CN101969991A - 可诱导细胞介导免疫的疟疾疫苗组合物和组分 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于多抗原决定簇结构的疟疾疫苗，该疫苗可诱导细胞介导的对抗许多种疟疾寄生虫并覆盖大多数HLA等位基因的免疫。多抗原决定簇结构中的抗原决定簇来自已知含有CD4和CD8T细胞抗原决定簇的恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的区域，并含有来自CSP的高度可变和高度保守的区域两者的抗原决定簇。

Description

可诱导细胞介导免疫的疟疾疫苗组合物和组分
技术领域
本发明主要涉及疟疾疫苗。具体的，本发明提供基于多抗原决定簇结构的疟疾疫苗，该疟疾疫苗可诱导细胞介导的免疫，对抗多种恶性疟原虫寄生种的可被大部分HLA等位基因所识别的环子孢子蛋白。
背景技术
疟疾是一种媒介传染病，广泛分布于热带和亚热带地区，包括美洲、亚洲和非洲的部分地区。每年，它引起的疾病约为6亿5千万人，并杀死其中的1到3百万，大部分是撒哈拉以南的非洲的青少年。
该疾病是由疟原虫（Plasmodium）属的原生寄生虫所引起的。该疾病的大部分严重形式是由恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和疟原虫vivax（Plasmodium vivax）所引起的，但是其它相关的种（Plasmodium ovale、Plasmodium malariae，以及有时Plasmodium knowlesi）同样可以感染人类。
疟疾寄生虫是通过雌疟蚊（Anopheles mosquitoes）的叮咬，将寄生虫以孢子的形式转移到人类宿主而传播的。孢子通过血液转移到肝，孢子在肝细胞繁殖，并发育到生命周期的下一形态，裂殖子（merozoites）。当感染的肝细胞破裂后，裂殖子最终释放到血流中。裂殖子然后感染红血球，部分在红血球内转变为雌雄配子体。当另一个蚊子叮咬被感染的宿主，它吸入雌雄配子体，雌雄配子体在雌蚊体内融合成为孢子。然后当蚊子下次吸食时，孢子被转移到另一宿主，如此循环。
疟疾感染引起的主要症状为贫血（头昏、呼吸短促、心动过速等），以及其它的一般症状，比如发烧、冷颤、恶心；类流感症状，严重情况下，昏迷和死亡。通过防止蚊虫叮咬可以减少疟疾的传播，这虽然相当有效，但是具有需要分配和恰当的持续性使用的不利因素。其它措施包括通过在室内喷洒杀虫剂和排干蚊子排卵外的死水来控制蚊虫。不幸的是，杀虫剂的使用存在环境风险，在一些区域，排干所有的死水实际上是不可能的。
在自然感染疟原虫后，人类宿主会生产抗疟原虫的抗体。然而，单一通过抗体产生（体液免疫性）中和寄生虫的能力既不会作为惯性的、抵御性的免疫持续，也不是具有足够记忆特征诱导的细胞性免疫。因此，感染可能会发生多次，使疾病的治疗和预防复杂化。
已有多次努力以生产有效的抗疟疾疫苗。Hui等人的美国专利6660498，公开了使用杆状病毒系统生产重组用于疫苗的主要裂殖性孢子表面蛋白1；Knapp等人的美国专利5393523，公开了制备和使用在重组疫苗的P. falciparum的富组氨酸蛋白；Patarroyo的美国专利4957738和4735799公开了可诱导对抗晚期P. falciparum malaria的抗体的合成肽混合物；Asakura的美国专利4643896公开了一种新型的疟疾相关抗原，CRA，该抗原被描述为与疟疾疫苗一样有用。
不幸的是，尽管有先前的努力，现在依然没有可以有效对抗疟疾的疫苗。特别的，没有开发出可以诱导细胞介导的免疫，对抗所有或大部分疟疾寄生虫菌株的疫苗。代为替换，预防性药物比如奎宁或青蒿素衍生物必须持续的使用以减少感染的风险。这些预防性药物治疗对生活在地方病地区的大多数人来说，一般也过于昂贵。此外，该寄生虫的耐药菌株也普遍增长。
编码或由环子孢子蛋白（在此简写为CSP）的蛋白片段构建的疫苗，在人和动物模型中都显示有免疫原性以有一些有限的保护力。第一个成功的，虽然无法实用的抗疟疾疫苗由带有孢子的辐照过的蚊子组成。值得注意的，疫苗亚单位分散在助剂以诱导细胞免疫反应可以在人类提供比单独使用CSP或助剂更大的保护。含有可被人类的多种HLA型所识别的抗原决定簇的羧基和氨基端的可变区已被确认。迄今为止，基于CSP疫苗的主要缺点是结合到任意具体CSP序列的抗原决定簇的HLA型的宽度，以及细胞和体液免疫反应的持续时间。
现有技术在提供一种安全的、有效的疟疾疫苗方面远未成功，特别是一种可以有效诱导持续细胞介导的对抗大部分寄生虫菌株的免疫反应。
发明内容
本发明基于多抗原决定簇疫苗的设计和开发，该疫苗可以表达源自多种恶性疟原虫菌株的CSP的T细胞抗原决定簇，该抗原决定簇可以被绝大多数人类具有的Ⅰ型HLA超型（supertype）所识别。该疫苗能诱导重要的体液性免疫，以及对抗源自存在于易感人群中的几乎所有恶性疟原虫菌株的CSP的细胞性免疫。
本发明提供新型的具有多个抗原决定簇的多肽，以及编码这些多肽的遗传序列，用于对抗疟疾的疫苗。该多肽中的多个抗原决定簇源自恶性疟原虫的环子孢子蛋白（CSP），CSP已知在疟疾在肝中阶段具有特别的重要性。在常见的疫苗设计中，抗原决定簇选自蛋白的保守区域，与常见的疫苗设计相反，运用在本发明的抗原决定簇选自CSP的高度变化的，已知包含CD4和CD8T细胞抗原决定簇区域，以及已知CD4和CD8T细胞抗原决定簇的高度保守区域。进一步的，选择的该抗原决定簇在人类中可以诱导T细胞与许多人类白细胞抗原（HLA）组产生免疫反应，并可表征全世界大部分普通疟疾寄生虫菌株。特别的，在一个实施例，设计的多抗原决定簇多肽在抗原决定簇之间具有间隔肽，以影响多肽从实际羧基末端（C末端）剪切的水解。因此，通过蛋白质水解从本多肽释放的肽的氨基酸序列，一般是选定的抗原决定簇的氨基酸序列的准确匹配者，也就是说，源自间隔序列的包括氨基酸的肽的产生是最低限度的，或根本就未发生。当抗原决定簇沿着多肽链纵向排列时，没有添加间隔肽，“原始的”序列使原决定簇位于抗下游，确保真实的羧基末端切割位点。
附图说明
图1，源自P. falciparum Asembo Bay菌株的CSP的蛋白序列（SEQ ID NO:14）。
图2，具有示范性的末端重复多抗原决定簇的氨基酸序列（SEQ ID NO:13）的示意图。
图3，存在于CSP蛋白的可变区的T细胞抗原决定簇。
图4，使用公知的可以识别12个超型中的任何一个的9、10和11-mer肽对CSP多肽的扫描绘图（Mapping along）。
图5，簇1-4“热点”的图示。
图6，包括簇1和簇4二者序列的示范性多抗原决定簇的氨基酸序列（SEQ ID NO:39）。
图7，示范性的第一重复多抗原决定簇的氨基酸序列（SEQ ID NO:40）。
图8，编码图7所示的示范性第一重复多抗原决定簇的核酸序列（SEQ ID NO:41）。
具体实施方式
本发明基于含有多种疟疾CSP源的抗原决定簇的新型多肽的开发，以及编码多肽的遗传序列，用于抗疟疾疫苗。选择源自CSP的抗原决定簇是因为这种蛋白已知在疟疾的肝阶段具有特别的重要性。源自P. falciparum Asembo Bay菌株的CSP的蛋白序列如图1所示（SEQ ID NO:14）。之前的抗疟疾疫苗显示有部分效力，这些疫苗引起的免疫反应主要是体液性的，在持续期和菌株专一性的原因，都被显著减弱。相反，本疫苗用以诱导细胞性免疫。
选择用于本发明的抗原决定簇的方法包括生物信息学和数据分析两者。传统的疫苗设计一般仅针对蛋白序列的保守区域，以求提高疫苗的适用性，以对抗有机体的许多种菌株。与这一常规操作相反，就本发明而言，CSP的高度可变区与选定的保守序列一起被包括在内，这是一种非常规的和出人意料的方法。
包括在多肽的抗原决定簇是已知的，或预期可以诱导CD-8细胞免疫反应。本领域的普通技术人员将认识到，为成功对抗并清除细胞内的寄生虫，CD-8反应是必需的；体液性抗体反应显然是不足的。更为重要的，选定的抗原决定簇可在人类白细胞抗原（HLA）组共同诱导CD-8免疫反应以提供覆盖大部分（～98%）的人口。因此，本疫苗在大部分可能暴露于疟原虫的人类中是有效的。此外，选定的抗原决定簇可表征大部分的普通疟疾寄生虫菌株，提供一种广谱的防护，对抗这种传染媒的大部分普通种类。
重要的，本发明的多抗原决定簇多肽的抗原决定簇之间一般设有“间隔”或“连接”肽，影响多肽因为真实的羧基末端（C末端）剪切造成的蛋白水解。“间隔”或“连接”肽，指抗原决定簇下游的最短缩氨酸序列，至少约3个氨基酸，这些肽含有肽剪切（蛋白水解）位点，并使肽可被剪切的连接在一起。换言之，间隔肽不介入选定的抗原决定簇的C末端蛋白水解过程，因此，通过蛋白水解从多肽释放的肽的羧基端与CSP在宿主细胞处理（蛋白水解）时从蛋白释放的肽相一致。优选的，没有（或极少数）通过在间隔肽之内剪切而产生的新的，不定的羧基端。因为抗原决定簇肽的羧基终点是真实的（即与CSP在宿主细胞的活体内剪切产生的一样），源自多抗原决定簇多肽的肽被认为是可与HLA蛋白相结合并诱导CD-8细胞性免疫反应。
选定的用于本发明的抗原决定簇列于表1。
表1，用于多抗原决定簇的抗原决定簇
Figure 67379DEST_PATH_IMAGE002
由表可见，最初的八个抗原决定簇源自CSP的可变区。进一步，抗原决定簇中的7个已知或预知可以结合MHC超型B44，第八个可以结合超型A26。这些抗原决定簇和连接序列的选择的详细说明提供在例1和4中。简言之，与P. falciparum Asembo Bay菌株的288-412序列相当的可变区被分析，以确定已知T细胞抗原决定簇的存在与否。发现一个22个氨基酸的序列含有高浓度的这种抗原决定簇，并使用这一序列从含有源自其他P. falciparum菌株CSP蛋白的序列的数据库中检索高度同源序列。比较检索到的序列，可以从所有主要P. falciparum菌株中选择相关的（即高度一致性）但不是相同的代表可变区的T细胞抗原决定簇肽序列。
在本发明的操作中，在此描述的抗原决定簇可以以多种不同的组合方式应用。例如，在本发明的一些实施例，源自疟原虫CSP的可变区（一般而非必需，P. falciparum CSP）的抗原决定簇被单独作为抗原性序列用于疫苗中。“CSP的可变区”的例子，是与P. falciparum Asembo Bay菌株的288到412残余（下划标记在图1中）相一致的CSP蛋白的原始序列的部分，尽管源自其它疟原虫种的同源区域也可使用。在这种疫苗构建中，至少包括一个来自可变区的抗原决定簇，在一些情况下超过一个来自可变区的抗原决定簇。这样一个抗原决定簇的长度一般为大约5到15氨基酸，将代表毗连氨基酸的序列，将是一种T细胞抗原决定簇。如果包含有来自可变区的多抗原决定簇，它们可作为相邻的，毗连的序列，或如本文所描述的，通过间隔或连接序列分隔，或混合组合，即部分序列是相邻的而其他通过连接序列分隔的形式存在于多抗原决定簇的结构中。这种类型的示范性抗原决定簇包括如SEQ ID NO:1-8所列的序列的。一般的，这种抗原决定簇的长度至少约为5到约25个氨基酸，优选的为5到少于约20个，或更少个数的氨基酸（即6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸）。
在其它实施例，一种或多种来自CSP的保守区域的（在此称为“保守抗原决定簇”）T细胞抗原决定簇包括在疫苗的结构中。特别的，如由表1中SEQ ID NO:9-12所示的保守T细胞抗原决定簇也可能被使用，这些抗原决定簇提供结合到超型A1、A2、A3、A24、A26、B58和B62的能力。这种保守抗原决定簇的选择在下述的例2中有详细的描述。简言之，使用生物信息学计划，明确的，与多个（例如至少3个）超型结合的T细胞抗原决定簇，高度保守的（例如100%保守）覆盖多个来自不同P. falciparum 菌株（例如，覆盖至少60种不同的菌株）的CSP序列被选择。因此，在本发明的一些实施例，至少一个来自可变区的抗原决定簇，与至少一个保守的CSP T细胞抗原决定簇一起，包括在疫苗的结构中。在一个实施例，表1中的每一个抗原决定簇的一个包括在单一的多抗原决定簇中。当以这种方式共同包括时，本发明的抗原决定簇对98%的人类来说是有反应活性的。这种类型的示范性多抗原决定簇如图2（SEQ ID NO:13）所示。
此外，进一步的抗原性序列如在例3中详细地描述被识别。简言之，生物信息学工具被用于识别在具有高浓度的9、10和11mer的，针对所有12种超型的T细胞抗原决定簇序列簇。具有抗原决定簇的最大数字的簇，簇1和4，分别包括ⅰ）Asembo Bay菌株的1-29氨基酸（SEQ ID NO:37）；以及ⅱ）Asembo Bay菌株的385-411氨基酸（SEQ ID NO:38）。这些序列两者中的任意一个或两者也可以包括在本发明的多抗原决定簇结构中。在一个实施例，簇1和4两者都存在于一个多抗原决定簇中，且是以单一的毗连序列（例如SEQ ID NO:39，见例3）存在。在这种情况下，加上在此描述的另一个抗原决定簇，这种序列的单独拷贝可用于构建，或，作为替换，多个拷贝也可被使用，如从约2到约10个或更多拷贝（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多拷贝）。此外，序列SEQ ID NO:37-39中的一个或多个拷贝可被用于同样含有表1中抗原决定簇的一个或多个抗原决定簇，即如上和例1所述的，来自CSP的可变区的抗原决定簇，和/或如上和例2所述的，来自CSP的一个或多个保守抗原决定簇的结构中。
在本发明的一个实施例，表1中的12抗原决定簇中的每一个的至少一个拷贝存在于多抗原决定簇中。一个包括12抗原决定簇中的每一个的至少一个拷贝的示范性多抗原决定簇如图2（SEQ ID NO:13）所示，其中单独的抗原决定簇用方框和下线性标记。本领域的技术人员将认识到，在构建这种类型时，其他结构的抗原决定簇存在于该多抗原决定簇也是可能的。例如，抗原决定簇可以以不同的秩序排列，或可能存在一个或更多抗原决定簇的多个拷贝（例如，可能存在从1到约10个或更多拷贝），和/或可包括额外的免疫原性序列，如簇1（SEQ ID NO:37）和簇4（SEQ ID NO:38），或其组合（SEQ ID NO:39）。一般的，在多抗原决定簇中的所有抗原决定簇将作为单一的多肽链从一个单一的启动子开始表达，如果需要，（任选的）通过间隔或连接序列分隔。但是，在一些实施例，一个抗原决定簇或一组抗原决定簇可能从分开的启动子表达，即作为单独的肽或多肽。在一些实施例，多抗原决定簇（例如，包括所有抗原决定簇和抗原决定簇之间的间隔序列）可能包含在一个更大的多肽内，即多抗原决定簇的两侧存在不是抗原决定簇或间隔序列的氨基酸序列。这种旁侧序列可能是任意类型，并可能具有特殊功能，如，引导多肽转运到预定位置的序列（例如信号肽）；易化结合到目标分子的序列；提高特定构象的获得的序列；对定位、识别或分离多肽有用的序列，等。
在一些实施例，在本发明的多抗原决定簇中的每一个抗原决定簇要么是直接相邻的，要么是通过间隔或连接肽将相邻的抗原决定簇分隔。间隔肽的功能是提高精确的多抗原决定簇的羧基末端剪切（蛋白水解），以释放真实的抗原决定簇（即与通过体内CSP蛋白的蛋白水解产生的肽的序列相同的肽序列）。除了在此图示的示范性多抗原决定簇中的间隔序列，本领域的普通技术人员将认识到还存在其他可用于本发明的间隔肽。本领域的技术人员同样熟悉数据库和分析计划，以实现蛋白水解中心的预测和/或含有优选切割位点的多肽的设计。只要使多肽被剪切后可释放足够数量的精确处理的抗原决定簇，以诱导对抗抗原决定簇的保护性免疫反应，可以使用任何的间隔或连接序列。
在一个实施例，本发明提供一种含有至少一个来自恶性疟原虫Asembo Bay菌株的环子孢子蛋白（CSP）的可变区的抗原决定簇的重组抗原性多肽，CSP的氨基酸序列如图1所示，并公开在SEQ ID NO:14中。根据其原始氨基酸序列，这一CSP蛋白的分子量约为44361。根据本发明，含有至少一个来自CSP的可变区抗原决定簇的重组抗原性多肽，具有的分子量约为CSP的30%或更少，例如，约13500kDa或更少，如从约1000kDa到12000kDa。
就本发明的抗原决定簇而言，例如，如图2所示的示范性多抗原决定簇，本领域的技术人员将认识到可以对该序列进行一定的变化，但仍会接种的宿主体内引起适当的抗原决定簇的提供。例如，可使用其它的间隔肽，以代替保守氨基酸等，只要可以诱导适当的免疫反应就可以了。
本发明包括的如在本文所描述的抗原决定簇及其编码核酸序列（如DNA、RNA等），一般优选连接有表达控制序列。这种核酸序列可能是，例如，存在于运载工具或载体，比如减毒分支杆菌属或其它的菌株、各种病毒载体（如减毒腺病毒载体）、质粒，或其它本领域技术人员所能想到的适当载体的DNA序列。只要应用到接种的宿主的载体会引起在宿主体内产生本发明的多抗原决定簇，并在一定条件下允许多抗原决定簇的正确蛋白酶切处理，在本发明的一些实施例，多抗原决定簇是直接（即作为多肽）应用在适当的组合物中。
本发明提供用于诱导免疫反应和/或接种使个体抗疟疾的组合物。该组合物包括一种或多种如本文所描述的纯化抗原决定簇，或编码这种抗原决定簇的核酸序列，以及适当的药用载体。用作疫苗的这种组合物的制备是本领域普通技术人员所熟知的。一般的，这种组合物要么被制成液体溶液，要么为悬浮液，但是，固态，如药片、药丸、粉末等也是可预料到的。适用于在使用之前溶解，悬浮在液体的固体制剂也是可行的。制剂还可以乳化的。活性成分可以与可接受的，并不与活性成分反应的药用赋形剂混合。适当的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其组合。此外，组合物可含有少量的助剂，如润湿或乳化剂，pH缓冲剂等。此外，组合物可包含其它的助剂。如果要求组合物以口头方式使用，可添加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何额外的成分，以便提供方便使用的剂型的组合物。制剂中多抗原决定簇或编码核酸的最终数量是可变的。但是，一般来说，制剂中的量将在1-99%之间。
本发明还提供诱导抗疟疾的免疫反应的方法，以及接种哺乳动物抗疟疾的方法。该方法主要包括确定适当的疫苗受体，将含有如本文所述的，存在于可接受的药用载体中的抗原决定簇或编码核酸的组合物施加要受体。本发明的疫苗制备可以通过任意一种为本领域技术人员所熟知的方法使用，包括但不限于注射、经口、经鼻、通过摄取含有抗原的食品等。在特定实施例，使用的方法是皮下或肌内注射。
“诱导免疫反应”意味着本发明的疫苗制剂的使用引起特异性抗体的合成（以1到1x106，优选的1x103，更佳的在1x103到1x106之间，最佳大于1x106滴定度）和/或细胞增殖，测量时，可例如通过细胞试验确定IFN-γ的产量或通过3H胸腺嘧啶脱氧核苷结合等进行。在优选实施例，免疫反应是保护性免疫反应，即免疫反应保护接种个体免于未来疟原虫的感染，但是，这并不是所有情况下都必需的，因为提供部分保护的免疫反应仍是极为有益的。该方法包括使用在可接受的/兼容的药用载体中的含有本发明结构的组合物。
用于包含在本发明的多抗原决定簇的适当抗原决定簇的选择和分析，可以使用各种易为本领域技术人员获得的数据库和生物信息学分析工具进行。这种例子（例如，用于细胞毒素T淋巴抗原决定簇预测和分析）包括但不限于NetCTL、NetMHC、EpiJen、MAPPP、MHC通路、WAAP，免疫抗原决定簇数据库和分析源（IEDB）等。
以下是用于进一步说明本发明的非限制性例子。
实施例
例子1，可变抗原决定簇的选择：CSP可变区的分析
对来自恶性疟原虫3D7的CSP蛋白的可变区288到412（图3中的SEQ ID NO:15）的进行分析，根据IEDB数据库，以确定序列之间的异同，是否为T细胞抗原决定簇。识别的T细胞抗原决定簇如图3中的SEQ ID NO:16-21所示。分析结果显示，在这一可变区识别的22个氨基酸序列（SEQ ID NO:15的368-389残余，在图3中的CSP序列中框内，编号为SEQ ID NO:38）包含T细胞抗原决定簇的重要的部分，可被用于查询NCBI数据库以识别含有显示与该22氨基酸肽（KPKDELDYANDIEKKICKMEKC，SEQ ID NO:38）高度相关氨基酸序列的蛋白。这些具有高度同一性的序列进一步通过IEDB分析。结果列于表2。从表中可见，在10个来自多种P. falciparum的序列识别出相似的抗原决定簇，抗原决定簇之间显示有高度的同一性，预测或已知为T细胞抗原决定簇。
表2，所有22氨基酸序列的保守性分析
Figure 922203DEST_PATH_IMAGE004
根据这些结果，代表该22氨基酸序列的氨基末端部分的7个12氨基酸序列和代表该22氨基酸序列近羧基终点的部分的一个9氨基酸序列，被选定包含在本发明的多抗原决定簇内。这些序列列于表1上方（SEQ ID NO:1-8）。利用NetCTL生物信息学程序，对这8个序列进行分析以用于CTL抗原决定簇的预测。程序识别T细胞抗原决定簇和抗原决定簇结合的HLA超型。分析显示这些序列包含B44和A26MHC超型的HLA结合子（见表1）。
例子2，9-mer保守抗原决定簇的选择
使用NetCTL生物信息学程序分析来自恶性疟原虫AsemboBay菌株的CSP的序列，以识别9氨基酸长的T细胞抗原决定簇。结果显示在表3中。
表3，gi│27261257│AAN87611，Asembo Bay菌株的NetCTL分析
Figure 888891DEST_PATH_IMAGE006
从表中可见，共计识别了49个重要的抗原决定簇（总分＞0.75）。其中，仅有36表现为明显的抗原决定簇。24个抗原决定簇预测为可仅结合一个超型，8个预测为结合两个超型，4个预测为结合三个超型。预测可结合三个超型的4个抗原决定簇（表4下方的SEQ ID NO:9、10、11和12）被选定，使用抗原决定簇保守性分析工具，免疫抗原决定簇数据库（IEDB）分析资源用于进一步研究。使用IEDB工具，对来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的280个不同CSP序列中的抗原决定簇的保守性进行分析。结果列于表4中。从表中可见，来自＞69个PF菌株CSP序列的所有4个抗原决定簇是100%保守的。
表4，保守抗原决定簇分析的小结
Figure 221783DEST_PATH_IMAGE008
由SEQ ID NO:9、10、11和12表示的保守序列因此被选定包含在多抗原决定簇中。
例子3，9-11mer抗原决定簇的选择
为了描述所有潜在CTL结合抗原决定簇以及包括长抗原决定簇(比如例子2所描述的9-mer长的抗原决定簇)，使用扩展NetMHC3.0分析工具以识别来自恶性疟原虫Asembo Bay菌株CSP序列中的所有12个超型9、10和11-mer的T细胞抗原决定簇。图1描述了这一CSP序列（SEQ ID NO:14）。所有公认的T细胞抗原决定簇（9、10和11-mer）识别12个超型中的任何一个被图形化映射，其在CSP多肽的分布也被确认。这种分析显示4个清晰的“热点”（见图4和图5中的框示的序列），该“热点”具有最高密度数量的CTL结合子，这些结合子位于两个簇，簇1和4。簇1含有氨基酸1-29，簇4含有氨基酸385-411。两个簇包括通过如上面的例子2所描述的9-mer肽的策略而选定的所有4个“保守的”抗原决定簇。一起，这4个“热点”覆盖了大量的等位基因，如表5所列。
表5，“热点”中等位基因的范围
Figure 36155DEST_PATH_IMAGE010
相应地，优选的结构包含9、10和11-mer的CTL结合抗原决定簇，同样将包括簇1和4中的一个或两者的氨基酸序列。簇1包括氨基酸1-29（MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSS，SEQ ID NO:36），簇4包括氨基酸385-412385-412（KMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN，SEQ ID NO:37）。这两个序列的组合将产生如下序列：[MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN］（SEQ ID NO:38）。这一组合肽包含大量的代表许多超型的CTL结合抗原决定簇。如前所述，本发明的抗原决定簇可包括SEQ ID NO:36、37或38的一个或多个拷贝。图6描述了包括SEQ ID NO:38的示范性多抗原决定簇（SEQ ID NO:39）。
例子4，用于基于9-mer的多抗原决定簇的间隔序列的选择
用于多抗原决定簇构建的间隔序列的选择是通过使用推理ad hoc法进行的。在这一方法中，选定的抗原决定簇的排列次序，以及短的、特定氨基酸序列（间隔子）的插入两者都将考虑到有利于最佳的剪切，考虑如下：
在第一个重复，所有相关肽与短的包含有利于最佳蛋白水解的氨基酸序列的短间隔结合，产生真实的选定肽序列。对多抗原决定簇的原始序列（图7，SEQ ID NO:40）进行NetCTL分析，以确定通过添加间隔子而产生的肽的总数。对原始序列的分析结果识别了相当多数量的新抗原决定簇，其数量可以超过真实的选定肽（例如，在例子提供的，如表6所示，产生了10个识别B7超型的新抗原决定簇）。然后要求使用其它特定氨基酸替代间隔区的氨基酸序列，以再一次重复该过程。重复3-4次后，如对产生的多抗原决定簇的预测分析所示的，具有这种潜在的竞争新抗原决定簇的数量减少了一半（表7）。优化多抗原决定簇的最终版本的氨基酸序列如图2所示（SEQ ID NO:13）。
表6，在如图7所示典型结构的最初重复中的T细胞抗原决定簇的NetCTL预测
 
Figure 547033DEST_PATH_IMAGE012
*“新”抗原决定簇预测通过间隔肽中的伪剪切产生。
表7，在如图2所示典型结构中的T细胞抗原决定簇的NetCTL预测
*“新”抗原决定簇预测通过间隔肽中的伪剪切产生。
多抗原决定簇含有可以结合到8个HLA超型的抗原决定簇。通过总体覆盖率算法（IEDB）进行由本发明的多抗原决定簇中的42抗原决定簇提供的总体覆盖率的完全分析，抗HLA等位基因由8个MHC超型代表，分析显示的平均总体覆盖率为97.74%。以下特定族群之间的覆盖率高达：澳大利亚:97.45%、欧洲:99.67%、北非:99.18%、东北亚：99.43%、东南亚：99.81%、撒哈拉以南的非洲：98.81%。对南美洲（委内瑞拉和部分巴西人群），覆盖率是79.34%，对其它巴西和古巴人群的覆盖率是98.79%。
类似的程序可用于优化预测的蛋白水解，并在其它序列，如SEQ ID NO:38（簇1+簇4）包含在本多抗原决定簇中时，尽可能少的产生新的、假的抗原决定簇。然而，在SEQ ID NO:38的情况下，因为原始序列的存在并被作为切割位点使用，新抗原决定簇的产生是一个小问题。
例子5，用于生产的多抗原决定簇结构的设计和制备
为构建以下部分所描述的rBCG，限制性核酸内切酶（在此简写为“RE”）（New England Biolabs Beverly ,MA）；T4 DNA连结酶（New England Biolabs Beverly ,MA）和Taq聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）按厂家的规程使用；按厂家的规程使用小量（Qiagen MiniprepR kit，Santa Clara，CA）或大量（Qiagen MiniprepR kit，Santa Clara，CA）质粒DNA纯化套装制备质粒DNA；无核酸酶，分子生物学级Milli-Q水、Tris-HCl（pH7.5）、EDTA pH8.0、1M MgCl-2、100%（v/v）乙醇、超纯琼脂糖和琼脂糖凝胶电泳缓冲液购自Invitrogen，Carlsbad，CA。RE酶切、PCR、DNA连接反应和琼脂糖凝胶电泳根据众所周知的程序（Sambrook ,et al. Molecular Cloning :ALaboratory Manual Laboratory Manual .1,2,3;1989；Straus ,et al. ,Proc Natl Acad Sci USA .Mar ;87(5):1889-93;1990）进行。验证下文所描述的每一个重组质粒的DNA序列的核苷酸测序，通过使用Applied Biosystems自动化测序仪，型号373A的传统的自动化DNA测序技术完成。
PCR引物购自商业供应商如Sigma（St.Louis ,MO）或使用Applied Biosystems DNA合成仪（373A型）合成。PCR引物以150-250μM的浓度使用，通过使用Clone manager软件版本4.1（Scientific and Educational Software Inc.，Durham ,NC ）确定PCR反应的退火温度。PCR在BioRad热循环仪（BioRad, Hercules ,CA）进行。用于扩增的PCR引物由软件Clone Manager??4.1版（Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC）设计。RE酶切和PCR随后通过按标准程序（Straus et al ,supra 1990;以及Sambrook et al. ,supra 1989）进行的琼脂糖凝胶电泳分析。阳性克隆定义为一个显示有适当的RE模式和/或PCR模式。通过这一程序识别的质粒使用如上所述的标准DNA测序程序进一步评价。
大肠杆菌菌株，比如DH5a和Stable2R，购自Invitrogen（Carlsbad，CA），并作为重组质粒的初始宿主。通过使用高压电脉冲装置，比如Gene Pulser (BioRad Laboratories ,Hercules CA)，如公开的（Straus et al ,supra 1990），设定在100-200 O，15-25μF和1.0-2.5kV，产生电穿孔将重组质粒引入大肠杆菌菌株。最佳电穿孔条件通过引起每mcg DNA每一细菌的最大转换率的确定而确定。
大肠杆菌一般培养在传统的大豆琼脂（Difco, Detroit，MI ）或大豆肉汤（Difco, Detroit，MI ）中，培养基根据制造商的指南配制。除非另有声明，所有的细菌的培养条件均为37℃，5%（v/v）CO2、慢搅。需要时，培养基添加有抗生素（Sigma，St. Louis，MO）。菌株一般以-80℃，悬浮在（Difco）含有30%（v/v）甘油（Sigma，St. Louis，MO），大约109菌落形成单位（在此称为cfu）每毫升的条件保存。
分支杆菌菌株培养在液体培养基，如Middlebrook7H9或Saulton合成培养基，优选在37℃培养。菌株可以静态或动态培养。此外，通过油酸的添加（0.06%v/v；研究诊断商品目录号01257）和去垢剂如Tyloxapol（0.05%v/v；研究诊断商品目录号70400）可以提高BCG的生长率。BCG的纯化培养可以通过将100微升在磷酸盐缓冲液（在此称为PBS）梯度稀释（如每步10倍至10-8）的BCG培养物的小份平均散布在含有25-30ml固体培养基的3.5英寸培养皿上进行评价，固体培养基可以是Middlebrook 7H10。此外，培养的纯化度可以进一步使用可购得的培养基如巯乙酸培养基（科学实验商品目录号1891）和大豆酪蛋白培养基（BD，商品目录号211768）。
为使多抗原决定簇从表达BCG菌株AFV-102的PfoA的染色体中表达，化学合成编码包括间隔序列（SEQ ID NO:13）的多抗原决定簇的核苷酸序列，并实验连接到来自牛结核杆菌的hsp60启动子以及来自结核分枝杆菌抗原85B的信号肽上。这一序列连接到通过电穿孔进入BCG AFV-102的质粒载体pJFINT上，以有效整合到AFV-102的染色体中。这一载体包括E.coli colE1复制起点、3个由pEX 18gm转录的终止子rrnBT1，T2间隔的多克隆位点，以及rnhA，噬菌体L5（GenBank #Z18946）的attP噬菌体整合区域和噬菌体L5的整合酶基因。L5序列的起始上游，包括有一个由源自Tn10（GenBank#AAM97345）卡那霉素抗性等位基因aphA和sacB基因（GenBank#NP_391325）构成的选择性标记框。标记框侧接有源自Tn1000转座子的γΔ游离酶结合位点同向重复序列。这一质粒在分支杆菌属中不能复制，L5 attP序列使得与分支杆菌染色体的attB区的高频重组得以实现，以利于将质粒序列整合入染色体中。标记框然后可以通过在含有10%的蔗糖的固体培养基中引入γΔ游离酶和无标记菌株的选择从整合的染色体中敲除。
化学合成编码含有4和7氨基酸重复两者的修饰CSP的第二核苷酸序列，用以诱导体液和细胞性反应。这一CSP编码序列缺少信号肽序列、GPI结合位点下游的免疫反应抑制序列，并编码数量减少的CSP蛋白的NANP重复。这一序列同样连接到hsp60启动子和Ag85B信号肽。这一表达框然后同样连接到含有多抗原决定簇表达序列的pJFINT中。
生成的质粒在大肠杆菌Stable2中扩增，证实质粒序列具有卡那霉素抗性克隆。从100ml大肠杆菌培养基分离质粒，电穿孔引入BCG Danish 1331的pfo表达衍生物。在电穿孔后，细胞在添加有10%（v/v）的OADC和0.05%（v/v）的Tyloxapol的7H9培养基中培养过夜，然后平铺培养在50μg/ml卡那霉素的7H10琼脂培养基上。因为质粒并不编码分支杆菌复制起点，所有菌落的卡那霉素抗性测试通过质粒整合进BCG基因组的attB位点得到确认。个别菌落被选择用于PCR分析，以及接种至含有10%（v/v）OADC和0.05%（v/v）Tyloxapol的7H9培养基中以进行抗原表达分析。卡那霉素抗性的PCR特性表明整个质粒序列在重组BCG染色体中的存在，选择AERAS-CSP。使用7H9洗涤AERAS-CSP培养基，并接种到无蛋白的7H9 Tyloxapol培养基中。通过离心获得AERAS-CSP培养基的上清，并使用兔多克隆抗血清免疫印迹恶性疟原虫3D7（ATCC/MR4）的CSP蛋白。免疫印迹显示了修饰的CSP和多抗原决定簇两者的存在。
为了完成疫苗的构建，使其适用于人类使用，该整合质粒的标记框然后被敲除。可电融合的AERAS-CSP细胞与质粒pYUB870hyg电穿孔融合（electroporated），质粒pYUB870hyg编码Tn1000的γΔ游离酶、一个sacB等位基因，以及潮霉素（hygromycin）抗性基因（GenBank#ABD64366）。卡那霉素和潮霉素双抗性转化体在7H10培养基中被筛选，并被接种至含有10%(v/v)OADC和0.05%(v/v)tyloxapol并无抗生素的7H9液体培养基。生长七天后，液体培养物的稀释物涂布在含有10%蔗糖的7H10上，以选择其内的aphA-sacB标记已经消除且由于稀释以及抗sacB等位基因的选择而已遗失pYUB870hyg质粒的重组体。
蔗糖抗性转化体被选出，用于整合抗原框的PCR分析，并如前被接种至7H9液体培养基用于免疫印迹分析。PCR分析显示抗原表达框仍存在于染色体中，而潮霉素抗性标记和sacB基因已被消除。使用抗CSP抗血清对上清和细胞的免疫印迹显示框的去除并不影响CSP多抗原决定簇或修饰的CSP的表达。
例子6，通过使用rBCG AERAS-CSP表达的CSP多抗原决定簇接种带有人类MHC等位基因的转基因鼠而诱导的免疫性
转基因SJL/J鼠在其MHC I等位基因有缺失，表达与在多抗原决定簇编码的肽相当的8个主要人类超型HLA等位基因A1、A2、A3、A24、A26、B44、B58和B62中的一个，购自Jackson Laboratories （Bar，Harbor，Maine ）。鼠被分为4组，每组32只动物，这样每组包括8个HLA型中的每一个都有4只动物。组1-4按如下接种：组1按100μl PBS皮下注射，组2按5×105cfu的亲本BCG AERAS-401皮下注射，组3按5x105cfu的rBCG AERAS-CSP皮下注射，组4按5x105cfu的AERAS-CSP皮下注射，8周后继续肌内注射100ug编码由CMV启动子支配的CSP多抗原决定簇的DNA疫苗。
所有动物在接种后的第10周被处死，收集脾，合并每一组的每一HLA型。通过压使脾通过70μm的细胞过滤器（BD Biosciences，San Jose ,CA）制备单细胞悬浮液。脾细胞再悬浮培养在完全RPMI培养基（R10；含有10%（v/v）胎牛血清（FBS）的RPMI-1640（HyClone，Logan， UT）、55μM2-巯基乙醇、10mM HEPES 、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素（invitrogen， Carlsbad，CA）），以520xg 4℃下离心5min。在每个脾使用1ml ACK溶解缓冲液（BioWhittacker ,Walkersville ,MD）在室温下2min溶解红血球后，洗涤细胞并再悬浮在R10中。在计算和调节细胞浓度到15x106细胞/ml前，单细胞悬浮液再次过滤通过70μM的细胞过滤器。个别来自CSP的，具有匹配包括在多抗原决定簇中的序列的肽是合成的（SynPep Corporation Dublin， CA）。肽稀释在R10培养基中以分别获得1μg/ml和5μg/ml的最终浓度。为分析细胞因子的表达，脾细胞平板以2.5x105细胞/孔，存在或不存在抗原，培养在一式三份的96孔组织培养板中72小时。3天刺激后，收集上清，IFN-γ通过根据厂商的说明使用OptEIATM ELISA套装（BD Biosciences ,San Jose San Jose ,CA）确定。
CSP多抗原决定簇肽特异性通过使用流式细胞仪筛选对IFN-γ进行的细胞内细胞因子染色（ICS）表征。简言之，使用二甲基亚砜(DMSO)(Sigma ,St .Louis ,MO)刺激按上述方法制备的脾细胞，作为阴性对照，与多抗原决定簇相当的肽库（SynPep Corporation Dublin ,CA）被预稀释在含有1μg/ml aCD28和aCD49d mAbs（BD Biosciences ,San Jose ,CA）的R10培养基中。使用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate）（0.1μg/ml）和离子霉素（ionomycin）（4μg/ml）（PMA/I），（Sigma ,St Louis ,MO ）处理的细胞作为阳性对照。为刺激细胞，100μl以上溶液加上100μl每一细胞悬液添加到96孔圆底细胞培养培养皿中，在37℃，5%CO2孵化1小时.最终悬浮液的肽浓度是1.2μM/肽。在添加10μg/ml Golgi-Plug（BD Biosciences ,San Jose ,CA）后，在孵化后，培养皿额外孵化4-5小时，对培养皿处理以进行细胞内细胞因子染色。使用PBS洗涤细胞，并再悬浮在50μl含有1μl FcR阻遏物（Block）（BD Bioscience, San Jose, US ）的PBF（PBS+0.5%FBS）中，冰上孵化10分钟。然后使用预滴定的aCD8-PC5（BD Biosciences ,San Jose ,CA）抗体将细胞染色。Cytofix/Cytoperm缓冲液（BD Biosciences ,San Jose ,CA）被用于预渗透细胞。在细胞内细胞因子染色时，使用aIFN-γ Alexa Fluor -488。在孵化和洗涤步骤之后，接着使用1%甲醛（Sigma ,MO）固定细胞。通过使用CyFlow ML（Partec ,Muenster ,Germany）流式细胞仪收集105个目标细胞事件分析样品。所有数据分析使用FlowJo软件（TreeStar Inc. ,USA）进行，相对单独使用DMSO刺激的细胞的百分比，计算刺激后IFN-γ阳性CD8+T细胞的百分比。
因为接种亲本菌株的鼠缺乏识别和存在于所有这些抗原决定簇抗原决定簇中的必需MHC分子，来自组3和4的鼠脾细胞产生的IFN-γ高于组1和2所确定的背景值将表明这些动物恰当的处理和识别了由AERAS-CSP编码的多抗原决定簇，所需的免疫反应通过接种被诱导出来了。
例子7，使用表达所述的CSP多抗原决定簇的rBCG AERAS-CSP接种的免疫反应的评价
如例子6所述，表达与在多抗原决定簇编码的肽相当的8个主要人类超型HLA等位基因A1、A2、A3、A24、A26、B44、B58和B62中的一个的转基因SJL/J鼠，购自Jackson Laboratories （Bar，Harbor，Maine）。鼠被分为4组，每组32只动物，这样每组包括8个HLA型中的每一个都有4只动物。组1-4按如下接种：组1按100μl PBS皮下注射，组2按5×105cfu的亲本BCG AERAS-401皮下注射，组3按5x105cfu的rBCG AERAS-CSP皮下注射，组4按5x105cfu的AERAS-CSP皮下注射，8周后继续肌内注射接种100μg由CMV启动子支配的编码CSP多抗原决定簇的DNA疫苗。
在接种后第2周，所有动物接受至少10次感染有表达恶性疟原虫CSP的杂交疟原虫berghei孢子体的Anopheles dureni蚊子的叮咬。杂交孢子体的构建及其在疫苗效力研究的使用是本领域技术人员所熟知的。组3和4中接受AERAS-CSP的转基因动物将被保护抗疟疾，而组1和2中的动物将产生贫血、器官损害和与P. berghei疟疾有关脑损害。
例子8，接种表达所述CS多抗原决定簇的rBCG AERAS-CSP对灵长类动物的保护
10只恒河猴要么真皮内接种100μl盐水（4），5x105cfu的rBCG AERAS-401（4），要么真皮内接种5x105cfu的rBCG AERAS-CSP（8）。接种2周后，所有动物试验性接受至少100次来自感染表达恶性疟原虫CS蛋白有杂交疟原虫knowlesi疟疾寄生虫的蚊子的叮咬。杂交孢子体的构建及其在疫苗效力研究中的使用是本领域技术人员所熟知的。所有接受rBCG AERAS-CSP的动物将被保护抗疟疾，而组1和2中的动物未接受多抗原决定簇疫苗，将不受保护，感染疟疾。
本发明已经通过其优选实施例进行了描述，本领域的技术人员将认识到，本发明可以在附加权利要求的精神和范围内进行修改实施。相应地，本发明不应当限定于上述的实施例，而应当进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改及其等同替换。

Claims (23)

1.一种重组抗原性多肽，含有两个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)，
NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)，
ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)，
ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)，
LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，和
IMVLSFLFL (SEQ ID NO:12) 构成的组中的氨基酸序列，
其中所述两个或更多的氨基酸序列肽是i）彼此直接相邻；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
2.一种重组抗原性多肽，含有，
i）3个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，和 
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7) 构成的组中的氨基酸序列，
ii）具有NDIEKKICKM（SEQ ID NO:8）的氨基酸序列的肽；
iii）具有ILSVSSFLF（SEQ ID NO:9）的氨基酸序列的肽；
iv）具有ALFQEYQCY（SEQ ID NO:10）的氨基酸序列的肽；以及
v）一个或多个选自由LIMVLSFLF（SEQ ID NO:11）和IMVLSFLFL(SEQ ID NO:12)构成的组中的氨基酸序列；
其中所述氨基酸序列的肽是i）彼此直接相邻；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
3.编码抗原性多肽的核酸序列，所述抗原性多肽含有两个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)，
NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)，
ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)，
ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)，
LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，和
 IMVLSFLFL (SEQ ID NO:12)构成的组中的氨基酸序列，
其中所述两个或更多的氨基酸序列的肽是i）彼此直接相邻的；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
4.编码抗原性多肽的核酸序列，该抗原性多肽含有：
i）3个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，和 
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7) 构成的组中的氨基酸序列；
ii）具有NDIEKKICKM（SEQ ID NO:8）的氨基酸序列的肽；
iii）具有ILSVSSFLF（SEQ ID NO:9）的氨基酸序列的肽；
iv）具有ALFQEYQCY（SEQ ID NO:10）的氨基酸序列的肽；以及
v）一个或多个选自由LIMVLSFLF（SEQ ID NO:11）和IMVLSFLFL(SEQ ID NO:12)构成的组中的氨基酸序列；
其中所述氨基酸序列的肽是i）彼此直接相邻；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
5.一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用重组抗原性多肽，该抗原性多肽含有两个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)，
NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8)，
ILSVSSFLF (SEQ ID NO:9)，
ALFQEYQCY (SEQ ID NO:10)，
LIMVLSFLF (SEQ ID NO:11)，和
 IMVLSFLFL (SEQ ID NO:12) 构成的组中的氨基酸序列，
其中所述两个或更多的氨基酸序列的肽是i）彼此直接相邻；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切，或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列，其中，所述重组抗原性多肽或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列以足以免疫所述个体的量施用。
6.一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用重组抗原性多肽，该抗原性多肽含有：
i）3个或更多个选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，和 
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7) 构成的组中的氨基酸序列；
ii）具有NDIEKKICKM（SEQ ID NO:8）的氨基酸序列的肽；
iii）具有ILSVSSFLF（SEQ ID NO:9）的氨基酸序列的肽；
iv）具有ALFQEYQCY（SEQ ID NO:10）的氨基酸序列的肽；以及
v）一个或多个选自由LIMVLSFLF（SEQ ID NO:11）和IMVLSFLFL(SEQ ID NO:12)构成的组中的氨基酸序列；
其中所述氨基酸序列的肽是i）彼此直接相邻；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切，或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列，其中，所述重组抗原性多肽或编码所述重组抗原性多肽的核酸序列以足以免疫所述个体的量施用。
7.一种重组抗原性多肽，含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
8.根据权利要求7所述的重组抗原性多肽，其中氨基酸序列存在多个拷贝，多个拷贝是i)彼此直接相邻的；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
9.编码抗原性多肽的核酸序列，所述抗原性多肽含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
10.根据权利要求9所述的核酸序列，其中氨基酸序列存在多个拷贝，多个拷贝是i)彼此直接相邻的；或ii）通过间隔肽彼此分隔，间隔肽允许在所述重组抗原性多肽内发生真实的羧基末端蛋白水解剪切。
11.一种免疫个体对抗疟疾的方法，包括对所述个体施用含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）一个或多个拷贝的重组抗原性多肽。
12.根据权利要求1所述的重组抗原性多肽，进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
13.根据权利要求2所述的重组抗原性多肽，进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
14.根据权利要求3所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步编码氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ38）的一个或多个拷贝。
15.根据权利要求4所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步编码氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ38）的一个或多个拷贝。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述重组抗原性多肽进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
17.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组抗原性多肽进一步含有氨基酸序列MMRKLAILSVSSFLFVEALFQEYQCYGSSKMEKCSSVFNVVNSSIGLIMVLSFLFLN（SEQ ID NO:38）的一个或多个拷贝。
18.一种重组抗原性多肽，含有至少一个来自恶性疟原虫Asembo Bay菌株的环子孢子蛋白（CSP）可变区的抗原决定簇，其中所述重组抗原性多肽的分子量为13500kD 或更小。
19.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述至少一个来自CSP可变区的抗原决定簇是T细胞抗原决定簇。
20.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述至少一个来自CSP可变区的抗原决定簇的氨基酸序列选自由
KPKDELDYENDI (SEQ ID NO:1)，
KPKDELNYENDI (SEQ ID NO:2)，
KPKDELDYANDI (SEQ ID NO:3)，
KSKNELDYENDI (SEQ ID NO:4)，
KSKDELDYENDI (SEQ ID NO:5)，
KPKNELDYEMDI (SEQ ID NO:6)，
KPKDELEYEMDI (SEQ ID NO:7)；和
NDIEKKICKM (SEQ ID NO:8) 构成的组中。
21.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述重组抗原性多肽进一步含有一个或多个保守的CSP抗原决定簇。
22.根据权利要求21所述的重组抗原性多肽，其中所述一个或多个保守的CSP抗原决定簇选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12构成的组中。
23.根据权利要求18所述的重组抗原性多肽，其中所述重组抗原性多肽进一步含有一个或多个选自由SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38构成的组中的抗原决定簇。
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