CN101955520A - 一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101955520A CN101955520A CN2010102156834A CN201010215683A CN101955520A CN 101955520 A CN101955520 A CN 101955520A CN 2010102156834 A CN2010102156834 A CN 2010102156834A CN 201010215683 A CN201010215683 A CN 201010215683A CN 101955520 A CN101955520 A CN 101955520A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- dsr1
- sequence
- drought
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用。植物抗旱与耐盐蛋白是序列表中SEQ ID No：2，其编码基因是序列表中SEQ ID No：1DNA序列。本发明利用该抗旱与耐盐蛋白的编码基因增强植物耐旱与耐盐的能力，为农作物耐旱与耐盐育种提供基因与技术支持。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物工程领域中一个植物抗旱及耐盐相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物抗旱与耐盐的方法。
二、背景技术
干旱和盐渍问题是影响当今世界农业生产与生态环境的两个重要的逆境因子，对世界粮食生产造成巨大的损失。在人口不断增加、耕地面积日趋减少和淡水资源不足的严重压力下，如何高效地利用有限的淡水资源进行最大限度的农业生产，这是国际和国内生物科学技术迫切需要解决的重大课题之一。培育抗旱与耐盐作物品种是利用干旱盐渍地的一条经济而有效的途径，除了利用传统的育种方法外，利用基因工程技术提高作物的抗旱及耐盐能力具有重要的理论与经济意义，植物抗旱及耐盐分子机制研究的不断深入和转基因技术的日趋完善，为培育高效抗旱耐盐作物新品种开辟了一条崭新的途径，而这项工作的关键在于对植物抗逆分子机理的认识及关键基因的克隆。
拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗旱及耐盐的分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的抗旱及耐盐性以及产量具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库(www.arabidopsis.org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，发现了一些与植物相关的抗旱及耐盐基因的功能，如RD22，RD29A，DREB1，DREB2等。
目前，还未找到有效的同时具有抗旱及耐盐功能的基因，面对日益严重的农作物干旱及盐渍问题，寻找新的耐盐抗旱功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。申请人根据拟南芥数据库公布的基因组序列，发现基因AT4G14000是一个功能未知的基因。荧光定量基因表达分析显示，盐处理可诱导下游调控基因COR15A表达量增高，而干旱处理则使得RD22基因表达量增高，表明该基因可能涉及抗旱及耐盐的调控。为此，我们研究了该基因功能，并发现该基因具有调控植物抗旱及耐盐的作用。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物抗旱及耐盐相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的植物抗旱及耐盐相关蛋白的编码基因，命名为DSR1(Drought and salt resistance 1；AT4G14000)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
(1)序列表中的SEQ ID No：1；
(2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱及耐盐相关的蛋白质。
序列表中的序列2由290个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
DSR1的编码基因也属于本发明的保护范围。
DSR1的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；
(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；
(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；
(4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1由1209个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第23位至895位碱基，编码序列SEQ ID No：2的蛋白质。
含有本发明DSR1的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增DSR1中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗旱及耐盐的方法。
本发明所提供的增强植物抗旱及耐盐的方法，是抑制植物中的上述植物抗旱及耐盐相关蛋白编码基因的表达。
抑制植物中的上述植物抗旱及耐盐相关蛋白编码基因DSR1的表达可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制DSR1表达均可。
利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为抗旱及耐盐；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的DSR1转入植物中，植物就表现出盐和干旱敏感。
本发明的DSR1基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度和抗盐能力来筛选转化植株。携带有本发明DSR1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明的植物抗旱及耐盐相关蛋白及其编码基因为农作物耐盐及抗旱育种提供基因与技术的支持(保障)。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
四、附图说明
图1野生型植株与突变体dsr1-1、dsr1-2的在正常光照培养条件下不同时期的比较照片
图2为野生型WT与突变体等位系dsr1-1、dsr1-2在土壤干旱处理后的表型对比
A.野生型WT与突变体等位系dsr1-1、dsr1-2在同一盆土壤中同步干旱处理后的表型
B.野生型WT与突变体等位系dsr1-1、dsr1-2在不同盆土壤中同步干旱处理后的表型
图3为干旱胁迫下野生型WT与突变体dsr1-1、dsr1-2中相关基因的QRT-PCR表达
图4为盐胁迫条件下野生型WT与突变体的比较
A.NaCl胁迫下野生型WT与突变体等位系dsr1-1、dsr1-2的竖培表型
B、C.NaCl胁迫下野生型WT与突变体dsr1-1、dsr1-2的根长和鲜重对比
图5为突变体等位系dsr1-1、dsr1-2对渗透胁迫的响应
A.甘露醇胁迫下野生型WT与突变体dsr1-1、dsr1-2的竖培表型
B、C.甘露醇胁迫下野生型WT与突变体dsr1-1、dsr1-2的根长和鲜重对比
图6干旱胁迫下脯氨酸含量及脯氨酸合成基因的表达
A.干旱胁迫下脯氨酸含量的变化
B.干旱胁迫下脯氨酸合成基因P5CS的QRT-PCR表达
五、具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、DSR1及其编码基因的获得
以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应：20μl反应体系，内含10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)混合物0.4μl，引物1和引物2各2μl，Tag酶(5U/μl)0.2μl，其余加双蒸水至20μl。其中，引物1：5’-GCTGCCGCCGAAGTTTTG-3’，引物2：5’-CAGGTCGAGCTGGTGGAT-3’。在Life Express基因扩增仪上扩增：先94℃预变性3min，再94℃30sec，54℃30sec，72℃60sec，共计32个循环，最后72℃延伸10min，将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-DSR1-1，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为DSR1-1的cDNA基因，由1209个碱基组成，其编码序列为自5’端第23位碱基到第895位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
实施例2、培育耐盐及抗旱性增强的拟南芥
1、DSR1基因被敲除的纯合突变体等位系dsr1-1、dsr1-2的获得
从美国拟南芥种质资源中心获得了两个T-DNA插入突变体等位系，(SALK_116474.http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝germplasm&id＝4834033；SALK_094629C.http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝germplasm&id＝3510598203)。为鉴定DSR1基因被敲除的纯合突变体，将SALK_116474(dsr1-1)和SALK_094629C(dsr1-2)种子种于土培上，提取单株植株DNA，，用下述引物分别对其进行PCR扩增：dsr1-1，引物1LBb1：5’GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，引物2：LP5’-AATAGATTCCAGACGGAAGCC-3’，引物3：RP5’-TGCTCACACGACCCTATAACC-3’；dsr1-2，引物1LBb1：5’GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，引物2：LP 5’-TGGTGAATTTGAATTGTTTTGG-3’，引物3：RP 5’-CATCATTCTAATGGCTGAGACG-3’。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，获得DSR1基因被敲除的纯合突变体dsr1-1和dsr1-2。为阐明DSR1基因功能缺失突变是否会对发育产生影响，比较了在正常光照条件下突变体dsr1-1、dsr1-2和WT生长发育(图1)，发现在正常土培培养条件下突变体dsr1-1、dsr1-2与WT的形态没有显著差别，表明DSR1基因功能缺失突变对植株生长发育没有产生显著影响。用该基因的cDNA序列构建35S强动子的过表达载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型，在盐和干旱条件下也恢复了野生型植株症状，证实了该基因确实控制抗旱及耐盐性状。
2、突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型植株的抗旱性比较
为阐明DSR1基因功能缺失后对干旱胁迫的影响，将突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型种子同时播种于大花盆中，进行干旱处理(图2A)。置于22℃恒温光照培养室。在营养土中正常培养3～4周后，在进行干旱实验前浇水，使野生型与突变体的营养土都充分水，第二天取上述材料，分别放置于干燥的无水托盘中，保持其他外界条件不变，7～10天不浇水，进行观察，野生型和突变体发生萎蔫时，浇水恢复培养3～5天，再观察看野生型与突变体那个能够恢复或者死亡。结果表明，两个等位系对干旱胁迫响应一致，都表现出了对干旱胁迫的耐受性。为进一步阐明突变体dsr1-1、dsr1-2对干旱胁迫的耐受，将野生型WT及突变体dsr1-1、dsr1-2的分别单独播种于独小花盆中，且用相同的干旱处理方法，来观察并拍照记录表型变化。结果显示，与上述干旱处理的结果一致(图2B)。由此可见，与野生型相比，突变体dsr1-1、dsr1-2的抗旱能力显著提高。
以ACTIN基因做参照，使用QRT-PCR对基因表达量进行检测，叶片材料在不经处理时，RD22基因的表达在干旱处理1h的时候，突变体的表达量是野生型的2～3倍，3h时后差异开始缩小，且表达量都开始下降(图3A)。RD29A基因在对照组野生型和突变体中的表达量都很低，干旱处理后，在突变体中的表达量有所增加，在野生型中的表达慢慢下降。但RD29A在突变体中的表达量比在野生型明显要高出，尤其是在3h，24h时(图3B)。因此我们可以推断，突变体dsr1-1、dsr1-2的抗旱可能与KIN2以及RD22的途径有关。
3、突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型植株的耐盐性比较
将两个突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型种子分别播种在含有不同浓度NaCl的MS培养基上，在22℃长日照条件下竖直培养3周，观察比较植株根系及整株生长差异(图4A)，对NaCl胁迫条件下的野生型与突变体的根长度和鲜重进行了统计分析(图4B、C)。随着NaCl浓度的增加，根长、鲜重差异开始增加；在100mM的NaCl条件下，根长和鲜重差异非常显著，突变体平均鲜重比野生型大约高4.5mg/5株(图1B)，而其平均根长比野生型大约长1.5cm(图4C)。
4、突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型植株的渗透调节能力比较
将两个突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型的种子分别播种在含有不同浓度甘露醇的MS培养基上，在22℃长日照条件下竖直培养3周，观察并比较野生型与突变体植株之间根系及整株生长差异(图5A)，对甘露醇胁迫条件下的野生型与突变体的根长度和鲜重进行了统计分析(图5B、C)。结果显示，在含有不同浓度甘露醇的MS培养基上，dsr1-1、dsr1-2突变体的根长比野生型更长，鲜重也比野生型更重，且在250mM的甘露醇的竖培都表现出显著差异，表明突变体dsr1-1、dsr1-2对高浓度的甘露醇胁迫也表现出耐受性。
5、干旱胁迫下突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型植株的脯氨酸含量
为进一步阐明DSR1基因对盐及干旱产生的耐受性机制，测量了干旱胁迫下突变体等位系dsr1-1、dsr1-2与野生型植株的脯氨酸含量(图6A)及脯氨酸合成基因P5CS的表达(图6B)。在干旱胁迫下，突变体脯氨酸含量显著高于野生型，且脯氨酸合成基因P5CS的QRT-PCR结果也表明干旱胁迫下突变体中脯氨酸合成基因P5CS的表达量明显升高。表明，DSR1基因可能主要通过对渗透胁迫的调节来调控植株抗旱及耐盐性。
序列表
Claims (7)
1.一种植物抗旱与耐盐蛋白，其特征在于：氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No：2所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：SEQ ID No：2的氨基酸残基序列包括不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。
3.由权利要求1所述的植物抗旱与耐盐蛋白的编码基因，其特征在于：选自下列核苷酸下列之一：
(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：在高严谨条件下与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：与SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
6.由权利要求3所述的编码基因增强植物抗旱与耐盐的方法，其特征在于：是抑制植物中耐盐与抗旱相关蛋白编码基因的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：抑制植物中抗旱与耐盐相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者siRNA介导的基因沉默方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102156834A CN101955520A (zh) | 2010-06-30 | 2010-06-30 | 一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102156834A CN101955520A (zh) | 2010-06-30 | 2010-06-30 | 一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101955520A true CN101955520A (zh) | 2011-01-26 |
Family
ID=43483136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102156834A Pending CN101955520A (zh) | 2010-06-30 | 2010-06-30 | 一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101955520A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115704036A (zh) * | 2021-08-13 | 2023-02-17 | 湖南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草NtDSR1基因及其应用 |
-
2010
- 2010-06-30 CN CN2010102156834A patent/CN101955520A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115704036A (zh) * | 2021-08-13 | 2023-02-17 | 湖南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草NtDSR1基因及其应用 |
| CN115704036B (zh) * | 2021-08-13 | 2024-03-12 | 湖南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草NtDSR1基因及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhauso et al. | Overexpression of bacterial mtlD gene in peanut improves drought tolerance through accumulation of mannitol | |
| Costa et al. | Key genes involved in desiccation tolerance and dormancy across life forms | |
| CN102936605A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 | |
| US10961545B2 (en) | Drought resistance in plants: UPL4 | |
| CN101555276A (zh) | 一种植物耐镉蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN102234318B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白TaTPRPK1及其编码基因和应用 | |
| CN102648282A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 | |
| CN102766618B (zh) | 水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN108368515A (zh) | 耐旱玉米 | |
| Xiu et al. | Improvement and transcriptome analysis of root architecture by overexpression of Fraxinus pennsylvanica DREB2A transcription factor in Robinia pseudoacacia L.‘Idaho’ | |
| Ai et al. | Overexpression of miR1861h increases tolerance to salt stress in rice (Oryza sativa L.) | |
| Wu et al. | Responses of higher plants to abiotic stresses and agricultural sustainable development | |
| CN102603877B (zh) | 一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN103288944A (zh) | bHLH17蛋白及其编码基因和其应用 | |
| Hu et al. | Research and application of transgenic poplar in China | |
| CN103288943B (zh) | bHLH13蛋白及其编码基因和其应用 | |
| Zhang et al. | A CkDREB1 gene isolated from Caragana korshinskii Kom. enhances Arabidopsis drought and cold tolerance | |
| CN101724030A (zh) | 一种植物耐铅蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101508728A (zh) | 一种植物耐旱性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101955520A (zh) | 一种植物抗旱与耐盐蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN102796747A (zh) | 玉米干旱响应基因ZmDIP1及其编码蛋白的应用 | |
| CN103484472A (zh) | 水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码的蛋白质 | |
| CN103012570A (zh) | 植物抗逆性相关蛋白PpLEA3-21及其编码基因与应用 | |
| CN102051364B (zh) | 一种植物抗盐蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101602800A (zh) | 一种调节植物耐低磷胁迫的蛋白及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110126 |