CN101969980A - 抗-EDb纤连蛋白抗体-IL-2融合蛋白与结合至B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗-EDb纤连蛋白抗体-IL-2融合蛋白和结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子的组合物及其用途。

Description

抗-EDb纤连蛋白抗体-IL-2融合蛋白与结合至B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子的组合物
技术领域
本发明涉及抗-EDb纤连蛋白抗体-IL-2融合蛋白与结合至B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子的组合物以及它们的用途。
背景技术
B细胞非-何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)是一类源于B淋巴细胞前体细胞的组织病理学和临床上独特的恶性肿瘤，其属于最常见的一类血液学恶性肿瘤。因此，来自B-NHL患者的恶性淋巴细胞在其细胞表面上表达如CD20、CD23等的特征性B细胞标记。在美国，每年B-NHL引起超过50000例新诊断病例并且占与癌症有关的死亡病例的5％。
利妥昔单抗(
Figure BPA00001184011100011
R)是一种直接结合至在恶性和正常B细胞群的细胞表面上构成表达的CD20细胞表面表位的嵌合单克隆IgG1抗体。这样，利妥昔单抗(a)引起抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，(b)通过补体-依赖性细胞溶解(CDC)和/或补体-依赖性细胞的细胞毒性诱导淋巴瘤细胞死亡，并且(c)在通过利妥昔单抗进行的CD20结合之后直接诱导细胞凋亡。另外，(d)利妥昔单抗可能具有经由来自利妥昔单抗杀灭的恶性B细胞通过抗原呈递细胞的交叉呈递并启动淋巴瘤抗原特异性细胞毒性T细胞而实施的疫苗接种反应(Selenko et al，2001)。
A)ADCC：这种机制涉及抗体的Fc部分与在具有细胞毒性能力的免疫细胞(如单核细胞、自然杀伤细胞和粒细胞)上表达的Fcγ受体的结合，这随后将会导致结合利妥昔单抗的B细胞通过吞噬作用或释放免疫效应器细胞中包含的细胞毒性粒子而被破坏。ADCC目前被认为是利妥昔单抗作用的主要机制。
B)CDC：因为利妥昔单抗的Fc部分结合至补体，因此淋巴瘤细胞死亡能够通过CDC实现。然而，最近发现在遗传缺失补体因子的小鼠体内仍然出现利妥昔单抗诱导的B细胞减损，这缓和了人们最初对该作用机制的热情。
C)细胞凋亡的诱导：体外研究表明，通过利妥昔单抗进行的CD20结合触发了胞内信号传递事件和抗凋亡因子选择性下调的级联。这也将CD20转移到脂筏(lipid raft)中并经由增加的钙离子活动而活化半胱天冬酶(Janas et al，2005)。在CLL患者中，发现在灌注了利妥昔单抗之后，其他潜在机制如ADCC能够在体内被触发之前的很长时间，循环B细胞就表现出对几种半胱天冬酶和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活化作用(Byrd et al，2002)。
D)免疫接种反应/T细胞响应：临床发现，采用利妥昔单抗的复治与比首次治疗更长的中值响应持续时间有关，并且在响应复治的那些患者中，利妥昔单抗的抗肿瘤效果在从循环系统清除抗体之后会持续较长一段时间(Davis et al，2000)，这些都强烈地暗示了所涉及的特异性免疫机制。
用利妥昔单抗作为单药的治疗在患有几乎每种亚型的B-细胞淋巴瘤的患者中产生了显著的响应而不是中度的和持续时间较短的响应。然而，当其与诱导化疗治疗方案组合时才能观察到其最大的受益(Coiffier，2006)。与标准的化疗疗法结合，尤其是与CHOP(环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和氢化泼尼松)结合，作为在每个化疗周期第一天进行的90-min静脉输注375mg/m2剂量的利妥昔单抗甚至使患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的患者的治愈率从单独化疗的38％提高至约52％(Coiffier 2002，GELA OS数据更新，ASH 2007)
在慢性淋巴瘤中，向每一种诱导化疗疗法组合物(FCM、CVP、CHOP、FND)中添加利妥昔单抗，已经导致总体响应和完全缓解率以及疾病发展的时间延迟的显著提高(Marcus，2005；Hiddemann2005)。然而，向化疗疗法中加入利妥昔单抗并不一定会导致临床效果的改善。在患有套细胞淋巴瘤的患者中，与单独使用CHOP疗法的患者相比，用CHOP+利妥昔单抗治疗导致了类似的无进展生存期和总体生存期(Lenz et al，2005)。
除了作为B-NHL患者中诱导缓解(诱导疗法)的治疗剂的既定作用之外，利妥昔单抗单一疗法也已经评价为一种对巩固相应或延长缓解时间的维持疗法。在假设25mg利妥昔单抗/mL是可接受的最低血清浓度的情况下，发现每3个月输注375mg/m2利妥昔单抗的剂量在预期的药代动力学研究(prospective pharmacokinetic study)中对于利妥昔单抗维持疗法而言是足够的(Gordan，2005)。在采用CVP(Hoechster，2005)或CHOP(Habermann，2006)的初始标准化疗疗法之后利用维持性利妥昔单抗时，尽管一些研究表现出显著的临床受益，但是仍然不清楚利妥昔单抗维持疗法是否为这些用作诱导化疗疗法(例如，R-CHOP)的一部分的患者提供了额外的受益。
遗憾的是，尽管利妥昔单抗与化疗疗法(例如，R-CHOP)组合毫无疑问地具有临床效果，但是大多数B-NHL患者实际上仍死于疾病进展。另外，尽管在治疗B-NHL时利妥昔单抗是一种有效的治疗剂，但是约有50％患有复发/顽固性CD20+滤泡淋巴瘤的患者并不响应于利妥昔单抗的初始治疗(先天抗性；McLaughlin et al1998)，而约60％的先前响应于利妥昔单抗的患者并不会从利妥昔单抗的复治(获得抗性；Davis et al，2000)受益。目前还不清楚这些形式的利妥昔单抗抗性是否是由于恶性B细胞的适应性或受损的宿主免疫效应器机制所致。无论如何，利妥昔单抗抗性明显阻碍了根据进一步改进的临床成果对B-NHL进行的免疫疗法和免疫化疗。
尽管已经对利妥昔单抗/化疗疗法组合进行了分析，但是对于进一步的疗法改进仍存在强烈和持续的需要。目前所追求的两种一般性策略是：a)设计新型抗-CD20抗体，和b)构建靶向于B细胞抗原而不是靶向于CD20的单克隆抗体。目前已经对两类新型抗-CD20单克隆抗体进行了临床上的评价：a)表现出比利妥昔单抗对Fc受体FcγRIIIa(CD16)更高的亲合性的抗-CD20抗体，和b)具有更低免疫原性的抗CD20抗体(人源化；Tbl 1)。这些抗体中假设最强的是GA-101，其是一种具有糖工程化Fc部分和经修饰的肘部铰链(肘形铰链，elbow hinge)的人源化抗-CD20抗体，导致了在针对NHL细胞系的ADCC中10～100倍的增加。采用具有较低免疫原性的抗-CD20抗体小的I/II期研究显示，在复发的B-NHL患者中50％级别的响应率(Coiffier，2006；Hagenbeek，2005；Morschhauser，2005)。已经证实，靶向于B-NHL中除CD20之外的表面分子的单克隆抗体，如lumilixumab(抗-CD23)、依帕珠单抗(epratuzumab)(抗-CD22)、SGN-40和HCD 122(都抗-CD40)、galiximab(抗-CD80)(一种猴源性抗CD80(B7-1)IgG1的单克隆抗体)、apolizumab(Hu1D10)(一种抗人类白细胞抗原HLA DR B链的人源化单克隆抗体)、KRN848、1D09C3(都抗-HLA-DR)，在早期临床试验中具有前景。需要证明新型抗-CD20抗体和直接抗非-CD20B-细胞表位的抗体具有超过利妥昔单抗的显著有益的效力才能被认为是成功的，然而，使用多数这些抗体的早期临床结果仅表现出增加的益处。
人们已经付出了许多努力以使利妥昔单抗与未结合的IL-2组合(Eisenbeis et al.，2004；Gluck et al.，2004)。
然而，近来的II期试验的结果显示，“利妥昔单抗+rIL-2组合疗法是安全的并且一般具有良好耐受性，但是响应度低”(Khan et al.，2006，Clin Cancer Res 2006；12(23)：7046-7053)。而且，人们发现“rIL-2扩展了体内具有FcR的细胞亚组并增强了利妥昔单抗的体外ADCC”。然而，作者得出结论认为，这些发现“并未直接转换成对患有利妥昔单抗-难治的NHL患者有意义的临床受益”。而且，作者推断，“在进行有利地调节利妥昔单抗的抗肿瘤活性的进一步改进之前，可能需要更好理解利妥昔单抗作用的体内机制”。
除了癌症指征之外，抗B-细胞抗体，尤其是利妥昔单抗正在被开发用于自身免疫疾病，包括风湿性关节炎、克罗恩病和自身免疫性溶血性贫血的治疗(Assous et al，2008)。
考虑到目前在临床发展中的标准疗法以及新疗法选择，仍具强烈的医疗需求以用于为B-细胞淋巴瘤患者设计的更加有效的治疗，这优先导致完全缓解和/或用于治疗利妥昔单抗-抗性的淋巴瘤。对于提供治疗自身免疫疾病，尤其是慢性自身免疫性疾病的新药仍具有强烈的医疗需求。
表1：抗-CD20抗体
抗体名称 类型 ADCC   CDC(补体依赖性细胞毒性) 直接效果 参考文献
  利妥昔单抗  嵌合IgG1   ++   ++   +   Cragg et al
  Ocrelizumab  人源化IgG1   +++   +/-   +   Vugmeysteret al
  PRO131921  工程化ocrelizumab   ++++   ++   +
  Veltuzumab  人源化IgG1   ++   ++   +   Stein et al
  Ofatumumab  人IgG1   ++   ++++   +   Hagenbeck etal
  AME-133  人源化IgG1   ++++   ++   ++   Weiner et al
  GA-101  人源化IgG1   +++++   -   ++++   Umana et al
表2：在非-何杰金氏淋巴瘤患者的临床试验中选择的抗-B细胞抗体
抗体名称 类型 DLT   对象响应率，(％，NHL实体)/临床数据 参考文献
 利妥昔单抗   嵌合IgG1   无   48，复发FL   McLaughlin et al
 依帕珠单抗(抗-CD22) 人源化IgG1 无 43，复发FL Leonard et al(a)
 依帕珠单抗+利妥昔单抗   组合   无   67，复发FL   Leonard et al(b)
 Lumiliximab(抗-CD23)   无   当组合w/chemo时在CLL中的活性
 Galiximab(抗-CD80) 人源化IgG1 无 11，复发FL Czuczman et al
 Galiximab    +利妥昔单抗 组合 无 66，复发FL Leonard et al(c)
 SGN-40(抗-CD40) 人源化IgG1 细胞因子释放 0 Advani et al
 HCD122(抗-CD40)   正在进行   正在进行I期试验
 抗-CD22-刺孢霉素(calicheamicin)(CMC-544) 人源化IgG4 血小板减少症 69，复发FL Fayad et al
 结合于假单胞菌外毒素的BL22(抗CD22   溶血性尿毒症综合征   在发细胞白血病中的响应
纤连蛋白的额外结构域B(EDB)是迄今为止描述的被表征得最好的标记之一(Zardi et al.，Embo J.1987；6：2337-2342；Kaspar et al.，Int J Cancer.2006；118：1331-1339)。这个91个氨基酸的III型同源性结构域能够在活性组织重塑期间通过交替剪接机制而插入到纤连蛋白分子中(上文中所述的Zardi et al.)。EDB在健康成熟组织中基本上检测不到，但是在许多侵略性实体瘤的脉管系统中却大量存在。特异于EDB的高度亲合性的人抗体L19的肿瘤靶向能力(Pini et al.，J Biol Chem.1998；273：21769-21776)已经在动物的癌症模型(Tarli et al.，Blood.1999；94：192-198；Borsi et al.，Int J Cancer.2002；102：75-85；Berndorffet al.，J Nucl Med.2006；47：1707-1716；Berndorff et al.，Clin Cancer Res.2005；11：7053s-7063s；Demartis et al.，Eur J Nucl Med.2001；28：534-53)和患有实体瘤的患者(Santimaria et al.，Clin Cancer Res.2003；9：571-579)中充分确立。近来，在各种非-何杰金氏淋巴瘤患者的大多数淋巴瘤-渗透的组织样品中也发现了ED-B表达(Sauer et al.，2006)。
基于目前对基于抗体的癌症疗法(尤其是当与rIL-2或类似的细胞因子组合时)的认知，在小鼠体内的组合疗法实验中出人意料地发现，利妥昔单抗与L19-IL2融合的组合在高剂量L19-IL2组(L 19-IL2高剂量vs.盐水：P＜0.00001)中的5只小鼠中的4只小鼠中建立的拉莫斯淋巴瘤(Ramos lymphomas)中诱导的完全根除，4只中的3只已经在3次注射之后实现CR(完全缓解)。实际上，免疫细胞因子比相应的等摩尔量的未结合的rIL-2与利妥昔单抗的组合显著地更具潜能(L19-IL2高剂量vs.rIL-2高剂量：P＜0.001)。显而易见的是，即使L19-IL2以最低剂量水平与利妥昔单抗组合，仍然会表现出优异的治疗活性(L19-IL2低剂量vs.盐水：P＜0.00001；L19-IL2低剂量vs.rIL-2低剂量：P＜0.00001)，在4个治疗周期之后，在5个病例中的4个中诱导了CR，然而利用高达甚至三倍剂量的与利妥昔单抗组合的非靶向细胞因子仅能够延缓肿瘤生长(L19-IL2低剂量vs.rIL-2高剂量：P＜0.001)。
发明内容
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种至少包含以下部分的组合物：
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体-部分(antibody-part)和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子。
在一种优选的实施方式中，结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子特异性地结合于CD20、CD23、CD22、CD40、CD80、HLA-DR或Hu1D10。
在一种优选的实施方式中，结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子选自抗体、抗体片段或抗体模拟物。
优选是全长抗体或抗体片段，或其融合蛋白的特异性结合于CD20、CD23、CD22、CD40或CD80的分子。
在一种尤其优选的实施方式中，抗体或抗体片段、或它们的融合蛋白特异性地结合于CD20。
在一种实施方式中，本发明涉及一种至少包含以下部分的组合物
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体部分和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)特异性结合于CD20的分子。
在另一种实施方式中，本发明涉及一种至少包含以下部分的组合物
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体-部分和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)特异性结合于表达CD20的细胞的分子。
在一种尤其优选的实施方式中，特异性结合于表达CD20的细胞和/或特异性结合至CD20的分子是特异性结合于CD20的抗体或抗体片段。
在一种优选的实施方式中，(i)的抗体-部分特异性结合于纤连蛋白(FN)的EDb-结构域。这种抗体在现有技术中是已知的并且例如描述于WO 97/45544中。
在另一种实施方式中，特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体结合于隐含的表位。这种抗体的实例是BC-1抗体。
优选地，这种结合于纤连蛋白的EDb-结构域的抗体对FN的EDb-域表现出高度亲和性，具体而言，该抗体以纳摩尔或亚纳摩尔亲和性结合于EDb纤连蛋白结构域。这种抗体在现有技术中是已知的并且例如描述于WO99/58570中。
尤其优选的是L19抗体。
特异性识别EDb纤连蛋白的抗体部分，尤其是L19抗体，能够应用于各种抗体形式中。优选的抗体形式是全长IgG、Fab、(Fab’)2、scFv、双特异抗体(diabody)、微抗体或小免疫蛋白(SIP)形式。尤其优选的是L19抗体的全长IgG、scFv和SIP形式。最优选的是scFv形式的L19抗体。几种免疫蛋白形式在现有技术中是已知的，例如基于IgE的CH3结构域或εs2-CH4结构域。基于IgE的εs2-CH4域和全长IgG形式的L19的优选L19SIP形式例如描述于WO03/076469中。
在另一种优选的实施方式中，抗体-部分含有L19抗体的至少一个CDR序列。
在一种尤其优选的实施方式中，抗体-部分包含L19抗体的CDR序列，尤其是其包含根据SEQ ID no.6至11的序列。
在另一种优选的实施方式中，抗体-部分包含L19抗体的VL和VH链。在一种优选的实施方式中，其包含根据SEQ ID No.1的至少一个VH链或根据SEQ ID No.2的至少一个VL链。在一种尤其优选的实施方式中，其包含根据SEQ ID No.1的至少一个VH链和根据SEQ ID No.2的至少一个VL链。
在另一种优选的实施方式中，抗体-部分包含根据SEQ ID No.1的一条VH链和根据SEQ ID No.2的一条VL链。在另一种优选的实施方式中，抗体-部分包含根据SEQ ID No.1的两条VH链和根据SEQ ID No.2的两条VL链。
在另一种优选的实施方式中，VH链和VL链通过抗体连接子连接。
在一种优选的实施方式中，抗体连接子包含根据SEQ ID No.3的序列，或与根据SEQ.ID.No.3的序列具有至少90％同一性的序列。
特异性结合于EDb-纤连蛋白的抗体-部分被融合于白细胞介素-2。两个部分都可以直接融合，或可以经由连接子融合，尤其是通过肽融合蛋白连接子融合。优选地，融合蛋白连接子的长度为1～30个氨基酸。在一种尤其优选的实施方式中，融合蛋白连接子包含根据于SEQ ID No.5的序列。
在另一种尤其优选的实施方式中，白细胞介素-2是人白细胞介素-2(人IL-2)。
白细胞介素-2可以重组生产或可以从人体组织中分离，优选重组生产(rIL-2)。在一种尤其优选的实施方式中，白细胞介素-2部分包含根据SEQ.ID.No.4的序列，或其功能性变异体。
融合蛋白可以是单体、或多聚体，例如二聚体。二聚体或其他多聚体形式可以共价地或非共价地形成。例如，L19(scFv)-IL2可以形成非共价的同型二聚体。
融合蛋白优选利用技术人员已知的方法重组生产。具体而言，可以使用原核或真核表达系统，例如，酵母或哺乳动物表达系统。
本发明的组合物进一步包含结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子。
在本发明一种实施方式中，结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子被标记，尤其是被放射性标记。优选地，该标记是共价标记。
在一种尤其优选的实施方式中，结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的经标记分子是放射性标记的抗-CD20抗体。各种放射性的标记物都用于医药中。
用于标记抗体和蛋白的尤其有用的放射性同位素是90Y、111In和131I-标记。在一种尤其优选的实施方式中，用90Y、111In或131I来标记抗-CD20的抗体。
在一种尤其优选的实施方式中，放射性标记的抗-CD20抗体选自Y-90-替伊莫单抗(Y90-
Figure BPA00001184011100111
或-)和I-131托西莫单抗
Figure BPA00001184011100113
Y-90-替伊莫单抗及其生产例如作为Y2B8(钇-[90]-标记的2B8-MX-DTPA)披露于EP 0 669 836中。
在一种优选的实施方式中，本发明的组合物进一步包含特异性结合于CD20的分子。在一种尤其优选的实施方式中，该分子是抗体或抗体片段、或它们的融合蛋白。
尤其优选表现出ADCC活性的抗-CD20抗体。
在另一种优选的实施方式中，抗-CD20抗体选自利妥昔单抗、Ocrelizumab(一种全人化抗CD20单克隆抗体)、PRO131921、Veltuzumab(一种人源化IgG1抗体)、Ofatumumab(一种具有细胞溶解作用的单克隆抗体，能与正常和恶性B淋巴细胞表面的CD20抗原结合)、AME-133、和GA-101。
在本发明一种优选实施方式中，特异性结合于CD20的抗体是全长IgG、Fab、(Fab)2、scFv、双特异抗体、微抗体或小免疫蛋白(SIP)形式。
而且，抗-CD20抗体可以是单体或多聚体，例如二聚体。多聚体抗体可以是同聚体或异聚体。例如，可以使用二价抗体，其中一部分特异性结合于CD20而另一部分结合于另一靶标。而且，特异性结合于CD20的分子可以进一步包含效应器，尤其是其可以被放射性标记。在本发明的这种实施方式中，可以使用如上文中所述的
Figure BPA00001184011100121
或
Figure BPA00001184011100122
一种尤其优选的抗-CD20抗体是利妥昔单抗，尤其是
Figure BPA00001184011100123
(也被称为
Figure BPA00001184011100124
或IDEC-C2B8)。是直接针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体。该抗体是含有鼠轻链和重链可变区域序列和人恒定区序列的IgG1κ免疫球蛋白。利妥昔单抗公开于例如美国专利5,843,439；5,776,456和5,736,137中。
在一种更优选的实施方式中，该组合物包含利妥昔单抗和L19-IL2。
在一种更加优选的实施方式中，L19抗体为scFv形式。
尤其优选L19-IL2，其描述于文献Carnemolla et al.，Blood.2002；99：1659-1665中。
本发明另一实施方式涉及上述的组合物用于作为医药的应用。
本发明另一实施方式涉及上述的组合物用于作为治疗肿瘤的医药的应用。
在一种优选的实施方式中，癌症是淋巴瘤，优选B-细胞淋巴瘤。最优选本发明的组合物用于治疗B-细胞非-何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)的应用。
在另一种优选的实施方式中，B-细胞淋巴瘤是难治的或复发的B-细胞淋巴瘤或利妥昔单抗单一疗法抗性的淋巴瘤。
本发明进一步涉及治疗癌症的方法，其中本发明的组合物以治疗有效剂量给予癌症患者。优选地，癌症是淋巴瘤，优选B-细胞淋巴瘤，尤其是NHL。
本发明的另一实施方式涉及以上描述的组合物作为治疗自身免疫疾病，尤其是慢性自身免疫疾病的药物的应用。
在一种优选的实施方式中，自身免疫性疾病是风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)或自身免疫性溶血性贫血。
患者能够是任何哺乳动物，优选患者是人类。
各种给药途径都是可能的，例如经静脉、皮下或腹膜内给药，其中经静脉给药是优选的。
而且，特异性识别EDb纤连蛋白的融合蛋白和结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子可以同时给药或在不同的时间点给药。而且，该组合物可以一次或分几次向患者给药。而且，也可以将该组合物的一种组分一次给药，而另一组分分几次给药。
典型地，如果利妥昔单抗和L19-IL2作为组合疗法给药，则它们可以以相同时间点给药，因为这使得能够更容易地实施给药方案。例如，利妥昔单抗和L19-IL2都可以在从几天到长达3月的时间间隔内每天一次或两次静脉给药。而且，可以给药一个或多个治疗周期。
而且，给药量可以进行变化。例如，利妥昔单抗可以以每次给药约20～500mg/m2，优选约100～400mg/m2，尤其是约375mg/m2利妥昔单抗的量进行给药。典型地，利妥昔单抗在第2周、第3周、或第4周治疗计划的第一天给药并持续多达6～8个治疗周期(缓解诱导)，但是其他给药计划也是可能的。
通过将具有所需纯度的活性药剂与可选的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合，以冻干制剂或水溶液形式制备根据本发明使用的活性药剂的治疗制剂储存备用。
示例性抗-CD20抗体制剂描述于WO 98/56418中。其披露内容描述了包含40mg/mL利妥昔单抗、25mM乙酸酯(盐)、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨醇酯20且pH为5.0的液体多剂量制剂，其储存在2～8℃下的货架期最少为两年。所关心的另一种抗CD-20制剂包含在9.0mg/mL氯化钠中的10mg/mL利妥昔单抗、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80、和注射用无菌水，pH为6.5。适用于皮下给药的冻干制剂描述于WO97/04801中。这种冻干制剂可以用合适的稀释剂再生为高蛋白浓度，而再生的制剂可以经由皮下给予本文中所治疗的患者。
而且，对于融合蛋白，给药的量可以是不同的。典型地，每次给予的L19-IL2的量为约1～10×106IU/m2，尤其是约5～50×106IU/m2，尤其是约10～30×106IU/m2。
给药量可以随时间变化，例如，利妥昔单抗和/或L19-IL2的量可以对于一个或多个给药周期增加或降低。
而且，维持治疗，尤其是单独采用利妥昔单抗或L19-IL2进行维持治疗，可以遵循组合物治疗阶段进行。
而且，可以采用L19-IL2来支持用含抗体组合物进行的针对抗B-NHL的治疗，尤其是化学免疫疗法方案(例如，R-CHOP)。
抗体连接子是任何连接子，优选肽连接子，其适用于连接Vh和Vl结构域。合适的连接子例如描述于文献Bird et al，Science，242，423-426，1988；Huston et al，PNAS USA，85，5879-5883，1988，EP 0 573 551；EP 0 623 679和EP 0 318 554中，这些文献结合于本文中作为参考。
融合蛋白连接子是适用于抗体或抗体片段和第二种生物学活性蛋白的连接子，优选该连接子是肽。适合的连接子描述于EP 0 573551；EP 0 623 679和EP 0 318 554中，这些文献结合于本文中作为参考。具体而言，合适的连接子描述于EP 0 623 679中。
如本文中所使用的，“特异性结合”或“特异性识别”是指结合于对应的靶。典型地，结合分子、抗体、抗体片段或抗体模拟物以至少约1×10-7M，优选至少约1×10-9M的亲合性结合，并且以大于其结合于除预定靶或紧密相关的靶之外的非特异性靶(例如，BSA、干酪素)至少两倍的亲合性结合于预定的靶。
如本文中所使用的，“抗体”包含全长抗体和抗体片段，全长抗体包括天然抗体、单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、和全长IgG抗体。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，其中可变结构域或功能容量被保留，即特异性结合于靶。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、scFv和scFv-Fc片段、双特异抗体、线性抗体、小免疫蛋白形式、单链抗体、微抗体、由抗体片段形成的双特异抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段通常比全长抗体要小。由此，药代动力学是不同的并且一些抗体片段仅仅由一条多肽链构成，其能够容易地生产。然而，这种包含抗体片段的融合蛋白经常具有降低的稳定性。优选地，抗体片段是scFv、(scFv)2、或小免疫蛋白形式。小免疫蛋白形式能够是基于CH3-结构域(例如描述于US 5,837,821)或人IgE的εS2CH4-结构域(例如描述于WO 03/076469)的形式。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指由一组基本上同种的(homogeneous)抗体获得的抗体；也就是包括与除了可以少量存在的天然发生的突变之外群体相同的群体的单个抗体。单克隆抗体是高度特异性的，其直接针对单一抗原决定基(也被称为表位)。修饰语“单克隆”是指涉及相同表位的基本上同种的抗体群而不能被解释为以任何特定方法进行抗体的按需生产。单克隆抗体能够通过本领域已知的任何技术或方法来制备；例如，首次由文献Koehler et al.，1975，Nature 256：495报道的杂交瘤方法，或本领域已知的重组DNA方法(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。在另一实施例中，也能够采用描述于文献Clackson et al.，1991，Nature 352：624-628，and Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.222：581-597中的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
相比而言，多克隆抗体制备中的抗体典型地是免疫球蛋白同种型和/或类别的异种群，并且也表现出不同的表位特异性。
如本文中所使用的，术语“嵌合”抗体是一类型的单克隆抗体，其中在重链和/或轻链的一个或多个区域或结构域中的一部分或全部氨基酸序列相同于、同源于来自另一物种或属于另一免疫球蛋白类型或同种型或来自保守序列的单克隆抗体中相应序列；或者是来自另一物种或属于另一免疫球蛋白类型或同种型或来自保守序列的单克隆抗体中相应序列的变异体。
某些类型的抗体片段能够通过酶处理全长抗体而产生。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段和残余″Fc″片段，每一个片段具有单个抗原结合位点，如此称谓是因为其易于结晶的能力。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍能够与抗原交联。
Fab′片段不同于在CH1结构域的C-端存在几个附加残基的Fab片段，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab-SH是本文中对于Fab′的称谓，其中恒定结构域的(一个或多个)半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab′)2抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基连接的成对Fab′片段。抗体片段的其他化学结合也是已知的。
“Fv”是含有完全抗原识别以及由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密非共价结合构成的结合位点的最小抗体片段。在这种结构中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH VL二聚体表面上的抗原结合位点。这六个CDR共同为抗体赋予抗原结合特异性。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段是包含抗体VH和VL结构域的单链Fv变异体，其中该结构域存在于单个多肽链中并且能够识别并结合抗原。scFv多肽可选地含有位于VH和VL结构域之间的多肽连接子，其能够使scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见，例如，Pluckthun，1994，In The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore eds.，Springer-Verlag，纽约，第269-315页)。
术语“双特异抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段。每一片段含有连接于轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能使同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，迫使连接的VH-VL结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。
双特异抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和文献Hollinger et al.，1993，Proc.Nat.Acad.Sc.USA 90：6444-6448中。
人源化抗体或人源化抗体片段包括免疫球蛋白氨基酸序列变异体或其片段，其能够结合至预定抗原，并且包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的一个或多个框架区(FR)和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个CDR。该非人氨基酸序列在本文中被称为“输入”序列，其典型地取自于“输入”抗体结构域，尤其是可变结构域。一般而言，人源化抗体包括至少包括至少非人抗体的CDR或HVL，插入人重链或轻链可变结构域的FR之间。
“天然抗体(native antibody)”在本文中被定义为异源四聚体糖蛋白(heterotetrameric glycoprotein)，典型地为约150,000道尔顿，由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成。每一轻链通过一个二硫键共价连接至重链而形成异源二聚体。异源四聚体通过这种异源二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键连接形成。尽管轻链和重链通过一个二硫键连接到一起，但是两条重链之间的二硫键的数目依免疫球蛋白同种型而有所不同。每一重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每一重链在氨基端具有可变结构域(VH)，接着是三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，以及CH1和CH2之间的铰链区。每一轻链具有两个结构域，氨基端可变结构域(VL)和羧基端恒定结构域(CL)。VL结构域与VH结构域非共价结合，而CL结构域一般经由二硫键共价连接于CH1结构域。特定的氨基酸残基被认为形成了轻链和重链可变结构域之间的界面(Chothia et al.，1985，J Mol.Biol.186：651-663.)。术语“高可变”是指这个事实，即在可变结构域中的某些序列在抗体中的序列中广泛不同，并且含有与每一特定抗体对于其特异性抗原决定基的结合和特异性直接相关的残基。轻链可变区和重链可变区中的高可变性都集中在已知为互补决定区(CDR)或高可变环(HVL)的三段中。CDR通过文献Kabat et al.，1991，In：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.中的序列比对来定义，而HVL结构上根据可变结构域的三维结构来定义，正如文献Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917中的描述。
在这些两种方法导致CDR稍微不同的识别的情况下，结构限定是优选的。正如Kabat的定义，在轻链可变结构域中，CDR-L1大约位于残基24-34处，CDR-L2大约位于残基50-56处，而CDR-L3大约位于残基89-97处；在重链可变结构域中，CDR-H1大约位于残基31-35处，CDR-H2大约位于残基50-65处，而CDR-H3大约位于残基95-102处。
术语“标记”是指直接或间接结合于抗体的可检测化合物或组合物。标记可以自身是可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
尽管纤连蛋白(FN)是单个FN基因的产物，但所得的蛋白能够以多种形式存在，其-除翻译后修饰之外-源自其初级RNA转录本的选择性剪接。这种导致人FN的20多种不同亚型，并由此产生具有不同溶解性、细胞粘附性和配体结合性能的FN的多态性，提供了具有按照组织特异性模式改变胞外基质(ECM)组成的可能性的细胞。选择性剪接发生在初级RNA转录本的3个区域：外显子的应用或跳跃导致包含或不包含两种III型重复，额外结构域B(EDB或ED-B，也被称为EIIIB或EDIII)被插入到FN的III型重复III7和III8之间，或/和额外结构域A(EDA，也被称为EIIIA或EDI)被插入到FN的III型重复III11和III12之间。这种类型的剪接出现在许多脊椎动物中，包括爪蟾、鸡、大鼠、狗和人。
“ED-B结构域”被理解成人纤连蛋白的额外结构域B。其经常被称为EDb、EIIIB或EDII。
“抗体模拟物”被理解为基于特异性结合于靶而不同于抗体和抗体片段的蛋白框架(“支架”)的结合分子。这种支架描述于文献Binz et al.，2005，Nat.Biotechnol.23，1257-1268中。特异性结合于ED-B纤连蛋白的抗体模拟物描述于文献Grabulovski et al.，J.Biol.Chem.，2007，282：3196-3204中。
根据本发明的“白细胞介素-2”是指哺乳动物的白细胞介素-2，优选人白细胞介素-2及其功能性变异体。白细胞介素-2的功能性变异体是表现出至少10％而更优选超过50％且甚至更优选超过90％的天然人白细胞介素-2活性的人白细胞介素-2的变异体。白细胞介素-2活性是生物化学分析或体内的白细胞介素-2的活性，具体而言，白细胞介素-2活性能够通过对活化的T和B淋巴细胞以及自然杀伤细胞的增殖和/或分化，和/或对细胞毒性T-细胞活性和/或NK/淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤活性的诱导的影响来进行测定(Meazza R，Marciano S，Sforzini S，et al.Analysis of IL-2 receptor expression and of the bio-logical effects of IL-2 gene transfection in small-cell lung cancer.Br.J.Cancer.1996；74：788-795)。具体而言，功能性变异体是如EP136489中描述的白细胞介素-2的半胱氨酸-125突变蛋白和其他突变蛋白，包括EP136489中描述的半胱氨酸突变蛋白，尤其是丝氨酸125-白细胞介素-2。而且，hIL.2变异体的N-端可以改变而不会显著影响活性，尤其是N-端第1-5个氨基酸，尤其优选N-端丙氨酸可以被删除或改变，优选删除。而且，白细胞介素-2可以含有改变的或删除的翻译后修饰，尤其是糖基化模式可以改变或缺失。不同的或不存在糖基化作用可以通过例如使序列发生突变或通过在合适的宿主中表达融合蛋白而获得。例如，新陈代谢的RCC允许的阿地白介素就是在大肠杆菌中产生的未糖基化的脱-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白细胞介素-2(des-alanyl-1，serine-125human interleukine-2)。
附图说明
图1：L19抗体的免疫组织化学显示出B-细胞淋巴瘤异种移植物中的EDB表达。采用特异于EDB纤连蛋白的抗体L19进行免疫组织化学染色，显示出具有在拉莫斯淋巴瘤异种移植物(左侧图)中染色的突出脉管模式的该纤连蛋白亚型的强烈表达。染色类似于在实体瘤中的L19的染色模式，作为用U87成胶质细胞瘤异种移植物(右侧图)的举例说明。对于阴性对照，省略了一抗。比例尺，100μm。
图2：体内定位试验：离体免疫荧光(A)和定量生物分布研究(B)。在皮下SCID/拉莫斯淋巴瘤模型中测试L19抗体的体内靶向性能。(A)用由荧光团Cy3化学标记的L19-SIP对具有淋巴瘤的小鼠实施注射。该图显示出注射后24h淋巴瘤部分的2-色荧光显微图像，证实了抗体定位于(红色)肿瘤脉管结构上。抗-CD31抗体离体施用以勾勒出内皮细胞，并采用Alexa Fluor 488抗-大鼠IgG抗体(绿色)检测。比例尺，100μm。(B)在向具有淋巴瘤的动物注射125I-放射标记的L19-SIP(对于每一时间点n≥3)之后24h获得定量生物分布结果。平均靶向结果被表示为每克组织注射剂量百分数(％ID/g±SD)。注射后48h，能够观察到淋巴瘤组织中抗体的选择性累积和保留，肿瘤-血液比为4.8，而肿瘤-器官比的范围为3.8～17.3。
图3：单药L19-IL2、未结合的IL-2和利妥昔单抗对淋巴瘤生长的影响。具有既定的s.c.拉莫斯淋巴瘤异种移植物的SCID小鼠采用脉管靶向的L19-IL2融合蛋白(■；20μg)、相应剂量的未靶向rIL-2(▲；6.6μg)、利妥昔单抗(●；200μg)、或对照盐水(×)在肿瘤细胞移植之后的第8天、第11天、第14天和第17天进行静脉注射。单药L19-IL2和单药利妥昔单抗都显著地延缓了肿瘤生长(分别P＝0.024和P＝0.004)。相对而言，未结合的rIL-2并未表现出显著的治疗活性(P＝0.383)，治疗活性指示出靶向递送IL-2对治疗效果的贡献(L19-IL2vs.IL-2：P＝0.044)。
图4：L19-IL2和未结合的IL-2结合利妥昔单抗的治疗疗效。具有既定的s.c.拉莫斯淋巴瘤异种移植物的SCID小鼠采用盐水(×)、200μg利妥昔单抗+低剂量未结合的IL-2(△；2.2μg)、200μg利妥昔单抗+高剂量未结合的IL-2(▲；6.6μg)、200μg利妥昔单抗+低剂量L19-IL2(□；6.6μg，相当于2.2μg IL-2)、或200μg利妥昔单抗+高剂量L19-IL2(■；20μg，相当于6.6μg IL-2)在第8天、第11天、第14天和第17天进行静脉注射。L19-IL2与利妥昔单抗组合是高度有效的，在低剂量以及在高剂量L19-IL2组中5只小鼠中的4只中诱导了完全缓解。相对而言，未结合的rIL-2与利妥昔单抗组合并未诱导肿瘤缓解，而是所有的肿瘤继续生长。所有具有CR的小鼠保持无肿瘤至少42天的时间。
图5：L19-IL2、IL-2和利妥昔单抗在单药物和组合疗法中对扩淋的巴瘤模型中的治疗疗效。SCID小鼠(n≥6)采用2×106拉莫斯淋巴瘤细胞静脉注射并根据以下方案随后处理8天：未结合的IL-2(6.6μg)、L19-IL2(20μg)、利妥昔单抗(200μg)、利妥昔单抗(200μg)+IL-2(6.6μg)、利妥昔单抗(200μg)+L19-IL2(20μg)、或对照盐水(具体地，为了模拟系统性疾病，对SCID小鼠静脉注射再悬浮于200μL PBS的2×106拉莫斯淋巴瘤细胞。在疗法开始之前的8天内出现B-细胞淋巴瘤的扩散和生长。将小鼠随机分成6组(每组≥6小鼠)并用盐水、20μg L19-IL2、6.6μg未结合的rIL-2、或200μg利妥昔单抗(单药治疗组)、或200μg利妥昔单抗与20μgL19-IL2组合，或200μg利妥昔单抗与6.6μg未结合的rIL-2的组合(组合治疗组)在第8天、第11天、第14天和第17天(Q3Dx4)静脉注射。每日监控小鼠是否存在后腿麻痹或恶化病状的信号，随后处死小鼠并按死亡计分。记录存活的小鼠用于治疗疗效分析)。
图6：人淋巴瘤样品的靶验证。发现EDB在人B-细胞淋巴瘤实体的新生血管结构中表达，包括常见的亚型弥漫性大B-细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Butkitt lymphoma)。比例尺，100μm。
图7：尽管融合蛋白L19-IL2可重复地抑制淋巴瘤生长(P＝0.031)，但是当单独给药或与游离rIL-2组合时按照SIP或IgG形式的等摩尔量裸L19(naked L19)是治疗惰性的。
具体实施方式
实施例
材料和方法
动物和细胞系
6至8周龄的雌性CB17/lcr SCID小鼠获自Charles River实验室(Sulzfeld，德国)。所有的小鼠都圈养于微型隔离室并在整个研究过程中无限制地提供无菌食物和水。EBV-阴性的人B细胞淋巴瘤细胞系Ramos44购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC，Manassas，VA)。细胞在经调节含有2mML-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢盐、10％热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中维持对数期生长。人滤泡性淋巴瘤细胞系DoHH-2获自德国微生物菌种保藏中心(GermanResource Centre for B iological Material，DSMZ，Braunschweig，德国)。
抗体和试剂
L19是直接针对纤连蛋白EDB结构域的脉管靶向抗体。按照SIP形式(小免疫蛋白)的L19和L19-IL2融合蛋白的表达、纯化和表征之前已经描述于文献Borsi et al.(Int J Cancer.2002；102：75-85)和Carnemolla et al.(Blood.2002；99：1659-1665)中。重组人IL-2(Proleukin，18×106IU)获自Prorero Pharma(Liestal，瑞士)，而嵌合人IgG1抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗(MabThera)获自Roche(Reinach，瑞士)。
免疫组织化学
对于拉莫斯淋巴瘤异种移植物肿瘤实施免疫组织化学分析，将10μm冷冻样品的恒冷切片固定于冰冷的丙酮中，在TBS(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl pH 7.4)中再水化，并用20％FCS(Invitrogen，Basel，瑞士)封闭。将L19-SIP加到最终浓度为10μg/mL的切片上。结合的一抗采用兔抗人IgE抗体(Dako，Glostrup，丹麦)，接着用生物素化的羊抗兔IgG抗体(Biospa，Milan，意大利)和抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶络合物(Biospa)进行检测。Fast Red TRSalt(Sigma)用作磷酸酶底物。利用生物素化的L19-SIP抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶络合物(SAP)来实施在人淋巴瘤样品上EDB表达的免疫组织化学分析。用苏木紫对切片进行复染，用中性树胶(Glycergel)封固剂(Dako)进行封固，并用Axiovert S100 TV显微镜(Zeiss，Feldbach，瑞士)分析。
对人体淋巴瘤样品的免疫组织化学分析例如对淋巴瘤异种移植物来实施，然而，生物素化的L19-SIP用作一抗并用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶络合物(Biospa)检测。
离体荧光实验
L19-SIP用Cy3-NHS酯、荧光菁化合物按照制造商说明书(Amersham Pharmacia，Dübendorf，瑞士)进行标记。120μg L19-Cy3结合物被静脉注射(i.v.)到具有淋巴瘤的小鼠的侧面尾静脉中。在注射24h后处死小鼠，并切除肿瘤，包埋于低温包埋化合物(Microm，Walldorf，德国)中并在-80℃下储存。切下10μm的切片，在37℃下干燥15min，并用4％多聚甲醛在室温下固定15min。采用Alexa Fluor 488兔抗大鼠IgG作为二抗(Invitrogen)将大鼠抗-CD31抗体(BD Pharmingen)施加于凸显出的内皮细胞。在装配有AxioCam MRc照相机的Axioskop 2Mot+显微镜(Zeiss)上捕获图像。
定量生物分布
为了定量评价体内靶向性能，采用放射性标记的抗体制剂按照前文所述来实施生物分布分析(Carnemolla et al.，2002)。简言之，纯化的SIP(L19)采用125I放射碘化，并静脉注射至具有皮下移植拉莫斯淋巴瘤异种移植物的SCID小鼠体内或注射到具有Balb/c系统性同源A20淋巴瘤的小鼠体内(10μg，12.2μCi/小鼠)。在注射后24h或48h处死小鼠，每一时间点使用至少3只动物。称量器官并利用Cobraγ计数器(Packard，Meriden，CT)对放射性进行计数。代表性器官的放射性容量被表示为注射剂量/组织器官的百分比(％ID/g±SE)。
定位淋巴瘤异种移植模型
1×107拉莫斯淋巴瘤细胞或DoHH-2(1×107)淋巴瘤在第0天皮下注射到6至8周龄雌性CB17/lcr SCID小鼠的侧腹中。当肿瘤产生且能够清楚地可触摸到(50-100mm3，注射后第8天)时，对小鼠实施操作以使各组中的均一性最大化，并将20μg L19-IL2(相当于6.6μg或118000 IU rIL-2)、6.6μg非靶向rIL-2、200μg利妥昔单抗、或100μL体积的对照盐水在第8天、第11天、第14天和第17天(Q3Dx4)注射至侧面尾静脉中。对于组合疗法研究，L19-IL2(6.6μg和20μg，分别相当于2.2μg和6.6μg“游离”rIL-2)，或未结合的rIL-2(2.2和6.6μg)与利妥昔单抗(200μg)组合在第8天、第11天、第14天和第17天通过单独的静脉注射进行给药。为了测试单独使用L19抗体是否具有治疗活性，用等摩尔量的SIP(x.xμg)或IgG(x.xμg)形式的L19单独给药或与游离rIL-2(6.6μg)组合给药对小鼠进行治疗。对于所有药物(按照单一的或组合疗法)的治疗方案都是每个第3天总计4次(拉莫斯淋巴瘤)或3次(DoHH-2)注射(分别为Q3Dx4或Q3Dx3)。
每日监控小鼠并用以下公式用数字测径器每周测量至少3次：体积＝长度×宽度2×0.5。响应被定义为完全缓解(CR，无可见的肿瘤)或部分缓解(PR，肿瘤体积降低至少50％)。当肿瘤体积达到＞2000mm3或动物显示出疾病信号时处死动物。所有动物实验在由Kantonales
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des Kantons Zürich颁发给D.N.的专项许可“Tumor Targeting”(Bewilligung 198/2005)下完成。
扩散的淋巴瘤异种移植物模型
为了模拟系统性疾病，用再悬浮于200μL PBS中的2×106拉莫斯淋巴瘤细胞对SCID小鼠进行静脉注射。使B-细胞淋巴瘤的扩散和生长在疗法开始之前8天内出现。将小鼠随机分成6组(每组≥6)并用20μg L19-IL2、6.6μg未结合的rIL-2、或200μg利妥昔单抗(单一疗法)，或200μg利妥昔单抗与20μg L19-IL2组合、200μg利妥昔单抗与6.6μg未结合的IL-2组合(组合疗法)，或盐水在第第8天、第11天、第14天和第17天(Q3Dx4)实施静脉注射。每日监控小鼠是否存在后腿麻痹或恶化病状的信号，随后处死小鼠。将麻痹或死亡的出现设置为终点，记录小鼠的存活用于进行治疗疗效分析。利用扩散的淋巴瘤模型的动物实验是根据专项许可“Tumor Targeting”的修正案1来实施的。
统计分析
数据表示为平均值±SE。不同的小鼠组之间的肿瘤体积差异采用双尾学生t检验进行比较。绘制Kaplan-Meier生存曲线以表现在扩散的淋巴瘤模型中的治疗疗效，并采用对数秩检验进行比较。两侧P值＜0.05被认为是显著性的。
结果
体外定位化：对异种移植物肿瘤进行的免疫组织化学分析
利用特异于纤连蛋白EDB结构域的L19抗体对拉莫斯淋巴瘤异种移植物切片实施免疫组织化学分析。如在图1(左侧图)中所示出的，淋巴瘤组织中脉管结构的特异性染色能否观察到L19，表明了其在实体瘤中的染色模式，正如采用人U87成胶质细胞瘤异种移植物(右侧图)所举例说明的。淋巴瘤异种移植物中EDB表达的模式表明，该同种型能够起到体内向淋巴瘤位置选择性递送生物活性化合物的靶的作用。
体内靶向性能：离体荧光和定量生物分布
在下一步骤中，研究了在淋巴瘤异种移植物中表达的EDB纤连蛋白是否受到来自体内血液流的L19抗体的影响。为此目的，对具有皮下拉莫斯淋巴瘤肿瘤的小鼠静脉注射用荧光团Cy3化学标记的L19-SIP。在24h之后，处死这些动物并按照“材料和方法”部分中的描述处理肿瘤切片。图2a示出了淋巴瘤切片的2-色荧光显微图像，证实了抗体在肿瘤脉管结构上的定位。
为了评价抗体的定量沉积，对具有皮下移植拉莫斯淋巴瘤异种移植物的小鼠静脉注射L19-SIP的放射性碘化制剂。如在图2b中的描述，注射24h之后L19表现出在淋巴瘤组织中的累积，绝对肿瘤吸收值为4.7％ID/g，但是在该时间点上的中等肿瘤-血液比仅为2.1(肿瘤-器官比为2.7～7.1)。然而，在48h之后，抗体从正常器官中更快速地清除，导致肿瘤-血液比(4.8)和肿瘤-器官比(高至17.3)增加，而证实了肿瘤位置处抗体的特异性累积和保留。
单药L19-IL2和单药利妥昔单抗针对定位的淋巴瘤异种移植物的治疗活性
先前已经证实，抗体-细胞因子融合蛋白L19-IL2在各种实体瘤模型中表现出强效抗肿瘤活性(Menrad et al.(Expert Opin TherTargets.2005；9：491-500)，Carnemolla et al.(Blood.2002；99：1659-1665))。为了评价B-细胞淋巴瘤中L19-IL2的单治疗药剂的效能，用1×107个拉莫斯细胞对SCID小鼠实施皮下注射。在肿瘤细胞移植之后的第8天，当肿瘤尺寸达到50～100mm3时，用20μgL19-IL2(相当于6.6μg rIL-2)，6.6μg未结合的rIL-2，200μg利妥昔单抗或盐水(Q3Dx4)对小鼠(n≥4)实施静脉注射治疗。图3示出了与用盐水治疗的对照小鼠相比，单药L19-IL2和单药利妥昔单抗基本上抑制了淋巴瘤生长(分别为P＝0.024和P＝0.004)。相反，类似于先前对于实体瘤的动物模型已经报道的情况，等摩尔量的未结合的rIL-2并未表现出任何显著的治疗效果(P＝0.383)，并证实了细胞因子的抗体介导的脉管靶向对治疗疗效的贡献(L19-IL2vs.IL-2：P＝0.044)。然而，当L19-IL2和利妥昔单抗用作单一治疗剂时，都仅能够延缓肿瘤生长，并且所有动物在该实验中都经历了疾病发展。尽管融合蛋白L19-IL2可重复地抑制淋巴瘤生长(P＝0.031)，但是当SIP或IgG形式的裸L19单独给药或与游离rIL-2组合给药时无治疗活性，这进一步强化了L19-IL2的治疗活性依赖于淋巴瘤处的细胞因子靶向递送(图7)的构思。
为了提供关于治疗相关的毒性的信息，每周至少测量动物体重3次。没有观察到毒性的迹象，因为在整个研究期间没有任何治疗组鼠体重下降超过3％。
L19-IL2和利妥昔单抗组合对定位的淋巴瘤异种移植物的治疗活性
各种增强利妥昔单抗临床疗效的方式已经见诸报道，包括给予rIL-2以加强ADCC-介导的淋巴瘤细胞杀灭(Cartron et al.，Blood.2004；104：2635-2642)。因此，我们提出疑问，是否脉管靶向的IL-2和抗-CD20疗法的组合将比单一的治疗方法具有更号的治疗效果，具体而言，抗体介导的IL-2在淋巴瘤组织中的累积是否将超过未结合的细胞因子和利妥昔单抗组合的效能。为此目的，按照以下方案进行实施组合疗法实验(≥5只小鼠/组)：200μg利妥昔单抗+2.2μg未结合的rIL-2(“低剂量”)、200μg利妥昔单抗+6.6μg未结合的rIL-2(“高剂量”)、200μg利妥昔单抗+6.6μg L19-IL2(“低剂量”，相当于2.2μg rIL-2)、200μg利妥昔单抗+20μg L19-IL2(“高剂量”，相当于6.6μg rIL-2)、或对照盐水。在单疗法实验的类比中，当可察知的皮下异种移植物已经发展时在肿瘤细胞接种之后第8天开始注射，并在每个第3天重复注射，总计注射4次。
如图4中所示，与对照相比，未结合的rIL-2与利妥昔单抗组合导致了显著的肿瘤生长延缓(rIL-2低剂量和高剂量vs.盐水：P＜0.001)。高剂量rIL-2比低剂量的rIL-2稍微更有效地提高了利妥昔单抗的效力(P＝0.038)，然而，没有观察到肿瘤消退，所有肿瘤都继续生长。相比而言，利妥昔单抗与L19-IL2融合蛋白的组合表现出显著更高的抗-淋巴瘤活性并在高剂量L19-IL2组中5只鼠中4只中诱导了已产生拉莫斯淋巴瘤的完全根除(L19-IL2高剂量vs.盐水：P＜0.00001)，4个CR(完全缓解)中的3个已经在3次注射之后实现。实际上，免疫细胞因子比相当的等摩尔量的未结合rIL-2与利妥昔单抗组合显著地效力更强(L19-IL2高剂量vs.rIL-2高剂量：P＜0.001)。显然，即使最低剂量水平的L19-IL2与利妥昔单抗组合仍然表现出优异的治疗活性(L19-IL2低剂量vs.盐水：P＜0.00001；L19-IL2低剂 量vs.rIL-2低剂量：P＜0.00001)，在4个治疗周期后5个病例的中4个诱导了CR，然而甚至3倍高剂量的非-靶向细胞因子与利妥昔单抗组合才能仅阻碍肿瘤生长(L19-IL2低剂量vs.rIL-2高剂量：P＜0.001)。尽管分别在缓解的21天、48天、50天和81天的持续期之后，在最后终于复发的低剂量L19-IL2组动物中实现了CR，但是在高剂量L19-IL2组中的所有CR都是可持续的，并且所有小鼠在一年的观察期内均保持无肿瘤。两只小鼠(低剂量中的一只和高剂量L19-IL2组中的一只)并未实现CR，但是肿瘤块降低至不到20mm3。
为了研究单独或组合的L19-IL2治疗性能是否能够在第二淋巴瘤模型中再现，用以上所示的类似条件对具有定位的DoHH-2滤泡性淋巴瘤异种移植物的SCID小鼠进行治疗。在对拉莫斯模型的分析中，L19-IL2与单药物抑制淋巴瘤生长一样有效(P＜0.0001)，却并未诱导肿瘤消退，同时当量剂量的组分(裸L19和rIL-2)总和显示出没有显著的治疗活性。当与利妥昔单抗组合时，L19-IL2可重读地导致所有病例(5/5)中完全根除肿瘤，而在第14天没有出现复发的迹象，并显著地比单药利妥昔单抗或利妥昔单抗和非-靶向rIL-2(和裸L19)的组合更有效(P＜0.01)，尽管在两个组中都观察到2/5CR。
所有用于在单一疗法或组合疗法中针对定位的拉莫斯淋巴瘤和DoHH-2异种移植物的药物的治疗活性总结于表1中。
重要的是，组合疗法的治疗性能与其他毒性无关。小鼠在治疗期间的任何时间点并未表现出显著的体重下降(＜3％)，这表明组合疗法的治疗方案的耐受性良好。
表1.rIL-2、L19-IL2和利妥昔单抗，单独和组合给药对于定位的淋巴瘤异种移植物的活性
  治疗   PR   CR   CR后复发
  拉莫斯淋巴瘤(Ramos)
  盐水   0/9   0/9   -
  rIL-2(6.6μg)   0/4   0/4   -
  L19-IL2(20μg)   0/4   0/4   -
  利妥昔单抗(200μg)   0/4   0/4   -
  利妥昔单抗(200μg)+rIL-2(2.2μg)   0/5   0/5   -
  利妥昔单抗(200μg)+rIL-2(6.6μg)   0/5   0/5   -
  利妥昔单抗(200μg)+L19-IL2(6.6μg)   1/5   4/5   4/4
  利妥昔单抗(200μg)+L19-IL2(20μg)   1/5   4/5   0/4
  DoHH-2
  盐水   0/5   0/5   -
  rIL-2(6.6μg)[+SIP(L19)]   0/5   0/5   -
  L19-IL2(20μg)   0/5   0/5   -
  利妥昔单抗(200μg)   2/5   2/5   1/2
  利妥昔单抗(200μg)+rIL-2(6.6μg)[+SIP(L19)]   3/5   2/5   1/2
  利妥昔单抗(200μg)+L19-IL2(20μg)   0/5   5/5   0/5
用所示治疗方案对具有已形成的皮下拉莫斯淋巴瘤或DoHH-2淋巴瘤异种移植物SCID小鼠进行治疗。响应定义为部分缓解(PR，肿瘤体积减少至少50％)或完全缓解(CR，无可见或可触知的肿瘤)。数据示出了治疗组的响应数/总数。-不适用。
在扩散的淋巴瘤模型中的治疗活性
L19-IL2作为单一药物和与利妥昔单抗组合对扩散的淋巴瘤异种移植物的治疗活性。
在人体内，晚期NHL一般会发展成扩散性疾病。为了研究L19-IL2对系统性淋巴瘤的活性，我们选择了扩散的SCID/拉莫斯淋巴瘤模型。用淋巴瘤细胞静脉注射接种的SCID小鼠规则地发展后腿麻痹，这是由于淋巴瘤在脊髓中作用产生的，并指示出疾病的晚期。根据已公开的观察数据，拉莫斯淋巴瘤细胞的静脉注射在预试验中的所有病例中均导致后腿麻痹发展26天，指示植入率为100％(数据未示出)。由于在每一病例中麻痹都在死亡之前发生，因此可以将后腿麻痹的出现设置成生存分析的终点。治疗开始推迟8天，以确保淋巴瘤细胞的植入和生长。药物的剂量和方案设计与在定位的拉莫斯淋巴瘤模型中所用的相同，并且在该实验中同时评价单药(rIL-2、L19-IL2、利妥昔单抗)治疗和组合治疗(利妥昔单抗+rIL-2、利妥昔单抗+L19-IL2)的活性。
Kaplan-Meier生存曲线如图5中所示。到第25天，所有盐水处理的对照小鼠发展成中值存活时间为24天的扩散疾病。未结合的rIL-2单独给药并未表现出显著的治疗处益(中值存活24天；P＝0.518，对数秩检验)。相比而言，相应剂量的单药L19-IL2(20μg)将中值存活时间延长至29日(P＜0.010，与非-靶向rIL-2相比)并相对于盐水处理的对照在延缓疾病出现方面与利妥昔单抗等效(这两种药物的中值存活分别为29和30天，vs.24天；P＜0.001)。在组合疗法中，向利妥昔单抗加入rIL-2，与单独使用利妥昔单抗相比，仅仅稍微延缓疾病的出现，没有达到统计显著性(34vs.30天；P＝0.180)。显而易见的是，尽管所有用单药物疗法治疗的小鼠以及所有用利妥昔单抗和非-靶向rIL-2的组合疗法治疗的小鼠，实际上都发展为最终的麻痹，但接受L19-IL2和利妥昔单抗组合的6只小鼠中的6只都存活超过60天，而没有表现出该疾病的临床表现。在第62天，由于体重损失和由感染引起的产生眼睑分泌物，将一只小鼠处死，尸检时没有麻痹或或淋巴瘤表现的迹象。由于在腋下淋巴结产生淋巴瘤，分别在第73天和79天处死另外两只小鼠，它们也没有出现后腿麻痹。其余的三只小鼠在肿瘤接种后仍310天未发病。
人淋巴瘤样品中靶表达的验证
最后，实施免疫组织化学分析以证实人B-细胞恶性肿瘤(包括弥漫性大B-细胞和伯基特淋巴瘤)中EDB纤连蛋白的存在和纤连蛋白的脉管表达模式(图6)。
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Figure IPA00001184010600011
Figure IPA00001184010600021
Figure IPA00001184010600031
Figure IPA00001184010600041
Figure IPA00001184010600051

Claims (33)

1.一种至少包含以下物质的组合物
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体-部分和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子特异性地结合于CD20、CD23、CD22、CD40、CD80、HLA-DR或Hu1D10。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述特异性结合于CD20、CD23、CD22、CD40或CD80的分子是抗体或抗体片段，或它们的融合蛋白。
4.一种至少包含以下物质的组合物
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体-部分和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)特异性结合于CD20的分子。
5.一种至少包含以下物质的组合物
(i)包含特异性识别EDb-纤连蛋白的抗体-部分和白细胞介素-2部分的融合蛋白，和
(ii)特异性结合于表达CD20的细胞的分子。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述分子是特异性结合于CD20的抗体或抗体片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，(i)的所述抗体-部分识别纤连蛋白的所述EDb-结构域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，所述融合蛋白具有连接所述抗体-部分和所述白细胞介素-2部分的融合蛋白连接子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，所述抗体-部分特异性结合于具有亚纳摩尔或纳摩尔亲合性的所述EDb癌胚胎纤连蛋白结构域(EDb oncofetal fibronectin domain)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述抗体-部分含有所述L19抗体的至少一个CDR序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述抗体-部分包含SEQ ID No.6至11的所述序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述抗体-部分包含至少一个SEQ ID No.1的V重链或至少一个SEQID No.2的V轻链。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，所述抗体-部分包含一个SEQ ID No.1的V重链和一个SEQ ID No.2的V轻链。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中，所述重链和所述轻链通过抗体连接子连接。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述抗体连接子包含SEQ ID No.3的序列、或与SEQ.ID.No.3的所述序列具有至少90％同一性的序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中，所述白细胞介素-2部分是人白细胞介素-2或其功能性变异体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中，所述白细胞介素-2部分包含SEQ.ID.No.4的序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中，融合蛋白连接子连接所述抗体-部分和所述白细胞介素-2部分。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中，所述融合蛋白连接子的长度为1至30个氨基酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中，所述融合蛋白连接子包含SEQ ID No.5的序列。
21.根据权利要求3以及权利要求7至20中任一项所述的组合物，其中，所述抗体或抗体片段、或它们的融合蛋白特异性地结合于CD20。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述抗-CD20的抗体表现出ADCC活性。
23.根据权利要求6、21和22中的一项所述的组合物，其中，所述抗-CD20的抗体选自利妥昔单抗、Ocrelizumab、PRO131921、Veltuzumab、Ofatumumab、AME-133和GA-101。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中，所述结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的分子被标记，尤其是被放射性标记。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述结合于B细胞、B祖细胞和/或它们的癌性对应物的被标记分子是放射性标记的抗-CD20抗体。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述放射性标记的抗-CD20抗体选自90Y、111In和131I-标记的抗-CD20抗体。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述放射性标记的抗-CD20抗体选自Y-90-替伊莫单抗(Y90-
Figure FPA00001184011000041
)和I-131托西莫单抗
Figure FPA00001184011000042
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，用于作为药物。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的组合物，用于作为治疗肿瘤的药物。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述癌症是淋巴瘤。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述淋巴瘤是B-细胞淋巴瘤，尤其是非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
32.根据权利要求28所述的组合物，用于自身免疫疾病的治疗。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中，所述自身免疫疾病选自风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和自身免疫性溶血性贫血。
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