CN101948825A - 一种细胞遗传转化的方法和装置 - Google Patents

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黄巍
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Abstract

一种细胞遗传转化的方法，利用超声波转化装置，并将该超声波转化装置定为如下参数：1)超声波发射频率为0.1-1000千赫；2)超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2；上述条件下，将待转化的生物大分子转化入微生物、微藻和动植物细胞中。本发明还提供了用于实现上述方法的超声波转化装置。本发明可以用于微生物的遗传转化；细胞间物质和能量的转移；生物反应器内核酸、蛋白质、多糖、药物的定时转化。

Description

一种细胞遗传转化的方法和装置
技术领域
本发明属于应用生物技术领域，具体涉及一种将DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子转化入难转化微生物、微藻和动植物细胞中的方法。
本发明还涉及实现上述方法的超声波转化装置。
背景技术
在生命科学和生物技术领域，目前广泛应用在微生物、动物和植物细胞中的遗传转化方法主要包括：化学转化、细胞融合、农杆菌侵染、基因枪和电穿孔转化。对于难以转化的细胞：比如微藻、革兰氏阳性高温嗜热细胞，即使借助电穿孔转化，往往也难以奏效。原因是：电穿孔转化过程需要在低浓度离子状态下进行，感受态细胞制备过程繁琐，而且对于厌氧菌需要专用的厌氧工作站。此外，电穿孔转化仪器和一次性使用的电击杯，使得该方法的使用在成本上一直居高不下。
低频超声波介导的转化方法是近几年才发现的、一种处于不断完善的新方法。该方法的原理是通过超声波在细胞膜表面瞬时产生微型囊泡，该囊泡在形成的同时可以裹入与之相邻的核酸、多糖等生物大分子。然后囊泡破裂并在细胞膜上形成一个纳米通道，其包裹的生物大分子通过纳米通道和细胞膜在自我修复的同时嵌入细胞内部，完成“摄入”或者转化过程。该方法最初主要用于真核细胞的转化和基因疗法。在原核生物中的报道始于2007年[Song，Y.，T.Hahn，I.P.Thompson，T.J.Mason，G.M.Preston，G.Li，L.Paniwnyk&W.E.Huang，(2007)Ultrasound-mediatedDNA transfer for bacteria.Nucleic Acids Res.35：e129.]。但是当时报道的超声波转化法仍然仅仅局限在革兰氏阴性菌或者中温菌中。主要包括大肠杆菌(Escherichia coli DH5a)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。上述报道的作者也发展了一种超声波转化方法，通过调整超声波的频率、功率和持续时间，可以将超声波技术应用到革兰氏阳性菌的转化中[宋厚辉、林璐、黄巍、徐健；一种超声波介导的微生物遗传转化方法及其应用，专利申请号：201010186403.1]。在研究中也发现不同的微生物、藻类和动植物细胞，虽然可以通过超声波方法实现转化，但是最佳转化条件各不相同。主要包括超声波装置的温度控制、频率控制、功率、时间控制，而全部实现这些功能的超声波仪器目前在国内外市场上尚无出售。此外，与电穿孔和基因枪相比，超声波仪器价格低廉且不需要特制的耗材，可以在初始培养基中直接进行转化操作，而且超声波技术本身在微生物、藻类和动植物细胞遗传转化方面的应用也越来越普遍，将来有望和电穿孔转化仪平分秋色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子转化入难转化微生物、微藻和动植物细胞中的方法。
本发明的又一目的在于提供一种实现上述方法的超声波转化装置。
为实现上述目的，本发明提供的细胞遗传转化的方法，利用超声波转化装置，并将该超声波转化装置定为如下参数：
1)外接电源为110-220伏特，50-60赫兹，0.5-20安培；
2)超声波发射频率为0.1-1000千赫；
3)超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2；
上述条件下，将待转化的生物大分子转化入微生物、微藻和动植物细胞中。
所述的方法中，待转化的生物大分子其分子量大于100道尔顿。
所述的方法中，待转化的生物大分子为：DNA、RNA、质粒、基因组、蛋白质、多糖、脂类、抗生素、纳米颗粒中的一种或多种。
本发明提供的实现上述方法的超声波转化装置，其主要包括有：
一内腔，内腔中放置有超声波介质；
一加热和制冷装置，用于控制内腔液体温度；
一液体压力循环泵，用于控制内腔液体的流动和传热；
一时钟控制装置，用于控制在任意时间内启动装置及超声波持续发射的时间
一远程控制装置，用于在任意时间内开启和停止超声波发射；
一超声波谐振装置，该装置位于内腔的底部或者四周；
所述超声波转化装置参数为：
外接电源为110-220伏特，50-60赫兹，0.5-20安培；
超声波发射频率为0.1-1000千赫；
超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2。
所述的超声波转化装置中，加热和制冷装置的温度控制范围是-20至200℃，精度为0.1-0.01℃。
所述的超声波转化装置中，液体压力循环泵的泵压为每分钟0-500升。
所述的超声波转化装置中，时钟控制装置的控制时间是0-999分钟，精度为0.1秒。
所述的超声波转化装置中，超声波装置含有一个置于控制面板上的可编可视化程序界面，以对温度、超声波发射频率、输出功率、时钟进行任意控制。
所述的超声波转化装置中，可编可视化程序界面为液晶显示屏。
本发明的优点在于实现了温度、频率、功率和时钟的同步控制，因此本发明可以保证在细胞膜上形成囊泡的同时，不破坏细胞膜和周围生物大分子的结构。既可以对单个细胞、单个反应器操作，也可以实现高通量，而且操作简单，随意控制，并可以实现远程遥控。
附图说明
图1是本发明提供的超声波转化装置的结构示意图。
附图中组件符号说明：
1、6超声波温度控制按钮；2、7超声波发射功率控制按钮；3、8超声波发射频率控制按钮；4、9超声波时钟控制按钮；5、10超声波主菜单和程序编辑按钮；11超声波控制面板；12循环泵；13、16超声波终止按钮；14加热和制冷装置；15、18超声波启动按钮；17液晶显示屏幕；19水栅；20超声波内腔；21电源；22箱体；23遥控感应器。
具体实施方式
本发明提供了用于各种常见生命体细胞(微生物、病毒、藻类和动植物细胞)的超声波转化装置的技术参数。能够实现这些关键参数的超声波转化装置可以将DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子转化入难转化微生物、微藻和动植物细胞中。
本发明可以用于各种微生物、病毒、藻类和动植物细胞的遗传转化及最佳转化条件的摸索。
本发明的超声波转化装置，是采用基于超声波声致穿孔的原理并设定了技术参数。超声波在微生物细胞膜表面形成的瞬时囊泡，将细胞外部的生物大分子(脱氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白、多糖等)裹入其中，然后通过细胞膜的自我修复功能，使膜上的囊泡连同内容物一起摄入细胞内部。本发明的装置最大的优点在于实现了温度、频率、功率和时钟的同步控制。因此本发明的装置可以保证在细胞膜上形成囊泡的同时，不破坏细胞膜和周围生物大分子的结构。既可以对单个细胞、单个反应器操作，也可以实现高通量，而且操作简单，随意控制，并可以实现远程遥控。
具体地说，本发明提供的超声波转化装置主要包括：
一内腔，内腔液体容积为0.1-100升；内腔内的液体为超声波介质；
一加热和制冷装置，用于控制内腔液体温度。温度控制范围是-20℃-200℃，精度为0.1-0.01℃；
一液体压力循环泵，用于控制内腔液体的流动和传热，泵压为每分钟0-500升；
一时钟控制装置，可以控制在任意时间内启动装置及超声波持续发射的时间；超声波持续时间控制范围是0-999分钟，精度为0.1秒；
一远程控制装置，用于在任意时间内开启和停止超声波发射；
一超声波谐振装置，该装置位于内腔的底部或者四周。
本发明的超声波装置的技术参数设为：
1)外接电源为110-220伏特，50-60赫兹，0.5-20安培；
2)超声波发射频率为0.1-1000千赫；
3)超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2。
使用本发明的超声波转化装置时，只需将待转化的微生物、病毒、藻类和动植物细胞和质粒DNA等生物大分子混合，放置在玻璃瓶或Eppendorf小管中，然后将小瓶或小管放置在充有去离子水的超声波仪器内腔中，启动机器，设置所需要的温度、超声波输出频率、输出功率、超声波持续时间，开始即可。也可以根据需要，通过装置的可视化程序界面，设置超声启动时间和各种参数。
与传统的超声波仪器相比，本发明中的超声波转化装置更精细、更完美，完全适合生命科学领域的研究需要。而传统的超声波仪器，是基于清洗功能而设计，频率和功率都是固定不变或者只有2-3个频率可选，无法连续可调，无法实现温度控制(或者仅能实现粗糙的加热控制)，在时间的控制上也无法随心所欲，更无远程遥控功能。传统的超声波仪器，更无基于液晶显示的可编和可视化程序界面，设计粗糙。
本发明所述的超声波转化装置，是为遗传转化而设计，频率、功率、时钟、温度精度更高。可以对分子量大于100道尔顿的生物大分子进行转化，如：DNA、RNA、质粒、基因组、蛋白质、多糖、脂类、抗生素、纳米颗粒中的一种或多种。对于生命体的应用范围更广，包括微生物、病毒、微藻、动物和植物细胞等。与电穿孔转化相比，本发明装置无需电击杯，真正实现了低成本、高通量，一次可以对几十、上百个生物样品进行转化。
此外，本发明中建立的超声波转化装置可以放大到大型生物反应器中基因的瞬时表达和调控、可以随意控制生物反应器中特定底物(DNA、RNA、多糖、蛋白以及特定化学药物等生物大分子)与细胞的接触、摄取和代谢时间。
下面结合附图1对本发明提供的超声波转化装置进行描述，该超声波转化装置主要包括：
控制面板11上设置有超声波启动按钮15和超声波终止按钮16，并设有超声波温度控制按钮6、超声波发射功率控制按钮7、超声波发射频率控制按钮8、超声波时钟控制按钮9，以对超声波转化装置的工作参数进行修改。为方便使用者根据自己的需要对超声波转化装置设定程序，控制面11上还设有超声波主菜单和程序编辑按钮10供使用者选择，比如：可以先让仪器制冷到4℃，待温度达到4℃自动启动超声波，持续后10秒后结束，然后维持4℃。所设定的任何参数都可以在控制面板11上的液晶显示屏幕17上显示。
超声波箱体22内部为超声波内腔20，内腔20的液体容积可以为0.1-100升。超声波箱体22内部设置有超声波发射和谐振装置(公知技术，图中未示)。在超声波箱体22的上方也设有可以对温度、发射功率、发射频率、时钟等参数进行设定的超声波温度控制按钮1、超声波发射功率控制按钮2、超声波发射频率控制按钮3、超声波时钟控制按钮4等按钮。与控制面板11相同，在超声波箱体22上也设有使用者自己对超声波转化装置设定程序的超声波主菜单和程序编辑按钮5。超声波箱体22上设置的对各参数进行设定的按钮和控制面板11上的按钮同步。按钮5可以切换到控制面板，进行程序编辑，与控制面板11上按钮10功能相同。
控制面板与超声波箱体通过USB或者COM通讯端口连接在一起，因此控制面板既可以独立于箱体之外，也可以直接放置在箱体的一侧。当控制面板与箱体正常连接在一起时，箱体上的按钮1、2、3、4、5、18、13与控制面板上对应的按钮6、7、8、9、10、15、16功能完全相同。当控制面板因种种原因(比如电压波动引起的主板故障)无法正常工作时，控制面板上的所有按钮也将停止工作，但不影响箱体上的按钮，此时可以通过控制超声波箱体上的按钮继续运行机器，只是运行参数无法在屏幕上显示，但可以通过箱体上的按钮对机器性能进行调试。在超声波转化仪正常使用过程中，客户仅需对控制面板上的按钮进行操作既可以实现该装置的全部功能；箱体上的按钮仅限在调试、故障排除或者强行启动和关闭某一特定功能时使用。因此，箱体上的超声波启动按钮18和超声波终止按钮13分别启动和终止超声波发射，与控制面板11上的超声波启动按钮15、超声波终止按钮16功能相同；
加热和制冷装置14可以对箱体内的液体进行温度控制，温控范围为：-20℃-200℃，精度为0.1-0.01℃。
循环泵12与加热和制冷装置14联动使用，通过水栅19将泵内液体泵入空腔内，实现温度的实时控制。
遥控装置23可以实现对超声波装置的远程控制。
本发明的超声波装置，可以对将分子量大于100道尔顿的生物大分子转化入微生物、细菌、病毒、微藻或动植物细胞中。其中，分子量大于100道尔顿的生物大分子为：DNA、RNA、质粒、基因组、蛋白质、多糖、脂类、抗生素、纳米颗粒中的一种或多种。
以下的转化方法可以使本领域技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明，该转化方法也可以参照本发明人申请的专利[宋厚辉、林璐、黄巍、徐健。一种超声波介导的微生物遗传转化方法及其应用。专利申请号：201010186403.1]。
实施例(以质粒DNA转化微生物细胞为例)
1)微生物培养
培养代转化的微生物菌液长至对数期，(不同种属微生物培养基配方不同，对于特定的微生物，需要选用相应的培养基，此为公知技术，不作详细介绍)。取1毫升微生物培养物于小青瓶中，也可以在小青瓶中直接培养。
2)向步骤1的小青瓶中加质粒DNA，质粒用量为5μg。
3)将含有5μg质粒和1毫升微生物培养物的小青瓶放入超声波仪器的空腔内，空腔内液体的液面略高于玻璃瓶内培养基的液面，但又不至于完全浸没玻璃瓶。如果小青瓶在超声波仪器内腔的液面上漂浮，可以用支架固定。
4)启动本发明提供的超声波仪器。对于不同的微生物，实现最佳转化的超声波参数不同。比如嗜热厌氧乙醇杆菌的最佳条件为：40千赫、19瓦特，超声波持续时间为20秒。
5)然后向含有质粒和微生物培养物的小青瓶中加入5mL新鲜的、适用于该微生物的液体培养基，复苏细胞。
6)将细胞涂布于适用于该特定微生物的固体平板上，进行筛选。平板是否添加抗生素，由质粒的特性和实验目的决定。

Claims (10)

1.一种细胞遗传转化的方法，利用超声波转化装置，并将该超声波转化装置定为如下参数：
1)超声波发射频率为0.1-1000千赫；
2)超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2；
上述条件下，将待转化的生物大分子转化入微生物、微藻和动植物细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，待转化的生物大分子其分子量大于100道尔顿。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，待转化的生物大分子为：DNA、RNA、质粒、基因组、蛋白质、多糖、脂类、抗生素、纳米颗粒中的一种或多种。
4.一种实现权利要求1所述方法的超声波转化装置，其主要包括有：
一内腔，内腔中放置有超声波介质；
一加热和制冷装置，用于控制内腔液体温度；
一液体压力循环泵，用于控制内腔液体的流动和传热；
一时钟控制装置，用于控制在任意时间内启动装置及超声波持续发射的时间
一远程控制装置，用于在任意时间内开启和停止超声波发射；
一超声波谐振装置，该装置位于内腔的底部或者四周；
所述超声波转化装置参数为：
超声波发射频率为0.1-1000千赫；
超声波输出功率为0.01-1000瓦特/cm2。
5.根据权利要求4所述的超声波转化装置，其中，超声波转化装置的外接电源为110-220伏特，50-60赫兹，0.5-20安培；
6.根据权利要求4所述的超声波转化装置，其中，加热和制冷装置的温度控制范围是-20至200℃，精度为0.1-0.01℃。
7.根据权利要求4所述的超声波转化装置，其中，液体压力循环泵的泵压为每分钟0-500升。
8.根据权利要求4所述的超声波转化装置，其中，时钟控制装置的控制时间是0-999分钟，精度为0.1秒。
9.根据权利要求4所述的超声波转化装置，其中，超声波装置含有一个置于控制面板上的可编可视化程序界面，以对温度、超声波发射频率、输出功率、时钟进行任意控制。
10.根据权利要求9所述的超声波转化装置，其中，可编可视化程序界面为液晶显示屏。
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