个核苷酸的突变，致使表达的蛋白改变了至少一个氨基酸。然后可在该文件所述的肝素结合试验中筛选对肝素结合有作用的突变。影响肝素结合的突变可作图到二维或三维蛋白模型上，以确定它们彼此之间的相对位置以及作为整体的蛋白的相对位置。该技术可用在任何GAG-结合蛋白上以收集那个蛋白上任何GAG-结合位点的信息[Tsiang，等，J.Biol.Chem.270：16854-16863，1995]。
因此，本发明的一个方面涉及IL-13上的靶位点，在该靶位点上GAG分子或聚阴离子糖缀合物调节IL-13活性或功能，所述靶位点包括位于选自AB环和螺旋D的区域的氨基酸。
对“靶位点”的提及包括包含IL-13内与GAG分子或聚阴离子糖缀合物相互作用的氨基酸残基的构象结合区域。它是针对GAG分子或用于设计或选择模拟或拮抗或促进GAG结合IL-13从而增加或减少IL-13活性或功能的分子的靶位点。这些分子类似于GAG，但小于天然存在的GAG。因此，所述靶位点用于设计和选择IL-13活性或功能调节物。
因此，提供了用于设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点，所述靶位点包括IL-13的AB环和/或螺旋D内的氨基酸残基的构象。
AB环和螺旋D的靶位点还可以根据硫酸酯结合基序限定。因此，本发明考虑选自以下的IL-13的AB环和螺旋D的硫酸酯结合基序：
(i)人IL-13的AB环的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D中氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物。
如上所述，所述调节物可为GAG、GAG复合分子、聚阴离子糖缀合物或小于天然存在的GAG的任何GAG样分子，其可含有或可不含糖类物质。
本文所用术语“GAG复合的”结构或分子或“复合的”结构或分子可互换使用。在一个实施方案中，GAG复合结构包含结合靶蛋白的糖结构。在一个具体方面，所述糖结构包含两个以上高度带电的(例如硫酸化或磷酸化)二糖或三糖或四糖或五糖或六糖或七糖或八糖或由一个或多个接头分隔的这些糖的任何组合。所述接头并不一定基于GAG样骨架。相反，优选诸如烷基链或多元醇结构或聚乙二醇等接头。此外，高度荷电的糖类并不一定基于GAG结构。举例而言，其它糖类例如甘露聚糖、壳聚糖或木聚糖或葡聚糖可用作支架，在其上展示带电的基团。
术语“调节物”包含IL-13活性或功能的拮抗剂和激动剂。
本文提出AB环和/或螺旋D上的氨基酸构象位点为GAG结合位点。
对“氨基酸残基构象”的提及包括在IL-13上的GAG分子或聚阴离子糖缀合物所结合的袋、裂口、面或区域。本文提出AB环的氨基酸残基Q22、Q24和K25和/或螺旋D的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111涉及人IL-13或其衍生物或人IL-13的多态形式(特别是其中第111位精氨酸被谷氨酰胺取代的IL-13变体)的GAG结合位点和/或非人IL-13分子的同等位置。
本文提及的“构象”包括结合的袋、裂口、面或区域，包括连续或不连续的氨基酸残基。
因此，另一个方面涉及IL-13上的GAG/聚阴离子糖缀合物结合位点，其可用作设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点，所述GAG结合位点选自：
(i)包含残基Q22、Q24和K25的AB环中的氨基酸残基构象；
(ii)选自氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的螺旋D上的氨基酸残基的构象；以及
(iii)选自AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D中的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基的构象。
以上给出的氨基酸残基编号是针对人IL-13的，利用了氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸残基的缩写定义于表1中。然而，本发明延伸至人的同源物，例如衍生物和剪接变体以及特别是其中第111位的精氨酸被谷氨酰胺取代的IL-13变体以及非人的同源物，例如但不限于来自小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪(包括家猪和野猪)、马、绵羊、猫、狗、canalid和牛的IL-13同源物。不同的IL-13同源物之间可存在天然变体并且因此氨基酸残基编号可能变化。
因此，另一个方面涉及IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点，其可用作设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点，所述GAG结合位点选自：
(i)包括人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25的氨基酸残基的构象或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)选自人IL-13上氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的螺旋D上氨基酸残基的构象或非人IL-13中的等同物；以及
(iii)选自人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25以及人IL-13螺旋D的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基的构象或非人IL-13中的等同物。
如上所述，对“人IL-13”或任何非人IL-13的提及包括其任何衍生物或剪接变体。
显而易见的是，所述IL-13调节物将具有人类和兽医方面的应用以及畜牧业应用，例如在赛马业、赛骆驼和赛狗业中，以及野生动物的控制和保护中的应用。本发明涵盖所有这样的应用。
形成GAG结合位点的特定氨基酸残基包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
因此，本发明的另一个方面考虑IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点，其可用作设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶标，所述GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点选自：
(i)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其在非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域；
(ii)人IL-13的螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物。
GAG或聚阴离子糖缀合物的结合位点有关的“功能性部分或区域”意指通过天然或人为的选择或诱变，可在不去除GAG或聚阴离子糖缀合物结合能力的条件下去除或修饰一个或多个限定的氨基酸残基。因此，本发明并不一定限于其全部的氨基酸残基的每个基团。
本发明的另一个方面涉及IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点，其可用作设计和选择IL-13活性或功能调节物的靶位点，所述GAG结合位点包括人IL-13的AB环中Q22、Q24和K25和螺旋D上K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或非人IL-13中的等同物。
本发明还提供了可用于筛选试验或用于产生抗体的合成肽，所述合成肽包含包括IL-13的AB环中Q22、Q24和K25在内的三个或更多个氨基酸残基和/或包含螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111中的一个或多个或者非人IL-13中的等同物。
如上所述，AB环和/或螺旋D中的GAG或聚阴离子糖缀合物靶位点也可以按照硫酸酯结合基序限定。因此，本发明考虑选自以下的IL-13中的硫酸酯结合基序：
(i)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25；
(ii)人IL-13的螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111。
如上所述，这些位点延伸至人IL-13的衍生物和剪接变体以及非人IL-13同源物的等同位点。
本发明延伸至IL-13活性或功能调节物。这样的分子可为IL-13的拮抗剂或激动剂或IL-13与配体例如受体或受体链相互作用的拮抗剂或激动剂。所有这样的调节物在本文中可能称为药物、疗法、药品、分子、活性剂或类似术语。虽然本文考虑激动剂和拮抗剂，但拮抗剂特别涵盖在本发明之内。
因此，本发明还涉及调节IL-13活性或功能的分离的药物，所述药物能够作用于或拮抗或激动GAG或聚阴离子糖缀合物结合IL-13上的位点，所述IL-13上的位点包括AB环中的氨基酸和/或螺旋D中的氨基酸。
更具体地说，本发明提供了一种分离的药物，所述药物作用于或拮抗或激动GAG或聚阴离子糖缀合物结合IL-13上的位点，所述位点包括：
(i)包括氨基酸残基Q22、Q24和K25的AB环中氨基酸残基的构象；
(ii)包括氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的螺旋D中氨基酸残基的构象；以及
(iii)包括AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基的构象。
本发明的又一个具体方面涉及一种分离的药物，所述药物作用于或拮抗或激动GAG结合IL-13上的位点，所述位点包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或非人IL-13同源物中的等同物。
可通过许多手段鉴定、设计或选择本发明的药物，这些手段包括虚拟筛选或建模以及X射线衍射晶体分析法、随机筛选、微阵列技术等。
因此，在一个实例中，考虑虚拟筛选的基于计算机的方法。
在装有软件程序的计算机的协助下适当地帮助筛选或鉴定潜在的IL-13调节物，所述软件特别预测分子部分与IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点的结合情况。
因此，在另一个方面，本发明考虑用于筛选或设计IL-13调节物的计算机程序产品，所述产品包括：
(a)包括座标或分子形状的代码，所述座标和分子形状由人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域限定；
(b)筛选可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体的代码；以及
(c)储存所述代码的计算机可读介质。
在相关方面，本发明延伸至用于筛选或设计IL-13调节物的计算机，其中所述计算机包括：
(a)包括座标或分子形状的代码，所述座标和分子形状由人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域限定；
(b)工作储存器，用于储存用于处理机器可读数据的指令；
(c)中央处理器，其连接所述工作储存器和所述机器可读数据储存介质，以提供可能结合所述座标或分子形状(molecule step)的已知或理论上的配体；以及
(d)输出硬件，其连接所述中央处理器用于接收(a)和/或(b)。
另一个方面提供了用于筛选或设计IL-13调节物的计算机程序产品，所述产品包括：
(a)包括以下座标或分子形状的代码：
(i)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D上氨基酸残基编号K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物。
(b)筛选可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体的代码；以及
(c)储存所述代码的计算机可读介质。
另外的方面涉及用于筛选或设计IL-13调节物的计算机，其中所述计算机包括：
(a)包括以下座标或分子形状的代码：
(i)IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25和螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物，
(b)工作储存器，用于储存用于处理机器可读数据的指令；
(c)中央处理器，其连接所述工作储存器和机器可读数据储存介质，以提供可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体；以及
(d)输出硬件，其连接所述中央处理器以接收(a)和/或(b)。
在这些实施方案的一个形式中，系统包括具有中央处理器(“CPU”)、可为例如RAM(随机存取存储器)或“核心”存储器的工作存储器、大容量存储器(例如一个或多个磁盘驱动器或CD-ROM驱动器)、一个或多个阴极射线管(“CRT”)显示终端、一个或多个键盘、一条或多条输入线和一条或多条输出线的计算机，其全部由常规的双向系统总线互连。
通过输入线与计算机连接的输入硬件可以多种方式实现。例如，本发明的机器可读数据可经由应用通过电话线或专用数据线连接的一个或多个调制解调器来输入。作为备选或此外，所述输入硬件可包括CD。或者，ROM驱动器或磁盘驱动器与显示终端连接，键盘也可用作输入设备。
通过输出线与计算机连接的输出硬件可类似地通过常规设备实现。例如，输出硬件可包括CRT显示终端用于显示本文所述的合成的多核苷酸序列或合成的多肽序列。输出硬件还可包括打印机以致于可产生硬拷贝输出，或磁盘驱动器以储存系统输出用于后续使用。
在操作中，CPU协调各种输入设备和输出设备的应用；协调来自大容量存储器和来自工作存储器的数据访问；以及确定数据处理步骤的顺序。许多程序可用于处理本发明的机器可读数据。
本发明还提供了可由机器可读数据或指令组编码的磁性数据储存介质，用于设计本发明的合成分子，这可通过例如上述的系统实现。介质可为常规软盘或硬盘，其具有常规的合适基材和可为单面或双面的常规合适涂层，所述涂层含有极性或方向可被磁改变的磁畴。介质还可具有用于接收磁盘驱动器或其它的数据储存设备的主轴(spindle)的通路。介质涂层的磁畴被极化或定向以按常规的方式编码诸如本文所述的机器可读数据。
本发明还提供了光学可读数据储存介质，其还可编码这样的机器可读数据或指令组，用于设计本发明的合成分子，这可通过系统实现。介质可为常规的光盘、只读存储器(CD-ROM)或诸如光可读且磁光可写的磁性光盘的可改写介质。介质优选具有合适的常规基材和通常在基材单面的合适的常规涂层。
虚拟筛选的具体形式参见Raghuraman等，J.Med.Chem49：3553-3562，2006。大体上，采用对接法(docking method)，藉此在五糖中取代各种化学基团代替硫酸酯基团(sulfate group)。该对接形式也被称作组合虚拟筛选(combinatorial virtual screening)。
因此，本发明提供了调节IL-13活性或功能的水平的药物。提及“药物(medicament)”、“治疗分子”、“药物(agent)”、“药品”、“组分”和“药物制剂”也可用于描述与IL-13相互作用并修饰活性的分子。
本发明还考虑筛选药物的方法，所述方法包括例如将候选药物与如本文所鉴定的IL-13的靶位点接触。所述筛选方法包括针对药物和靶位点之间复合体的存在情况的试验以及筛选功能的任何变化的试验。还考虑基于细胞的筛选方法。
一种形式的试验涉及竞争性结合试验。在这样的竞争性结合试验中，通常标记IL-13。将游离的IL-13从任何假定的复合体中分离并且游离(即未结合的)标记的量衡量试验药物与IL-13的结合。一种试验还可检测结合的而非游离的IL-13的量。还可能的是标记假定药物而非IL-13并检测在试验药物存在和不存在的情况下与IL-13结合的药物的量。这样的化合物可抑制IL-13或可保护IL-13不受抑制，或者可使其抑制作用成为可能。
一种常见的基于细胞的筛选试验测定试验药物是否可抑制由IL-13诱导的细胞增殖。TF-1细胞是IL-13反应性人细胞系，其通常用于该目的。通常将IL-13与测试药物预温育，然后将该混合物加入TF-1细胞中，并允许增殖持续48小时，然后确定细胞数。若药物与IL-13结合从而阻止了IL-13与其细胞表面受体链复合体相互作用，则在混合了药物的IL-13存在的情况下细胞增殖的程度将显著低于当仅存在IL-13时得到的细胞增殖程度。在两种情况中使用相同浓度的IL-13。
基于细胞的筛选试验还包括检测药物是否能改变白细胞或白细胞样细胞系穿过在组织培养中生长的内皮细胞层的能力。所述内皮细胞层生长在支持于加在多孔板的壁中的插入物上的多孔膜的上表面。将所述白细胞或白细胞样细胞系在药物存在的条件下加到所述膜的上表面，并允许白细胞迁移穿过内皮细胞层并进入下层室内。细胞迁移穿过内皮细胞层的程度通过细胞标记染料来监测，被摄取的染料的水平用读板仪定量。
在另一种方法中，修饰GAG分子以提供能调节IL-13活性的药物。例如，GAG上的硫酸酯基团通过被不同的非离子部分取代来修饰。若GAG链上的硫酸酯基团用针对其相互作用的氨基酸的合适部分取代，则该经修饰的GAG结构仍可结合，但以不同的亲和力结合或拮抗未修饰的GAG的结合。
此类修饰的GAG可为合适的治疗候选物或可设计或选择其模拟物。因此，本发明考虑GAG分子、修饰的GAG、GAG样分子、聚阴离子糖缀合物和复合GAG作为潜在的治疗靶标或作为模板分子，对其可设计合适的模拟物或同源物或结构等同物。GAG样分子包括具有GAG或GAG样组分和非GAG组分的GAG样复合结构。所述GAG或GAG样分子或GAG样复合分子可来源于天然存在的肝素样GAG或可通过非GAG多糖的化学修饰法得到或可为仅可部分包含糖骨架的复合结构。
这些GAG或GAG样寡糖或GAG样复合分子通常被视为半合成的并且由作原材料的大的聚合多糖或分离的四糖、五糖、六糖、七糖或八糖原材料产生。所述半合成的寡糖可具有不同程度的荷电物质，例如硫酸根和/或磷酸根。此外，化合物可经历许多其它的修饰，包括诸如添加侧分支(side branch)和GAG寡糖的磷酸化等修饰。文库也可由复合结构构成。在这种情况下，与GAG相似的带负电荷单元的长度将不同、连接与GAG相似的带负电荷区域的接头的长度和组成将不同并且所述接头的角度和柔性将不同。
GAG样复合分子的接头结构选自但不限于：肽、多肽或蛋白、化学部分、金属络合剂、饱和或不饱和脂肪酸、脂质、树状聚体、糖、多元醇、葡聚糖、聚乙二醇和支链或非支链烃链和饱和或不饱和烃链。
GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖包括选自但不限于以下的糖类：葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖、氨基半乳糖(galactosamine)、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、岩藻糖、庚酮糖、戊糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醛酸、脱水半乳糖和古洛糖醛酸。寡糖可通过包括多糖群体的多糖酶消化或化学消化的化学修饰法以及选自脱乙酰作用；硫酸化作用；脱硫酸化作用；磷酸化作用及连接侧链的步骤得到。寡糖可包含其硫酸化和/或磷酸化形式和/或其乙酰化形式或含有包括甲基、乙基、丙基或丁基在内的烷基醚衍生物。GAG分子包括肝素、硫酸乙酰肝素和多硫酸戊聚糖(PPS)。因此，肝素、硫酸乙酰肝素、PPS及其片段或衍生物在本文考虑用于结合IL-13或抑制IL-13/IL-13R相互作用。
多糖截短成寡糖可经由许多机制实现。用于截短多糖的方法包括酶方案、化学方案、热方案及超声方案，例如参见Alban和Franz，Biomacromolecules 2：354，2001。
GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖的末端包含4-脱氧-L-苏型-己-4-烯醇吡喃木糖醛酸(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)。所述GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖含有末端氨基葡糖，其由于亚硝酸处理而被修饰并且选自2，5-脱水-D-甘露醇和2，5-脱水-D-甘露糖。
GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖的糖单元具有一个或多个单糖单元、双糖单元或三糖单元，其添加至第6位羟基以提供支链结构。
本发明还涉及诸如包含本文考虑的IL-13调节物的药物组合物的组合物。
术语“调节物”、“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药物”、“活性物”和“药品”在本文中可互换使用以指诱导所需药物作用和/或生理作用的分子，尤其是拮抗或激动IL-13活性或功能的分子。所述术语还涵盖本文考虑的这些活性剂的可药用成分和药理活性成分，包括但不限于盐类、酯类、酰胺类、前药、活性代谢物和类似物等。当使用术语“调节物”、“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药剂”、“活性物”和“药品”时，应理解的是其包括活性剂本身以及可药用盐、药理活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“化合物”不应理解为仅化学化合物而应延伸至肽、多肽和蛋白及其化学类似物。本发明鉴定或筛选的调节物被提出可用于调节包括抑制炎症、抑制纤维化、抑制癌细胞的生长和促进或抑制干细胞的增殖和/或分化的炎症过程。所述调节物包括GAG分子、肝素和硫酸乙酰肝素及其片段或衍生物，或GAG样分子如PPS或其它阴离子多糖。
因此，所述化合物对减少或预防或治疗炎症病况起作用。提及“化合物”、“活性剂”、“药理活性剂”、“药物”、“活性物”和“药品”包括两种以上活性物的组合，例如一种以上IL-13功能或活性的抑制剂和/或增强剂。“组合”还包括两部分以上例如多部分药物组合物，其中药物分别提供并分别给予或分配或在分配前一起混合。
本文所用术语药物的“有效量”和“治疗有效量”意指足以提供所需疗效或生理效应的药物量。非所需效应如副作用有时与所需疗效一同显示；因此，从业医师在确定合适的“有效量”时平衡潜在益处与潜在风险。所需的确切量应根据受治疗者的人种、年龄和一般状况和给药模式等随受治疗者而变化。因此，不可能指定确切的“有效量”。但在任何个体情况中，合适的“有效量”可通过本领域的普通技术人员仅利用常规实验确定。
“可药用”载体、赋形剂或稀释剂意指由非生物物质或非不合乎需要的物质组成的药物载体或溶媒(vehicle)，即所述物质可连同所选的活性剂给予受治疗者而不造成任何或实质上的不良反应。载体可包括赋形剂及其它的添加剂，例如稀释剂、去污剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
类似地，本文提供的化合物的“可药用”盐类、酯类、酰胺类、前药或衍生物为非生物的或非不合乎需要的盐类、酯类、酰胺类、前药或衍生物。
适合注射用途的药物形式包括：无菌水溶液(其中是水溶性的)、用于临时制备无菌注射液的无菌粉剂和吸入形式。这样的形式优选在制备和储藏的条件下是稳定的并且通常被保存免受微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述载体可为溶剂或稀释介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可例如通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂产生预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选的是包含等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。
无菌注射液如下制备：将所需量的活性成分加入含活性成分和任选所需其它活性成分的合适溶剂中，随后灭菌或至少一种方法以减少污染性病毒、细胞或其它生物实体至用于给予人或动物对象的可接受的水平。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生含活性成分及任何另外的所需成分的粉剂。
当活性成分被适当地保护时，其可口服给予，例如连同惰性稀释剂或可同化的可食用载体，或其可包封在硬壳或软壳胶囊中，或其可压制为片剂。对于口服治疗给药，活性成分可掺入赋形剂并以可吸收片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、纸囊剂(wafer)等的形式使用。这样的组合物和制剂应含有至少1％重量的活性化合物。当然组合物和制剂的百分比可变化并且可合宜地在约5-约80％单位重量之间。在这样的治疗上有用的组合物中活性化合物的量为得到合适剂型的量。制备优选的本发明组合物或制剂，致使口服单位剂型含约0.1μg-200mg的活性化合物。备选的剂量包括约0.1μg-约1000mg和约10μg-约500mg。这些剂量可按每个个体或每kg体重。给药可按每秒、每分钟、每小时、每天、每周、每月或每年。
片剂、锭剂、丸剂和胶囊等还可含有下列组分。可加入粘合剂例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当单位剂型为胶囊时，除了以上类型物质之外，其还可含有液态载体。各种其它物质可作为包衣存在或改变剂量单位的物理形式。例如片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或这两者包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和矫味剂例如樱桃味或橙味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质应为药学上纯的并在所应用量中基本无毒的。此外，一种或多种活性化合物可掺入缓释制备物和制剂中。
可药用载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。这样的介质和试剂用于药学活性物质的用途为本领域所熟知，除非任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容，考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可掺入组合物中。
组合物还可配制用于局部给药或表面给药。配制和给药技术可参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton PA.，第16版，1980，由Arthur Osol编辑。因此，对于局部或表面给药，主题组合物可以任何合适的方式配制，包括但不限于霜剂、凝胶剂、油剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、粉剂、气雾剂或气溶胶。对于经粘膜给药，适合渗透屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常为本领域所已知并且包括但不限于苯扎氯铵、洋地黄皂苷、二氢细胞松弛素B和癸酸。
洗剂、霜剂或凝胶剂形式的本发明组合物可含有可接受的稀释剂或载体以赋予所需的质地、稠度、粘度和外观。可接受的稀释剂和载体为本领域技术人员熟悉并且包括但不限于乙氧基化和未乙氧基化的表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(例如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、缓冲剂、纤维素衍生物、乳化剂例如非离子有机碱和无机碱、防腐剂、蜡酯、类固醇、甘油三酯、磷脂类例如卵磷脂和脑磷脂、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水的羊毛脂衍生物和亲水的蜂蜡衍生物。
在一个特别优选的实施方案中，本发明考虑吸入的药物组合物。
本文所用术语“治疗(treating/treatment)”是指减少症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在的原因、防止症状的发生和/或其潜在的原因以及改善或补救损伤。因此，例如“治疗”患者涉及预防易感个体的特定病症或不良的生理事件以及通过抑制或导致病况或病症例如炎症病况或病症的复原治疗临床上有症状的个体。通常，这样的病况或病症是炎症反应或调节或促进炎症反应或是炎症反应的下游产物。因此，例如，“治疗”具有炎症病况或具有发展炎症病况倾向的患者的本发明方法同时涵盖预防和治疗病况、疾病或病症两者。
本文所用“患者”是指可从本发明的药物制剂和方法中获益的动物，特别是指哺乳动物并且更特别地是指人。并没有限制可从本文所述的药物制剂和方法获益的动物的类型。无论人或非人的动物患者都可被称作个体、受治疗者、动物、宿主或受体。本发明的化合物和方法应用于人类医学、兽医学以及通常家畜饲养业或野生动物饲养业。为了方便，“动物”包括鸟类例如家禽、养鸟和猎鸟。
具体的动物是人或其它灵长类、家畜动物、实验室试验动物、陪伴动物或被俘的野生动物。人是最优选的靶标。
实验室试验动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮鼠动物如大鼠和小鼠，提供了便利的试验系统或动物模型。还考虑包括以下的家畜动物：绵羊、牛、猪、山羊、马和驴。非哺乳类动物例如鸟类、斑马鱼、两栖动物(包括蔗蟾)和果蝇属，例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。除了活动物模型之外，试验系统还可包括组织培养系统。
本发明还考虑IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点在制备用于调节受治疗者中的生理过程例如炎症过程的药物中的用途。
如上所述，所述GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点选自AB环中的氨基酸、螺旋D上的氨基酸以及AB环中和螺旋D上的氨基酸。
更具体地说，所述GAG结合位点选自：
(i)包括人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25的氨基酸残基的构象或其等同物；
(ii)包括人IL-13的螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基的构象或其等同物；以及
(iii)包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基的构象或其等同物。
IL-13活性或功能调节物具体可用于治疗一系列的炎症病况，例如过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、哮喘、克罗恩病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、I型糖尿病、龈炎、湿疹(特应性皮炎)、牛皮癣性关节炎、腱炎和多发性硬化症。哮喘和过敏性鼻炎是本文考虑的特别病况。IL-13活性或功能调节物可用于治疗包括纤维化和各种癌症在内的IL-13引起的其它疾病，例如B慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、何杰金氏病，其中IL-13促进了避免凋亡的肿瘤生长/保护以及其它癌症，其中IL-13表现出拮抗肿瘤的免疫监视(上述Wynn，2003)。IL-13与纤维化之间的联系提示IL-13拮抗剂也可在其中长期暴露于IL-13下而触发过度痊愈、组织重建或形成破坏性组织病理的许多情况中有效，在例如特发性肺纤维化、慢性移植排斥、博来霉素诱导的肺纤维化、进行性全身性硬化症、辐射诱导的肺纤维化和肝纤维化的情况中有效。
因此，本发明还考虑治疗或预防受治疗者中的包括炎症过程在内的生理过程的方法，所述方法包括给予受治疗者IL-13活性或功能调节物，所述调节物与IL-13上的GAG结合位点结合或相互作用，所述GAG结合位点选自AB环和螺旋D。
在一个具体实施方案中，GAG或聚阴离子糖缀合物结合位点选自：
(i)包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25的氨基酸残基构象或其等同物；
(ii)包括人IL-13的螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其等同物；
(iii)包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25以及螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其等同物。
本发明将进一步通过以下的非限制性实施例来描述。在这些实施例中，应用下述方法。
IL-13的同源建模
人、小鼠、大鼠和猪的IL-13以及各种备选剪接同种型的序列从SWISS-PROT蛋白序列数据库检索(Boeckmann等，Nucleic Acids Research 31：365-370，2003)。多序列比对用CLUSTALW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22：4673-4680，1994)用BLOSUM(BLOcks of Amino Acid Substitution Matrix)矩阵进行，以便对不同物种和不同亚型中IL-13的个别亚单元之间的序列相似性定量。首先，进行针对蛋白质数据库(Protein Data Bank)的PSI-BLAST(Altschul等，Nucleic Acids Research 25：3389-3402，1997)搜索，以寻找与人IL-13同源的序列，从而鉴定已知结构的蛋白并用作标准同源性建模的通用模板。此外，用不同的序列和二级结构预测算法(PredictProtein[Rost等，Nucleic Acid Research 32：W321-326，2004]和PSIPRED[Bryson等，Nucleic Acid Research 33：W36-38，2005])预测包含不同的二级结构的残基。由SWISSPROT归类的AB环和螺旋D序列提交至折叠识别服务站Phyre (Kelley等，J Mol Biol 299(2)：499-520，2000)[3D-PSSM的后继算法]和CBS Meta Server(Douguet和Labesse，Bioinformatics 17：752-753，2001)。具有已知的AB环和螺旋D区域的晶体结构的IL-13的AB环和螺旋D区域的对比用LALIGN/PLALIGN(Pearson和Lipman，PNAS85(8)：2444-2448，1988)进行。其允许将在建模研究的后续阶段有时可用的新的结构信息包括在内。比对的统计学显著性通过比对两条序列和接着用PRSS模块移行(shuffling)第二条序列200-1000次来计算(上述Pearson 1988)。
结构构建、二硫键的分配、最优化和可视化用分子建模软件包DS Modeling 1.7(Aceelrys，Inc.)进行。环用MODELLER(Fiser等，Protein Sci 9(9)：1753-1773，2000；Sali和Blundell，J Mol Biol234(3)：779-815，1993)中实施的环建模方案建立。将必要的氢和电荷加入结构中。所得蛋白结构的结构质量用PROCHECK(Laskowski等，Journal of Applied Crystallography 26(2)：283-291，1993)、Eval23D(上述Douguet和Labesse 2001)和Verify3D(上述Douguet和Labesse 2001)测试。使用DS Modeling 1.7(Accelrys，Inc.)中实施的DELPHI程序(Gilson和Honig，Nature 330(6143)：84-86，1987)，用CHARM指定的原子部分电荷，以4的蛋白内部介电常数、80的溶剂介电常数和0.145M的离子强度完成静电电势的计算。
人IL-13的备选高分辨溶液结构已通过多维NMR确定并已储存于RCSB蛋白质数据库中，PDB ID：1ijz或1iko(Moy等，J.Mol.Biol.310：219-230，2001)或PDB ID：1GA3(Eisenmesser，等，J.Mol.Biol.310：231-241，2001)。这些结构可用于代替同源建模方法。PDB用BLAST搜索AB环和螺旋D结构域的短重叠区段来调查硫酸酯结合基序。
PatchDock(Schneidman-Duhovny等，Nucleic Acids Res33：W363-367，2005；Schneidman-Duhovny等，Proteins 52(1)：107-112，2003)用于将肝素和其它GAG片段对接(dock)至整个IL-13模型上。PatchDock是一种快速的基于几何学的分子对接算法，其通过最优化形状互补性工作(因此，它并不是基于能量网格的方法)。没有用限制条件限定结合位点，以允许程序能够探索IL-13的整个表面并用RMSD簇集(clustering)寻找合适的相互作用区域，从而减少潜在的结构模式的数目(上述Schneidman-Duhovny等2005)。
目前确定的GAG蛋白复合体的大部分三维X射线衍射结构涉及对它们的蛋白靶标具有不同亲和力的相对小的寡糖(二糖至六糖)。为了确定结合IL-13的AB环/螺旋D结构域所需的肝素片段的最小长度，用二糖和五糖进行对接模拟。肝素五糖的结构可从与PDB代码2HYV中的未饱和六糖复合的膜联蛋白A2的晶体结构中获得。因为第六个糖残基没有观察到电子密度(Shao等，J Biol Chem 281(42)：31689-31695，2006)，从结构直接取出(extract)五糖。肝素五糖的非还原端的残基由UA2S通过将氢加入C-4和C-5之间的双链来修饰，以得到4-脱氧IdoA2S残基(4dIdoA2S)。该模式化的(modeled)五糖由4dIdoA2S(1→4)GlcNS6S(1→4)IdoA2S(1→4)GlcNS6S(1→4)IdoA2S组成。氨基葡糖残基的吡喃糖环采取4C1椅型构象，其中艾杜糖醛酸可采取1C4椅型构象或2So扭船型构象。
二糖(IdoA2S(1→4)GlcNS6S)的结构可从肝素十二糖片段的已报导的NMR结构中取出(PDB结构1HPN)[Mulloy等，Biochem J293(3)：849-858，1993]。
还进行了硫酸皮肤素(DS)四糖(PDB代码1HM2)和从4-硫酸软骨素(CS，PDB代码1C4S)中取出的五糖的对接。硫酸皮肤素五糖没有可用的晶体结构。模式化的DS  四糖由IdoA(1→3)GalNAc4S(1→4)IdoA(1→3)GalNAc4S组成，而模式化的CS由GlcA(1→3)GalNAc4S(1→4)GlcA(1→3)GalNAc4S(1→4)GlcA组成。氢原子添加至这些寡糖中并使所得结构的能量最小化以使可旋转的基团的定位(orientation)最优化。取出通过PatchDock计算的肝素五糖表面积、原子接触能和结合分数。
进一步的对接模拟用程序AutoDock 3.0(Morris等，Journal of Computational Chemistry 19(14)：1639-1662，1998)实施。该程序允许配体结构中的柔性但使用针对蛋白受体的刚体近似法(rigid body approximation)以便加速计算，AutoDock Tools(ADT)(Sanner和Python，J Mol Graph Model 17(1)：57-61，1999)用于通过加入合适的氢、部分原子荷电和救援参数(salvation parameter)产生IL-13分子。对于所有被对接配体的配体可旋转键用AutoDock的AutoTors模块限定。配体是手动原子成型的(atom-typed)，以确保它们遵守AMBER(Weiner等，J.Am.Chem.Soc.106(3)：765-784，1984)的糖力场。使配体能量最小化以使其氢原子的定位最优化。0.37
Figure BPA00001211614700341
的网格间隔(grid spacing)和4.0的距离依赖性介电常数(由Mehler和Somajer，Protein Eng 4(8)：903-910，1991定义)用于结合能的计算，覆盖假定的结合位点表面。运用AutoDock′sLamarckian遗传算法，用一群个体使肝素片段接受搜索运行。网格盒(grid box)用每个肝素片段附近0.37
Figure BPA00001211614700342
的恒定网格间隔，用从PatchDock得到的关于IL-13的AB环和螺旋D结构域的结合位姿(binding post)限定。
由于肝素二糖和五糖的柔性和大小，优化能量评估的数目和遗传群体的大小以确保计算能量的汇聚(convergence)，以5×106的最小值和50×106的最大值的能量评估起始，其如盲对接(blind docking)所报导(Hetenyi和van der Spoel，Protein Sci 11(7)：1729-1737，2002)。簇分析用1.0
Figure BPA00001211614700343
的均方根差(RMSD)容许在所得结合位姿上进行。因为AUTODOCK不能处理多于32个可旋转的键，肝素片段的对接在保持羟基固定下进行。其羟基完全旋转自由的二糖的最低对接能结合分数证实与羟基保持固定所得的最低对接能结合分数相近，证实了羟基的最初定位适用于与IL-13的相互作用。
通过包括上述Raghuraman等，2006的方法在内的任何数目的手段进行组合虚拟筛选。
因此，本文提出组合虚拟筛选方法用于用IL-13-肝素五糖的AB环和螺旋D结构域来预测高特异性肝素/硫酸乙酰肝素序列。对硫酸乙酰肝素/肝素五糖进行模拟，保持内部糖苷键角度常数处于已知溶液值的平均值，不论其序列。在诸如AutoDock和GOLD的软件中用受限的内部糖苷键扭转和内部-环构象但在2-、4-和6-位的柔性取代基下实施用遗传算法(GA)的分子对接。簇分析用与参考位姿(对接的五糖2HYV)相距2.5
Figure BPA00001211614700344
的RMSD容许在所得结合位姿上进行。
五糖序列2HYV或序列ABCDE[IdoA2S(1→4)GlcNS6S(1→4)IdoA2S(1→4)GlcNS6S(1→4)IdoA2S]用AutoDock对接到IL-13的AB环和螺旋D结构域。氨基葡糖残基在4C1椅型构象中建模，而艾杜糖醛酸可以2SO构象或1C4构象存在。配体是手动原子成型的，以确保它们遵守AMBER的糖力场。在SYBL中，SO3基团中的硫原子和氧原子的原子类型分别被修改为2So和2Oco，并且这些原子之间的键类型修改为芳香键。氢原子(不存在于PDB结构中)被添加至SYBYL中并且使所得结构最小化以使只有氢原子的几何位置最优化(非H原子没有变化)。0.37
Figure BPA00001211614700351
的网格间隔和4.0的距离依赖性介电常数(由上述Mehler和Somajer 1991限定)用于结合能量计算，覆盖假定的结合位点表面。运用AutoDock′s Lamarckian遗传算法，用最大能量评估值为50×106的一群个体使肝素片段接受搜索运行。
对接通过AutoDock评分函数驱动。该包括簇集在内的结合和对接能量的自由能估计用于确定最终的对接结果(docked solution)的等级。
与IL-13上的AB环/螺旋D对接的天然五糖结构可用作用于产生GAG模拟物的模板。GAG模拟物可由其中保留了GAG骨架但硫酸基被特定的结构基团各别地置换的结构组成，这些结构基团包括但不限于次黄嘌呤、苯基、酰胺和尿嘧啶基团。对于由天然五糖序列的结构修饰组成的这些GAG模拟物中的每一个，用保留糖构象的限制进行最小化。由于肝素中的IdoA残基可以2SO构象或1C4构象存在，每一个IdoA残基可明确地以这两种不同状态建模。这些序列的对接可依照上述用于天然五糖的方案实施。
产生肝素五糖的组合文库用于IL-13的AB环/螺旋D上的对接。所述文库通过包括1C4和2SO两者的构象考虑IdoA残基结构域的构象柔性。因此，所述组合文库由用平均骨架几何学(与天然五糖相似)以自动方式建立的独特的肝素五糖的可能组合组成。此外，GAG模拟物可通过使用不同的结构骨架产生，以按照促进结合IL-13上的GAG结合位点的方式展示硫酸酯残基(GAG-样寡糖)。
GAG模拟物还可包括GAG样复合结构并归类为聚阴离子糖缀合物。在具体的方面中，糖结构包括两种以上高度带电的(例如硫酸化或磷酸化)二糖或三糖或四糖或五糖或六糖或七糖或八糖或由一个或多个接头分隔的这些糖的任何组合。所述接头并不一定基于GAG样骨架。相反，优选诸如烷基链或多元醇结构或聚乙二醇等接头。此外，高度荷电的糖类不一定基于GAG结构。GAG样寡糖或GAG样复合分子寡糖可包括选自但不限于以下的糖：葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖、氨基半乳糖、甘露糖、甘露聚糖、葡聚糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、岩藻糖、庚酮糖、戊糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醛酸、脱水半乳糖和古洛糖醛酸。寡糖可通过包括多糖群体的多糖酶消化或化学消化的化学修饰法以及选自脱乙酰作用；硫酸化作用；脱硫酸化作用；磷酸化作用及连接侧链的步骤得到。寡糖可包含其硫酸化和/或磷酸化形式和/或其乙酰化形式或含有包括甲基、乙基、丙基或丁基在内的烷基醚衍生物。
多糖截短成寡糖可经由许多机制实现。用于截短多糖的方法包括酶方案、化学方案、热方案及超声方案，例如参见Alban和Franz，Biomacromolecules 2：354，2001。
GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖的末端包含4-脱氧-L-苏型-己-4-烯醇吡喃木糖醛酸。所述GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖含有末端氨基葡糖，其由于亚硝酸处理而被修饰并且选自2，5-脱水-D-甘露醇和2，5-脱水-D-甘露糖。
在本发明的备选实施方案中，GAG寡糖通过以下方法产生，所述方法包括将一群肝素或硫酸乙酰肝素分子或其它聚合物例如K5多糖、壳多糖或壳聚糖按大小分级分离以产生与配体相互作用的非全长分离物。肝素包含在一些二糖单元中并且有不同程度硫酸化的葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸的混合物。分级分离可通过任何合适的手段如通过凝胶过滤柱进行并且基于不同长度的糖链，其通常但不唯独来自一定程度的聚合作用(DP)4-约DP20，例如DP5、DP6、DP7、DP8、DP9、DP10、DP11、DP12、DP13、DP14、DP15、DP16、DP17、DP18或DP19。分离的另一种形式是基于硫酸化的程度。分离还可基于这两种参数的组合。
本发明的另一个方面是提供新型的磷酸化GAG寡糖。当产生GAG寡糖的文库时，这些分子通过增加磷酸化步骤产生。对来源于聚合物如大肠杆菌K5聚合物、壳多糖或壳聚糖的半合成寡糖以及通过GAG如肝素或硫酸乙酰肝素分级分离产生的寡糖两者进行该磷酸化步骤和可能必要的任何相关脱硫酸化步骤。
6-O硫酸酯是最容易水解的O-硫酸酯，由此获得游离的6-OH。接着将游离的6-OH磷酸化以产生6-O磷酸酯。所述硫酸酯和磷酸酯显示在许多化合物中是等效的，尽管在其它化合物中磷酸化改变活性。还可能的是N-磷酸化氨基葡糖残基。
羟基的选择性磷酸化用氨基磷酸酯-氧化法(Vieira de Almeida等，Tetrahedron 55：7251-7270，1999；Dubreuil等，Tetrahedron 55：7573-7582，1999及其中引用的参考)很容易实现。该方法已被广泛应用于肌醇磷酸、核苷酸和寡核苷酸的合成。或者，可采用用于引入磷酸基团的几种其它更快速的方法，例如在吡啶存在下使用三氯氧磷(phosphoryl oxychloride)随后水解。还可能的是通过混杂的己糖激酶媒介(agency)酶促磷酸化这些寡糖。
GAG样寡糖或GAG样复合分子的寡糖的糖单元具有与6位羟基连接的一个或多个单糖单元、二糖或三糖单元以产生支链结构。
接着对依照上述方法制备的每种寡糖混合物测试其作用于或结合IL-13或IL-13R的能力。这可通过实验或虚拟进行。
制备硫酸乙酰肝素/肝素五糖组合文库，用于运用如上所述的AutoDock实施的GA迭代法(iteration)筛选所有可能的序列。在AutoDock中自由能和对接能评分函数(参见表2)帮助鉴定最有潜力的序列，其具有相对高的结合亲和力。第二步骤可由根据与天然的五糖相比在2.5
Figure BPA00001211614700371
RMSD内最高的两个分级结果对这些序列进行簇集组成。
表2
能量评分函数(energy scouring function)
(1)以kcal/mol为单位的最终分子间能量
(2)以kcal/mol为单位的最终配体内能
(3)以kcal/mol为单位的扭转自由能
所述方法有利于获取(extraction)药效团，即鉴定具有高特异性的各个GAG序列或GAG模拟物的关键相互作用。结合了与天然五糖相比的原子RMSD图谱的能量评分函数可很容易从组合文库筛选实验产生，以鉴定能限定药效团的GAG序列或GAG模拟物序列。因此，该方法还可用于设计治疗上有用的分子。
与配体的相互作用可通过任何合适的方法用实验测定，例如凝胶阻滞、过滤阻滞、亲和共电泳、生物发光共振能量转移(BRET)测定法、荧光共振能量转移(FP)测定法、荧光偏振(FP)测定法、闪烁亲近测定法或固定在生物芯片或其它表面上，包括那些与质谱检测连接的表面上。
后者可通过以下步骤完成：首先将GAG寡糖或肝素或GAG-样聚阴离子多糖或聚阴离子糖缀合物固定于芯片上，接着在液相上加入IL-13。或者，可将IL-13固定于芯片上并用于针对GAG寡糖或肝素或GAG-样聚阴离子多糖或聚阴离子糖缀合物与其结合的能力进行筛选。
而另一种备选是将GAG例如肝素固定于固体载体上并接着针对依照以上方法产生的聚阴离子糖缀合物、GAG-样聚阴离子多糖或GAG寡糖抑制IL-13结合固定化肝素的能力进行筛选。
因此，特别有用的试验是混合IL-13和聚阴离子糖缀合物或GAG寡糖或GAG-样聚阴离子多糖并针对聚阴离子糖缀合物、GAG寡糖或GAG-样聚阴离子多糖抑制IL-13与结合芯片的GAG(例如肝素或硫酸乙酰肝素)结合的能力进行筛选。
常见的基于细胞试验涉及测试聚阴离子糖缀合物或GAG寡糖或GAG-样聚阴离子多糖能否抑制由IL-13诱导的细胞增殖。TF-1细胞是通常使用的IL-13反应性人细胞系。IL-13与试验药物预孵育并接着将混合物加入TF-1细胞中，并允许增殖进行48小时，然后测定细胞数。若所述药物结合IL-13从而阻止了IL-13与其细胞表达受体链复合体相互作用，则在混合了药物的IL-13存在下细胞增殖的程度将显著低于仅存在IL-13时获得的细胞增殖的程度。在两种情况中使用相同浓度的IL-13。
实施例1
肝素和硫酸乙酰肝素的序列和结构
研究最深入并且了解最充分的肝素单糖残基序列是作为对抗凝血酶有高亲和力的最低条件的特殊五糖。其是说明肝素的高抗凝血效能的序列，因此其用作抗凝血剂；已合成制得基本的五糖并且其自身用作药物(Petitou和van Boeckel，Angew.Chem.Int.Edit.43：3118，2004)。当清楚肝素作为硫酸乙酰肝素的模式化合物能够与其它蛋白类别例如成纤维细胞生长因子发生重要生理相互作用时(Mohammadi等，Curr.Opin.Struct.Biol.15：506，2005)，抗凝血酶结合序列的实例引致寻找肝素或硫酸乙酰肝素中其它同样特异的序列，所述序列赋予对任何既定结合配偶体的特定亲和力。所述对高等级特异性的搜索基本上是不成功的，并且对能够加强成纤维细胞生长因子(FGF)-介导的细胞生长的结构的新近研究已总结出硫酸乙酰肝素超微结构可能比之前设想的影响性更小(Kreuger和Spillmann，J.Cell Biol 174：323，2006)。
硫酸乙酰肝素往往按序列而非三维结构表示和推测(Mulloy，Anais Acad.Bras.Cienc.77：651，2005)。与肝素寡糖复合的FGF-1(2axm.pdb)的晶体结构(Stauber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：49，2000)清楚地显示与所述蛋白相互作用的硫酸酯基团的模式可以两种方式形成，包括多糖链的任一侧上的硫酸取代基和羧酸取代基的簇。两个单独的FGF-1分子沿肝素链以相反的方向排列(align)，各自与第二簇部分的三个硫酸基簇和两个簇之间的羧酸基相互作用。多糖上的酸性取代基与蛋白表面上的碱性残基之间的基于电荷的相互作用，通常在接触面占优势，而带有所述取代基的糖骨架的具体性质不太重要，只要其以合适的三维方式呈递所述取代基即可。该“假对称性”，其中糖骨架的潜在不对称性通过大量且高度荷电的取代基的几乎对称排列而被隐藏，是解释硫酸乙酰肝素序列对不同蛋白的亲和力的所需条件中的复杂因素。另一种这样的因素是发现对于肝素和蛋白之间的大多数相互作用而言，用另外的硫酸酯基团取代并不减少亲和力。结合这两个因素，简单化的计算指出了31种不同的五糖序列(以氨基葡糖起始和结束)，所述序列含有单个FGF-1结合基序。将所述基序留在原状分子的一侧上，并假定任何或全部的四个剩下的硫酸化位置可或不可被占据，可限定16(24)种不同的可能化合物。对于第二侧重复该实践得到总计31种可能的序列(全部硫酸化的化合物不计算两次)。这样的序列更有可能存在于多糖的高度硫酸化区域。生长因子活性的增强作用比生长因子自身的单一亲和力更复杂，并且清楚的是对于生长因子/受体复合体的功能性相互作用的所需条件不同于单独的生长因子的所需条件(Ostrovsky等，J.Biol.Chem.277：2444，2002)；然而，针对3-D模式的搜索可能比针对特定序列的搜索更成功。
实施例2
药物开发技术
分子建模技术，尤其是其中小分子对接至其结合位点中的那些技术用于新药的设计中。
用于新药设计方法的理论技术的常规应用为取特定蛋白例如酶并观察该蛋白与其配体(例如底物或抑制剂)之间复合体的详细实验结构。在IL-13及其针对GAG的结合位点的结构细节的基础上，提出新的化合物。通过分子建模，利用被称作对接计算的技术筛选化合物，该技术研究蛋白和配体的许多相互定位以找出如何最好地在结合位点中容纳配体。具有对蛋白最佳亲和力的化合物以适宜的低相互作用能量产生理论复合体。
实施例3
BIAcore筛选试验
表面等离子共振的光学现象用于监测分子之间的物理相互作用。使潜在蛋白配体(例如IL-13)溶液经过其中偶联了靶标(例如肝素)的传感器表面，监测蛋白配体与固定化靶标的实时结合。检测通过测量非常接近于传感器表面的折射率变化来实现。当折射率改变时，等离子共振发生的角度改变并且该改变直接和与表面相互作用的蛋白量相关。合宜地使用BIAcore 2000。它非常灵敏并且其微流体确保仅需要少量材料。
生物素化的肝素固定在生物传感器芯片上。生物素化采用磺基-NHS-生物素经由氨基或通过还原性胺化反应用氨修饰的还原端进行。将含潜在的目标蛋白配体的溶液注入传感器芯片表面上，并实时测量结合情况(Fernig，In：Proteoglycan protocols，R.V.Iozzo编辑，Humana Press，Totowa，NJ，USA，2001)。细菌表达的重组人IL-13(rhIL-13)很容易与通过本方法固定的肝素结合。实际上，当结合缓冲液为微酸性(pH 6)(图1)时rhIL-13结合得最好，并且该结合是特异性的，因为rhIL-13与缺少肝素的传感器芯片几乎没有相互作用。此外，rhIL-13与肝素的结合是浓度依赖性的(图1A和1B)。
阴离子糖缀合物制备物多硫酸戊聚糖(PPS)抑制了IL-13与固定在BIAcore芯片上的肝素的结合。滴定实验表明，与肝素本身相比，PPS是与固定化肝素结合的IL-13的更好的抑制剂。这些数据表明PPS结合IL-13上的位点与肝素结合的相同。
PPS是硫酸化木聚糖。并非所有硫酸化木糖多糖均结合IL-13，硫酸化木糖多糖的大小是其结合IL-13并从而阻断IL-13与肝素结合的能力的重要组分。小的硫酸化木聚糖的聚合程度(D.P.)为4或更小将不能抑制IL-13结合固定化的肝素。
实施例4
靶蛋白IL-13上的肝素的功能分析
肝素抑制人IL-13反应性细胞系的增殖。这在非常低剂量下发生并且并不由肝素的毒性作用引起，因为其它类似的硫酸化多糖在相同的IL-13和多糖浓度条件下不起作用。这些实验利用TF-1.8细胞。TF-1.8细胞是TF-1细胞的亚克隆，其已选择在IL-4中生长，并且由于IL-4和IL-13共享受体，这些细胞对IL-13也有响应。TF-1细胞最初建立自患有严重的全血细胞减少症的男性的骨髓样品。这些细胞长期生长依赖于IL-13或GM-CSF并且响应包括IL-4和IL-13在内的多种细胞因子。
TF-1.8细胞已转染了包含在表达载体pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶(pPGK-puromycin-luciferase)中的荧火虫荧光素酶基因(Coombe等，J.Immunol.Methods 215：145-150，1998)。克隆阳性转染子以产生具有良好荧光毒酶表达的细胞系。增殖试验在适于这样的试验的96孔微量培养板中进行(Falcon)。这些孔是平底的，具有白色的边和清晰的底部。洗涤细胞以去除生长培养基中的任何细胞因子并接着重新悬浮于RPMI/5％重量/体积的FCS中。所述细胞用Coulter Z2粒子计数器和大小分析仪(Coulter Electronics，England)计数并常规地将2.5×104细胞加入不含IL-13(阴性对照)或含不同稀释度的IL-13的微量培养板的孔中。当检测PPS或其它硫酸化多糖的作用时，所述孔还含有不同浓度的这些分子。
细胞在37℃下、增湿气氛中增殖48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.8、15mM MgSO4、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM Na-荧光素、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％体积/体积Triton X-100)测量萤光素酶活性。在加入萤光素酶缓冲液后立即检测板的萤光素酶活性。在Victor 1420多标记计数仪(Wallac，Turku，Finland)上检测光放射。
利用该试验，发明人证明了肝素显著抑制IL-13依赖性TF-1.8细胞的增殖(图2A和图2B)，在5-10μg/ml的浓度下提供了IL-13介导的细胞增殖的75-80％抑制，而在2.5-1.25μg/ml的低浓度下提供了55-60％抑制。10μg/ml的肝素是大范围IL-13浓度下细胞增殖的非常有效的抑制剂(图2A)。此外，10μg/ml浓度的蔗糖八硫酸酯有极小的IL-13介导的细胞增殖的抑制活性，甚至在低浓度IL-13条件下(图2A)。
在存在或不存在肝素的条件下检测荧光标记的IL-13与其受体结合的能力。这些实验用不同浓度的已与AlexaFluor-488缀合的IL-13和肝素进行。与显示出不具有抑制IL-13依赖性TF-1.8细胞增殖活性的其它硫酸化多糖的比较证明了特异性。
实施例5
肝素和硫酸乙酰肝素寡糖结合IL-13
HLGAG可通过许多方式部分消化，包括用肝素酶酶促消化以及使用试剂例如亚硝酸、碱β-消除(alkaline β-elimination)以及与碱解聚作用关联的氧化作用的化学消化(Conrad，Heparin binding proteins.Academic Press，San Diego，1998)。肝素酶I和肝素酶III在肝素/硫酸乙酰肝素链上的特异位点切割：肝素酶I在N-硫酸化glcN域的IdoA残基处切割，而肝素酶III在未硫酸化的N-乙酰GlcN域的GlcA残基处切割。
依照如Turnbull等.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(6)：2698-2703，1999)所述的方法使硫酸乙酰肝素解聚，依照如Chai等.(Anal.Chem.70(10)：2060-2066，1998)所述的方法使肝素解聚。简单地说，将肝素(5g)和白蛋白(4mg)溶解于含3mM CaCl2并用0.2M NaHCO3调节pH至7的50ml 30mM CH3CO2Na中。加入肝素酶I，EC 4.2.2.7，(2IU)并将混合物在30℃下孵育16小时。将混合物煮沸3分钟，等份分装成小体积(5ml)并冷冻。使等份试样解冻，离心并在注射前(1ml)在体积排阻色谱系统上过滤。
SEC在两个90×1.5cm串联的玻璃柱上进行。第一柱装填细P6并且第二柱装填细P10。柱利用Gilson model 307钛泵(Middleton，Wisconsin，USA)，用0.25M NaCl以0.25ml/min的流速洗脱并用Shimadzu RID-10折射率检测仪(Melbourne，Victoria，Australia)监测流出液。数据用Gilson Unipoint软件获取。收集1ml流份。混合最大峰值附近的流份，低压冻干并在快速脱盐柱上脱盐。将已脱盐的片段低压冻干，重新溶解于水中并储存于-20℃。各片断的浓度用分光光度法在30mM HCl中用5500mol-1cm-1的消光系数于232nm处测定定。用MALDI MS确证寡糖的大小(参见下文)。
接着将糖数均一的肝素和硫酸乙酰肝素片段的文库用于BIAcore试验中，以测定它们抑制IL-13与固定化的肝素结合的能力。这些实验表明大小在DP 6以下的肝素片段的混合物太小而不能有效结合IL-13并从而阻断IL-13结合固定化的肝素。DP 10以上的肝素寡糖在本试验中有效程度不同，但全长的肝素或硫酸乙酰肝素最有效(图3A)。
糖数均一的肝素和乙酰肝素片段的文库也用于TF-1细胞增殖试验中以确定是否所有多糖具有相同的抑制IL-13刺激的细胞增殖的能力。这些实验表明并非所有的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖具有相同的抑制IL-13活性能力。小的肝素片段(DP6)几乎没有作用而较大的肝素片段(DP10)更有效(图3B)。类似地，小的硫酸乙酰肝素片段(DP8)为无效的抑制剂而较大的片段在本试验中与全长的硫酸乙酰肝素一样有效(图3B)。
实施例6
靶蛋白IL-13上多硫酸戊聚糖的功能分析
PPS抑制人IL-13反应性细胞系的增殖。这在非常低剂量的条件下发生并且不是由多硫酸戊聚糖的毒性作用引起，因为其它类似的硫酸化多糖在相同的IL-13和多糖浓度下没有作用。这些实施利用了TF-1.8细胞。TF-1.8细胞已转染了包含于表达载体pPGK-嘌呤霉素-萤光素酶中的荧火虫荧光素酶基因(上述Coombe等，1998)。增殖试验在适于这样的试验的96孔微量培养板中进行(Falcon)。这些孔是平底的，具有白色的边和清晰的底部。洗涤细胞以去除生长培养基中的任何细胞因子并接着重新悬浮于RPMI/5％重量/体积的FCS中。所述细胞用Coulter Z2粒子计数器和大小分析仪(Coulter Electronics，England)计数并常规地将2.5×104细胞加入不含IL-13(阴性对照)或含不同稀释度的IL-13的微量培养板的孔中。当检测PPS的作用时，所述孔也含有不同浓度的该分子。
使细胞在37℃下、增湿气氛中增殖48小时，之后通过加入50μl萤光素酶底物缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.8、15mM MgSO4、33.3mM DTT、0.1mM EDTA、0.5mM Na-荧光素、0.5mM ATP、0.25mM锂Co A和0.5％体积/体积Triton X-100)测定萤光素酶活性。在加入萤光素酶缓冲液后立即检测板的萤光素酶活性。在Victor 1420多标记计数仪(Wallac，Turku，Finland)上检测光放射。
利用该试验，发明人证明PPS显著抑制IL-13依赖性TF-1.8细胞的增殖(图2B)，5-10μg/ml浓度的PPS阻断75-80％的IL-13介导的细胞增殖。
硫酸化木聚糖抑制IL-13介导的细胞增殖的能力是大小依赖性的。这些实验利用TF-1细胞系，TF1.8细胞来源于此细胞系。该试验如上所述用TF1.8细胞进行，差别在于细胞生长所需的IL-13浓度以及用染料测定细胞数的事实。简单地讲，增殖试验在适于此类试验的96孔微量培养板中进行。洗涤细胞以去除生长培养基中的任何细胞因子并接着重新悬浮于RPMI/5％重量/体积的FCS中并常规地将2.5×104细胞加入不含IL-13(阴性对照)或含不同稀释度的IL-13的微量培养板的孔中。当检测不同大小的硫酸化木聚糖的作用时，所述孔还含有不同浓度的这些分子并且IL-13的浓度保持恒定在2.5ng/ml。细胞增殖48小时，之后通过每孔用20μL的AQUEOUS ONE染料染色3小时定量测定存在的细胞数，接着在490nm处读取吸光度。当使用2.5μg/ml或105μg/ml时，包含2或3个1-4连接的硫酸化木聚糖单元的较小多糖是无效的抑制剂。含有4、5、7或8个1-4连接的硫酸化木聚糖单元的较大多糖抑制了IL-13依赖性TF-1细胞增殖，但最有效的是七糖和八糖以及所有大于八糖的硫酸化木糖多糖的混合物。(图4显示了大小为DP2、DP4、DP5、DP7和DP8的硫酸化木聚糖对IL-13依赖性TF-1细胞增殖的作用的数据。
在存在或不存在PPS的情况下检测荧光标记的IL-13与其受体结合的能力。这些实验用已与AlexaFluor-488缀合的不同浓度的IL-13和PPS进行。与显示不具有抑制IL-13依赖性TF-1.8细胞增殖活性的其它硫酸化多糖的对比证明了特异性。
实施例7
用于鉴定IL-13表面上的肝素结合位点的对接方案
开发的对接策略鉴定蛋白表面上的潜在的肝素结合位点，适用于解释并合理化诸如NMR滴定的实验结果或位点定向诱变实验的设计。因为肝素结构不一定以单一确定的方位结合蛋白，故重点并不放在复合体的几何结构的详细预测或相互作用能量的精确计算。与对接技术的常规应用(其中优化已知的高亲和力结合位点中的小配体分子的几何结构)不同，方案用于针对碱性残基簇筛选小蛋白整体表面，所述碱性残基提供了与沿肝素链的酸性取代基的模式互补的合适形状和电荷分布。
几种肝素寡糖配体模型与蛋白结构的对接如之前所述(Forster和Mulloy，Biochem.Soc.Trans.34：431，2006)用Autodock，2.4版(Morris等，J.Comput.Aided Mol.Des.10：293，1996)用取自AMBER力场的AutoDock版的蛋白原子的部分电荷进行。肝素寡糖配体的坐标获自肝素lhpn.pdb的主要重复双糖的NMR结构(Mulloy等，Biochem.J.293：849，1993)，其带有在1-OMe 4-Ome取代的单糖上的用Jaguar程序(Schrodinger Inc，Portland，Oregon，USA)通过从头计算的部分原子电荷。使用两种五糖配体，各自在还原端和非还原端均带有氨基葡糖。对于它们中的一种，两个艾杜糖醛酸残基均为1C4构象，而另一种均为2S0构象；在肝素中这两种形式是平衡的。这些五糖模型中的所有环外键除糖苷键外均被认为是可旋转的。一些计算可用完全刚性的十一糖配体模型进行。
对接通常在120x120x120点的网格上并增加中心网格点进行。所述网格以蛋白坐标的平均值为中心。网格间隔为0.7埃，形成84x84x84埃的网格。这确定了由该方案能研究的最大蛋白。接着针对配体中的各原子类型(C、N、H、S、O)计算VDW相互作用能量的分别的网格，并且针对单个电子电荷计算静电相互作用能量网格。这些网格在对接过程中用于快速计算配体与蛋白的相互作用能量。这通过寻找各配体原子周围的网格点并使用插补程序(interpolation procedure)寻找当前座标的能量贡献来实现。然后将配体中所有原子的能量汇总起来并将扭转能量项(torsion energy term)加入VDW和静电能中。在对接操作期间，配体结构的位置、方向和允许的扭转角度通过monte carlo模拟的退火程序优化。使用1000的最初模拟温度(以RT单位限定)，使用每个循环0.95的温度减少系数；通常进行128运转300个循环。
在方案的验证研究中选择这些参数，即通过在已知晶体结构的蛋白/肝素寡糖复合体(具有肝素六糖的FGF2(lbfc.pdb)的复合体)上进行模拟[Mulloy和Forster，Glycobiology 10：1147，2000]，调节参数至最可靠地复制已知的肝素结合位点。对接用单位电介(unit dielectric)而非距离依赖性电介(distant dependent dielectric)进行，因为发现该单位电介在复制已知结合位点中更可靠。对接计算通常在300MHz SGI辛烷工作站(octane workstation)上需要约50分钟。对接的配体座标用一套内部PERL脚本从输出文件中取出。
实施例8
对接计算在筛选肝素-结合蛋白的结构数据库中的用途
对接方案很容易在中-高通量的基础上进行，因此具有已知三维结构的蛋白的系统调查的可能性升高，以便补充实验确定的肝素-蛋白复合体的有限数目(Imberty等，Carbohydr.Res.342：430，2007)。然而，PDB中有超过41000种结构，因此已解决的蛋白结构的亚群的最初调查是需要的。在SCOP(蛋白质结构分类)[Murzin等，J.Mol.Biol 247：536，1995]系统(http://scop.mrclmb.cam.ac.uk/scop/)中，包括IL-13在内的4-螺旋细胞因子超家族成员(在所有α蛋白的类别中)形成了合适的群体。它们为小蛋白，在功能和结构上相关，并且全部在细胞外行使其生物学功能，因此它们的环境富含糖胺聚糖。
使用如之前所述的Autodock程序，用关于从PDB文件lhpn.pdb(上述Mulley等1993)中获取的基于肝素的寡糖配体的座标和关于从PDB文件(http://www.rcsb.org/pdb/)PDB ID：1ijz中获取的人IL-13的座标进行半自动的对接计算(上述Forster和Mulloy 2006)。仅选择人IL-13细胞因子的结构。计算为分子间相互作用能量少于1000kcal/mol的肝素-蛋白复合体被认为是结合肝素的能力的预测结果；相互作用能量大于0的那些复合体被认为预测没有结合肝素的能力。Autodock函数的能量单位通常以kcal/mol给出；表中的高的数字为通过使用单位介电常数给予在力场中静电项(electrostatic term)的高加权的结果。给出的值应理解为绝对项中没有显著性的评级函数的结果。使座标可视化和用程序Insight ll和Weblab Viewer(Accelrys)产生数字。
与人IL-13相互作用的肝素五糖的结合性质在表3中列出。
表3
结合IL-13的肝素的预测
Figure BPA00001211614700491
对接还用完全刚性肝素十一糖进行并且该分析的结果在图5中阐述。
实施例9
IL-13上的肝素结合位点的确定
图1显示了野生型IL-13结合固定在生物传感器芯片上的肝素的BIAcore结合曲线。显示了许多不同浓度的IL-13。
在IL-13上进行位点定向诱变。设想的肝素结合位点内的碱性残基和一些酸性残基变为丙氨酸(A)并用杆状病毒表达系统表达蛋白。昆虫细胞表达的蛋白在单克隆抗IL-13抗体亲和柱或多克隆抗IL-13抗体亲和柱上纯化，通过SDS-PAGE和银染检验纯度。对突变的IL-13蛋白检测其结合固定在生物传感器芯片上的肝素的能力，并用BIAcore 2000评价结合情况。野生型IL-13和一些突变蛋白的结合曲线在图6中示出。这些数据表明AB环中的氨基酸残基编号K25以及K97、H102、K104、K105、R108，和R111是野生型IL-13上肝素结合位点的关键残基。IL-13中用于肝素结合的这些关键氨基酸的定位在图5中示出。更具体地说，这些数据表明肝素结合两种常见形式的IL-13：其中第111位为精氨酸的野生型和第111位为谷氨酰胺的多态形式(IL-13Q111)，但野生型IL-13结合肝素能力更强。从分子建模中显示，R111并不直接与肝素链相互作用，但其有助于D螺旋的C端区域的整体碱性电荷，并且由于该肝素更有效结合IL-13的R111形式(图5和图6)。
为了获得关于在溶液中肝素结合各种IL-13突变体的能力的指标，测定可溶性肝素结合各种IL-13突变体从而阻断所述突变体与固定化肝素相互作用的能力。肝素固定在BIAcore生物传感器芯片表面上，并使IL-13突变体和不同浓度的可溶性肝素在液相中。测定抑制IL-13蛋白结合50％所需的肝素的浓度(IC50)，这些数据在表4中示出。
表4
可溶性肝素抑制IL-13蛋白结合固定化肝素的能力
Figure BPA00001211614700501
*使用两种不同制备的生物传感器表面。终点肝素表面与在还原端生物素化的肝素偶联。低密度表面用沿GAG链生物素化的肝素制备。这些生物素化方法以及将肝素偶联至生物传感器表面的方法参见Osmond等，Analyt.Biochem.310：199-207，2002。
相互作用能量的分子建模计算通常与实验数据一致。这些计算针对以下两种背景的IL-13的突变进行：Q111形式和R111形式，并且包含11个糖和5个糖的肝素片段已被建模。此外，肝素五聚物已在艾杜糖醛酸的1C4椅型构象或2So扭船型构象中建模，并且已对每一种计算相互作用的自由能。这些数据在表5和表6中给出。在所有情况下，不论艾杜糖醛酸的构象如何，较长的肝素片段比肝素五聚物的相互作用更强。
表5
与人IL-13结合的已对接的肝素寡糖的相互作用能量：
IL-13Q111背景＊
Figure BPA00001211614700511
*起始坐标：1IJZ.pdb、IL-13单体、111R变体
111q变体和列出的突变体在Insight中通过残基置换建立，没有进一步最小化是因为所有碱性残基是完全暴露的，可能除H102外。
表6
与人IL-13结合的已对接的肝素寡糖的相互作用能量：
IL-13R111背景＊
Figure BPA00001211614700512
*起始坐标：1IJZ.pdb、IL-13单体、111R变体
列出的突变体在Insight中通过残基置换建立，没有进一步最小化是因为所有碱性残基是完全暴露的，可能除H102外。
实施例10
肝素与IL-13蛋白结合的位点与受体结合位点重叠
图2和图4已证明肝素能够抑制TF1.8细胞和TF-1细胞增殖。IL-13上主要肝素结合位点的关键部分在螺旋D上，并且以碱性氨基酸K97、H102、K014、K105和R108附近为中心。D-螺旋中的氨基酸也已被描述为对于结合IL-13Rα1和/或IL-13Rα2是重要的，这些氨基酸是H102、K104、K105、R108、E109和R111(上述Arima等，2005；上述Madhankumar等，2002)。这些数据得到IL-4Rα/IL-13/IL-13Rα1的信号传导复合体的分子建模研究和晶体结构的支持。晶体结构分析进一步提示IL-13上的K104和R108对于与IL-13Rα1结构域3相互作用极其重要(上述LaPorte等，2008)。A螺旋和D螺旋上的一条氨基酸分出了由这些氨基酸的烷基部分划出的疏水峡谷(canyon)。这些侧链形成裂口，受体插入所述裂口中以与细胞因子A螺旋和D螺旋的主链接触，并且尤为重要的是D螺旋上的氨基酸R108和K104的侧链。而似乎R111对于结合可溶性受体IL-13Rα2是重要的(Andrews等，J.Allergy Clin.Immunol.120：91-97，2007)。IL-13Rα1的结构域1与由M33、D87、K89、T35的烷基侧链形成的疏水碟形补丁(saucer-shaped patch)相互作用(上述LaPorte等，2008)。
测定产生最大TF-1细胞增殖的50％所需的每种IL-13突变体的浓度，这些数据在表7中给出。显示了IL-13R111野生型和IL-13Q111变体用于比较。
表7
TF-1细胞增殖50％所需的IL-13的浓度
Figure BPA00001211614700531
表7中的数据与已公开的数据一致，表明D螺旋的C末端上的氨基酸对IL-13功能的主要作用。
IL-13的两种主要多态形式：IL-13Q111和IL-13R111的细胞增殖活性在TF-1细胞试验中是可比的，并且两者对肝素的抑制同样敏感图7A和图7B。用TF-1细胞增殖试验获得这些数据。试验细节在实施例6中给出。这清楚地表明肝素或肝素片段或聚阴离子多糖或聚阴离子糖缀合物可有效地抑制两种天然存在形式的IL-13的生物学活性。
与IL-13Q111和IL-13R111结合的肝素片段的分子建模揭示肝素片段结合IL-13的位点与IL-13Rα1结构域3识别的位点重叠。肝素链以几乎相同的方位结合IL-13Q111和IL-13R111两者(图8)。这意味着抑制两种形式的IL-13的生物学活性机制是相同的。
本发明的技术人员应理解本文所述的发明是易于变化和修改的，而非特定描述的那些。应理解的是，本发明包括了所有这些变化和修改。本发明还包括本说明中单独或一并提及或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个以上所述步骤或特征的任何及所有组合。
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Claims (16)

1.IL-13上的靶位点，所述靶位点的GAG分子或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖调节IL-13的活性或功能，所述靶位点选自位于人IL-13或其同源物或衍生物的AB环和/或螺旋D中的氨基酸。
2.权利要求1的靶位点，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点选自：
(i)包括IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)包括人IL-13的螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)包括IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25以及螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物或其在非人IL-13中的等同物。
3.权利要求2的靶位点，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点为人IL-13的AB环的Q22、Q24和K25以及K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其在非人IL-13中的等同物。
4.一种调节IL-13活性或功能的分离的药物，所述药物作用于或拮抗或激动GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖与IL-13上的位点结合，所述位点选自人IL-13的AB环中的氨基酸残基和/或螺旋D中的氨基酸残基或非人IL-13中的等同物。
5.权利要求4的分离的药物，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点选自：
(i)包括人IL-13上AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25的氨基酸残基构象或非人IL-13中的等同物；
(ii)包括人IL-13的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或非人IL-13中的等同物；以及
(iii)包括人IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或非人IL-13中的等同物。
6.权利要求4或5的分离的药物，其中所述药物为GAG、肝素或多硫酸戊聚糖(PPS)或其片段或衍生物。
7.IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点在设计用于调节受治疗者中如说明书限定的生理过程的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点包括人IL-13的AB环和/或螺旋D内的氨基酸残基构象或非人IL-13中的等同物。
9.权利要求8的用途，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点选自：
(i)包括IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)包括人IL-13的螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)包括IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物或其在非人IL-13中的等同物。
10.一种治疗或预防受治疗者中生理过程的方法，所述方法包括给予受治疗者IL-13活性或功能调节物，所述调节物与IL-13上的GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点结合或相互作用，所述结合位点选自人IL-13的AB环中的氨基酸和/或螺旋D中的氨基酸或非人IL-13中的等同物。
11.权利要求10的方法，其中所述GAG或聚阴离子糖缀合物或阴离子多糖结合位点选自：
(i)包括IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；
(ii)包括人IL-13的螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物；以及
(iii)包括IL-13的AB环中的Q22、Q24和K25和螺旋D中的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111的氨基酸残基构象或其在非人IL-13中的等同物或其在非人IL-13中的等同物。
12.权利要求10或11的方法，其中所述调节物为GAG、肝素或PPS或其片段或衍生物。
13.用于筛选或设计IL-13调节物的计算机程序产品，所述产品包括：
(a)包括座标或分子形状的代码，所述座标和分子形状由人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域限定；
(b)筛选可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体的代码；以及
(c)储存所述代码的计算机可读介质。
14.用于筛选或设计IL-13调节物的计算机，其中所述计算机包括：
(a)包括座标或分子形状的代码，所述座标和分子形状由人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或在非人IL-13中的等同物或其功能性部分或区域限定；
(b)工作储存器，用于储存用于处理所述机器可读数据的指令；
(c)中央处理器，其连接所述工作储存器和所述机器可读数据储存介质以提供可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体；以及
(d)输出硬件，其连接所述中央处理器以接收(a)和/或(b)。
15.用于筛选或设计IL-13调节物的计算机程序产品，所述产品包括：
(a)包括以下座标或分子形状的代码：
(i)人IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D的氨基酸残基编号K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基编号Q22、Q24和K25和螺旋D上的K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物；
(b)筛选可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体的代码；以及
(c)储存所述代码的计算机可读介质。
16.用于筛选或设计IL-13调节物的计算机，其中所述计算机包括：
包括以下座标或分子形状的代码：
(i)IL-13的AB环中的氨基酸残基Q22、Q24和K25或其等同物；
(ii)人IL-13的螺旋D上的氨基酸残基K97、D98、H102、K104、K105、R108、E109和R111或其等同物；以及
(iii)人IL-13的AB环中的氨基酸残基K25和螺旋D上的K97、K104、K105和R108或其等同物，
(b)工作储存器，用于储存用于处理机器可读数据的指令；
(c)中央处理器，其连接所述工作储存器和机器可读数据储存介质，以提供可能结合所述座标或分子形状的已知或理论上的配体；以及
(d)输出硬件，其连接所述中央处理器以接收(a)和/或(b)。
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